CC BY
45
Пономарева Т.И.1, Добряков Ю.И.2 ©
Старший научный сотрудник; 2ведущий научный сотрудник, 1,2 к.б.н., отдел биохимических технологий, Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН
г. Владивосток
ЗАЩИТНЫЙ ЭФФЕКТ ЭКСТРАКТОВ ИЗ АСЦИДИЙ ПРИ СТРЕССОРНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
Аннотация
В статье обобщены результаты экспериментального исследования биологической активности экстрактов из морских гидробионтов - асцидий при моделировании состояния острого стресса у животных (крысы Вистар). Показано, что исследуемые экстракты уменьшают отрицательные последствия стрессорного воздействия, защищая внутренние органы животных и оптимизируя гомеостатические реакции крови, обеспечивают адаптацию организма в целом к негативному действию стрессора. Стресс-протекторная активность экстрактов охарактеризована количественно, и по величине сравнима с активностью высокоэффективного стресс-корректора экстракт элеутерококка. Полученные результаты предполагают перспективность дальнейшего исследования данных экстрактов с целью создания на их основе лекарственных средств для мобилизации защитных сил организма.
Ключевые слова: асцидия, стресс-реакция, резистенция, адаптация.
Keywords: tunicate, stress-reactoin, resistention, adaptation.
Экстремальные условия обитания в последнее время становятся нормой нашей повседневной жизни. Все более широкие массы населения живут в условиях постоянной подверженности стрессовым воздействиям (физические, химические, антропогенные факторы, эмоциональные стрессы, снижение двигательной активности, ухудшение экологической обстановки), когда современный темп изменений, нарушая привычный стереотип, не предоставляет человеку времени для адаптации к новым условиям жизни. С целью предупреждения вредных последствий действия на организм различных стрессоров и повышения его адаптивных способностей применяют средства, получившие название «стресс-корректоры». Они неспецифически модулируют функции различных органов и систем организма, эффективны при использовании в комплексной терапии и профилактике ряда заболеваний. Многими исследователями показано, что подобными свойствами обладают гормоны, витамины, аминокислоты, природные и синтетические антиоксиданты, а также препараты на основе семейства аралиевых и др. [1, 120; 2, 96]. В последние годы внимание исследователей привлекают также физиологически активные соединения (ФАС) ресурсов мирового океана. Из некоторых представителей флоры и фауны моря выделены ФАС с антиатерогенными, сорбционными, иммуномодулирующими и другими эффектами [3,52; 4, 71; 5, 22], в числе прочих, определенная биологическая активность была выявлена и у нескольких видов асцидий [6, 83]. Вещества, отвечающие за биологическое действие извлечений из асцидии, сконцентрированы преимущественно в ее тунике. В частности, в состав туники асцидии Halochynthia aurantium наряду с макро- и микроэлементами, входят аминокислоты, фосфолипиды, а также нейтральные липиды, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, простагландины, каротиноиды [7, 151 ],
обеспечивающие широкий спектр биологической активности спиртового экстракта - хаурантина [8, 90; 9, 23; 10, 86; 11, 50]. Следует отметить, что по составу химических соединений разные виды асцидий отличаются несущественно.
В настоящей работе исследовали биологические эффекты экстракта из туники одиночной асцидии (ЭА) in vivo при моделировании острого стресса, препаратом сравнения служил хаурантин.
В экспериментах на крысах Вистар (40 особей, массой тела 180-200 г) исследована активность ЭА с учетом основных критериев оценки стресс-реакции, и проанализирована возможность коррекции изменений, возникающих в организме в ответ на стрессовое воздействие. Исследования с использованием экспериментальных животных проведены в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики» и «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005).
© Пономарева Т.И., Добряков Ю.И., 2013 г.
Состояние острого стресс моделировали, подвешивая животных на 22 часа за дорсальную складку. Экстракты стандартизовали по содержанию этанола и сухому остатку. Препараты деалкоголизировали, разводили дистиллированной водой и вводили через зонд дважды в желудок (перед подвешиванием и через 6 часов от его начала по 0,2 мл), одной группе (стресс) вводили растворитель в эквиобъеме. Животные были разделены на 5 групп по 8 особей в каждой: 1-я-контрольная (интактные животные) содержалась в обычных условиях вивария. Остальные крысы подвергались стрессированию: 2-я - стресс; 3-я - стресс + хаурантин 0,4 мл/кг (24 мг/кг в пересчете на сухой остаток); 4-я - стресс + ЭА 0,15 мл/кг (25 мг/кг); 5-я - стресс + ЭА 0,3 мл/кг (50 мг/кг) - дозы ЭА составляют 1/50 и 1/100 от ЛД50 соответственно.
