CC BY
33
УДК 591
ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАЗВИТИЯ КЛЕТОЧНЫХ И ТКАНЕВЫХ НЕЙРОТРАНСПЛАНТАТОВ
К.К. Сухинич1, О.В. Подгорный2
(1кафедра эмбриологии биологического факультета МГУ;
2лаборатория экспериментальной нейробиологии Института биологии развития
им. Н.К. Кольцова РАН, г. Москва; e-mail: transpl@hotmail.com)
Проводился сравнительный анализ переживания и развития тканевых и суспензионных нейротрансплантатов. Было показано, что тканевые трансплантаты значительно увеличиваются в размерах по сравнению со суспензионными. Клетки тканевых и суспензионных трансплантатов способны дифференцироваться в нейроны и глию. Также был показан реципрок-ный рост отростков трансплантата и реципиента.
Ключевые слова: трансплантация, эмбриональная нервная ткань, GFP.
Проблема регенерации в ЦНС млекопитающих (и в особенности у человека) является одной из центральных в нейробиологии. Причиной тому служат тяжелые последствия при заболеваниях и травмах головного и спинного мозга. Неспособность поврежденных волокон нейронов к регенерации связывают с особенностями микроокружения в зрелой ЦНС [1, 2]. На сегодняшний день одним из многообещающих подходов, с помощью которого можно изменять среду микроокружения в зрелой ЦНС, является трансплантация незрелых клеток нервной системы. Были проведены исследования, демонстрирующие успешность этого подхода [3, 4]. Об этом свидетельствуют электрофизиологические и поведенческие тесты, показывающие, что трансплантаты специфически отвечают на сенсорную стимуляцию и восстанавливают когнитивные функции реципиента после повреждения [5]. Однако до сих пор остается неясным, какой материал (клеточные суспензии, полученные путем диссоциации тканей эмбрионального мозга, культивированные нейральные стволовые клетки или фрагменты эмбриональной нервной ткани) является наиболее подходящим для нейротрансплантации. Поэтому целью данного исследования было проведение сравнительного анализа приживления и развития клеточных и тканевых аллотрансплантатов эмбриональной нервной ткани мозга 14-дневных эмбрионов мышей, в клетках которых синтезируется белок ОБР.
Методы
Фрагмент либо клеточную суспензию неокор-текса 14-дневного эмбриона мыши линии С57БЬ/ 6-