По окончании воздействия животных декапитировали под легким эфирным наркозом, вскрывали и по изменениям стресс-компетентных органов (масса органа, изъязвления на слизистой оболочке желудка) определяли степень стрессированности. Для оценки выраженности ульцерогенного процесса рассчитывали индекс Паулса (ИП) [12, 38]. Изменение массы органов, выраженное в процентном отношении к норме, оценивалось по балльной системе [13, 172]. Уменьшение суммы на 2 и более баллов расценивалось, как стресс-протективный эффект, и позволяло рассчитать коэффициент активности (Кспа) экстракта. Определение гематологических показателей периферической крови осуществлялось общепринятыми методами с установлением количества лейкоцитов, абсолютного содержания элементов лейкограммы, ядерной формулы и индекса сегментации нейтрофилов [14, 543].
Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют, что избранное стресс-воздействие вызвало у животных типичную картину стресса. По сравнению с контрольной (интактной) группой у животных группы стресс на
Таблица 1.
Влияние ЭА на состояние внутренних органов крыс линии Вистар при стрессе (М ± т)
Показатели Контроль (интактные) 1 Стресс 2 ЭА 0,15мл/кг 3 ЭА 0,3 мл/кг 4 Хаурантин 0,4 мл/кг 5
Надпочечник+ % / балл 16,2 ± 1,5 100 / 0 26,9 ± 4,14* 165 / 5 20,35 ± 3,16** 125 / 2 22,2 ± 1,83** 137 / 3 21,6 ± 3,09** 133 / 3
Тимус+ % / балл 221, ± 38.2 100 / 0 160,0 ± 20,9* 72 / 3 169,4 ± 22,9 76 / 2 196,0 ± 30,8 89 / 1 176,8 ± 46,7 79 / 2
Селезенка+ % / балл 444,0 ± 51,6 100 / 0 242,0 ± 57,4* 54 / 4 276,0 ± 47,0 62 / 3 332,0 ± 88,8 74 / 2 301,4 ± 60,9 68 / 2
ИП % / балл 0 1,42* 75 / 3 0,32** 37 / 2 0,22** 37 / 2 0,23** 37 / 2
Оценка стресса баллы 0 15 9 8 9
Примечание. + - масса органа (мг) на 100 г массы животного; * - р<0,001 при сравнении - групп 1-2; ** - р<0,01 при сравнении групп 2-3; 2-4; 2-5.
65% увеличилась масса надпочечников, и снизились массы тимуса и селезенки (на 28 % и 46 % соответственно; все различия достоверны, р<0,001). Изъязвления на слизистой оболочке желудка обнаружены у 75% стрессированных крыс (2,2 ед./животное), ИП составил 1,42. Таким образом, по совокупности всех учтенных тестов общая балльная оценка стрессированности животных составила 15 баллов. При введении экспериментальным животным ЭА (группы 3 и 4) в период стресса наблюдалась коррекция нарушений, обусловленных стресс-воздействием: масса надпочечника была достоверно снижена по сравнению с группой стресс (на 17-25%, р<0,01), а численность животных с
изъязвлениями - в 2 раза меньше, при этом также уменьшилось количество язв на одно животное. Аналогичные результаты были получены в группе животных с препаратом сравнения - хаурантином. Разница в выраженности стресса между группой стресс и группами животных, получающих во время воздействия экстракты, составила 6 и 7 баллов - для ЭА 0,15 мл/кг и 0,3 мл/кг соответственно, и 6 баллов - для хаурантина. Уменьшение количества баллов у подопытных крыс под влиянием препаратов позволило рассчитать коэффициент стресс-протективной активности (Кспа), который составил для ЭА - 23 и 40 (0,15 мл/кг и 0,3 мл/кг соответственно) и 15 единиц для хаурантина.
Одним из ведущих элементов гомеостаза является кроветворная система, обеспечивающая саморегуляцию организма и его нормальную жизнедеятельность. Результаты исследования влияния ЭА на показатели периферической крови свидетельствуют что, стресс-воздействие вызвало выраженные изменения в лейкоцитарном профиле животных (рис.1). Значимо снизилось общее содержание лейкоцитов, лимфоцитов и моноцитов, при этом количество сегментоядерных нейтрофилов было увеличено в 2 раза (р < 0,01) с преобладанием полисегментных форм. Под влиянием ЭА (0,15 мл/кг) общее количество лейкоцитов было увеличено в 1,3 раза, достигая 83% от контрольных значений, а численность лимфоцитов в 1,4 раза (р < 0,01) превышала показатели группы стресс. Следует заметить, что количество моноцитов находилось в пределах физиологической нормы у этой группы животных, при существенно сниженной численности у крыс %
200
100
Рис. 1 Влияние ЭА на показатели периферической крови крыс Вистар при остром стрессе. а - лейкоциты; б - лимфоциты; в - нейтрофилы; г - моноциты; 1 - стресс; 2 - ЭА 0,15 мл/кг; 3- ЭА 0,3 мл/кг; 4 - хаурантин 0,4 мл/кг; * - различия достоверны (р < 0,01) при сравнении с группой стресс.
группы стресс (на 79%, р < 0,01). На численность нейтрофильных лейкоцитов ЭА не оказывал достоверного влияния, однако, отмечена тенденция к увеличению их двухсегментных форм (0,3 мл/кг).
Благодаря особой реактивности система крови играет основополагающую роль в резистентности, а ее изменения позволяют проанализировать наиболее тонкие механизмы адаптагенеза. Состояние стресса, которое сопровождает любое внешнее воздействие на организм, закономерно сопровождается изменениями лейкоцитарного распределения в системе крови [15, 151;
16, 63]. Нами выявлено положительное влияние ЭА (0,15 мл/кг) на состояние периферической крови животных: эффект заключался в препятствии стресс-индуцированному снижению общего количества лейкоцитов, лимфоцитов и моноцитов. Следует отметить, что моноциты крови представляют собой центральное звено мононуклеарной фагоцитарной системы и рассматриваются в настоящее время как важнейший элемент неспецифической резистентности организма. Также представляет интерес результат, что при довольно высоких уровнях сегментоядерных нейтрофилов в группах животных с ЭА, отмечена тенденция к увеличению двухсегментных форм, которые в функциональном отношении являются более полноценными. Эти данные могут свидетельствовать о снижении напряжения адаптационных механизмов в организме [15, 151; 17, 45].
Стресс-модулирующая активность препаратов характеризуется двумя свойствами -увеличением резистентности организма к действию повреждающих факторов и менее выраженной, чем в контроле, стимуляцией стрессорных механизмов [9, 23; 16, 63]. Этот вид биологической
активности описан в основном для лекарственных средств растительного происхождения [1, 120; 2, 96; 16, 63; 18, 1057]. Из природных соединений, содержащихся в морском биологическом сырье, антистрессорная активность обнаружена у некрахмальных полисахаридов и у асцидии пурпурной [8, 90; 19, 221]. Представленные результаты свидетельствуют о позитивном влиянии ЭА на организм при стрессе, которое проявляется, в частности, ослаблением ульцерогенного эффекта стресса, уменьшением гипертрофических проявлений надпочечников, предотвращением инволюции лимфоидных органов. Тимико-лимфатическая инволюция, наблюдаемая при стрессе, развивается вследствие действия эндогенных кортикоидов, при этом орган, гипоплазия которого при стрессе наиболее кортикоидзависима - тимус [15, 151; 17, 45]. Одним из ведущих патогенетических механизмов развития стресс-синдрома с повреждением внутренних органов является дестабилизация мембранных структур в результате гиперкатехоламинемии. Уменьшение изменений тимуса, а также селезенки и надпочечников на фоне препарата может наблюдаться, как за счет снижения реакции организма на стимуляцию кортикоидными гормонами, так и за счет уменьшения выделения кортикостероидов под его действием [17, 45]. Последнее предположение справедливо в отношении препарата сравнения - хаурантина: показано, что инъекции экстракта предупреждали повышение концентрации кортикостерона в крови экспериментальных животных [8, 90]. Показано также, что хаурантин эффективен при профилактическом применении в экспериментах, моделирующих патологические состояния печени, и его эффекты связаны с влиянием на метаболические процессы [9, 23].
Как было сказано выше, представленные результаты о состоянии надпочечников, тимико-лимфатического аппарата и периферической крови свидетельствуют о возможности коррекции ЭА негативных последствий стресса на организм. В настоящее время мы не располагаем достаточными данными для корректного объяснения механизма его стресс-модифицирующих эффектов. Одним из механизмов биологического эффекта исследуемого экстракта может быть способность активировать ряд ферментов антиоксидантной защиты в условиях нарушенных функций организма, как это показано для хаурантина [20, 101]. Возможны и другие механизмы действия, поскольку ЭА, также как и хаурантин, представляет собой сложную композицию природных веществ, биологические свойства которых могут дополнять друг друга. Таким образом, вопрос о механизме стресс-протективного действия ЭА остается открытым.
Представленные результаты позволяют рассматривать ЭА, как перспективный объект для последующего изучения с целью создания на его основе специфических профилактических средств для фармакологической коррекции компенсаторно-приспособительных реакций организма на воздействие стрессорных агентов.
Литература
1. Брехман И.И. Человек и биологически активные вещества / М.: Наука, 1980. - 120с.
2. Яременко К.В. Адаптогены, как средства профилактической медицины / Изд-во Том. унт-та. - Томск, 1990. - 96с.
3. Попов А.М. Биологическая активность и механизмы действия вторичных метаболитов из наземных растений и морских беспозвоночных: Автореф. дис. .. .д-ра биол. наук / Владивосток, 2003. - 52с.
4. Xue S., Zhang H.T., Wu P. Ch. Study of bioactivity of extracts from marine sponges in Chinese Sea // J. Exp. Marine Biol. Ecol. - 2004. - V. 298. - Р. 71-78.
5. Белоусов М.В., Новожеев Т.П. , Ахмеджанов Р.Р. Токсикологическое изучение кумазида // Эксперим. клин. фармакол. - 2010. - Т. 73, № 2. - С. 22-24.
6. Добряков Ю.И., Брехман И.И. Поиск природных источников физиологически активных веществ из морских организмов // Валеология: Диагностика, средства и практика обеспечения здоровья. -Владивосток: Дальнаука, 1996. - Вып. 3. - С. 83-90.
7. Кушнерова Н.Ф., Добряков Ю.И., Янькова В.И. Химический состав спиртовых извлечений из туники асцидии пурпурной Halocynthia aurantium // Валеология: Диагностика, средства и практика обеспечения здоровья. - Владивосток: Дальнаука, 2000. - Вып. 4. - С. 151-155.
8. Добряков Ю.И., Хасина Э.И., Спасов А.А. Стресс-протективное действие хаурантина // Валеология: Диагностика, средства и практика обеспечения здоровья. - Владивосток: Дальнаука, 1996. - Вып. 3. - С. 90100.
9. Добряков Е.Ю. Фармакологические эффекты экстракта из туники асцидии Halocynthia aurantium: Автореф. дис. .канд. мед. наук. - Владивосток, 2004. - 23с.
10. Пономарева Т.И., Добряков Ю. И. Коррекция хаурантином иммунных реакций при стрессорном воздействии // Нейроиммунология. - 2009. - Т. 7, № 3. - С. 86-87.
11. Пономарева Т.И., Добряков Ю.И., Добряков Е.Ю. Влияние экстракта из асцидии Halocynthia aurantium на кроветворные процессы в условиях миелосупрессии, вызванной цитостатиком // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2012. - №1. - С. 50-53.
12. Зуева В.П., Крылова С.Г., Турецкова В.Ф. и др. Экспериментальное изучение противоязвенных свойств экстракта коры осины // Эксперим. клин. фармакол. - 1997. - Т.6, № 4. - С.38-41.
13. Добряков Ю.И. Скрининговый метод оценки антистрессового действия препарата // Стресс и адаптация: Тез. Всесоюз. симпоз., 28-29 августа 1978 г. / Кишинев: Штниица, 1978. - С. 172.
14. Нормальное кроветворение и его регуляция / под ред. Н.А. Федорова. - М.: Медицина, 1996. - 543с.
15. Волчегорский И. А., Долгушин И. И., Колесников О. И., Цейликман В.Э. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма. / Челябинск: Изд-во ЧГПУ, 2000. -151с.
16. Нестерова Ю.В., Зеленская К.Л., Ветошнина Т.В. и др. Некоторые механизмы стресс-протекторного действия препаратов из Inula hetenium // Эксперим. клин. фармакол. - 2003. - Т. 66, № 4. - С. 63-65.
17. Ширинский И.В., Ширинский В.С., Козлов В.А. Влияние гормона эпифиза мелатонина на иммуносупрессию, вызванную глюкюкортикоидами in vitro. // Бюлл. эксперим. биол. - 2005. - Т. 68, №1. -С. 45-47.
18. Deyama T., Nishibe S., Nakazawa Y. Constituens and pharmacological effects of Eucommia and Sibirian ginseng // Acta Pharmacol. Sinica. - 2001. - Vol. 22, N 12. - P. 1057-1070.
19. Хасина Э.И., Требухов Е.Е., Золотухина О.Н. Влияние альгиновой кислоты из водоросли Laminaria cichorioides на физическую активность экспериментальных животных // Биология моря. - 2001. - Т. 27, №
3. - С. 221-224.
20. Долматова Л.С., Добряков Ю.И., Дардымов И.В. Влияние хаурантина на активность ферментов антиоксидантной системы при стрессе у крыс и в модельных экспериментах на нейтрофилах человека // Валеология: Диагностика, средства и практика обеспечения здоровья. - Владивосток: Дальнаука, 1996. -Вып. 3. - С. 101-105.
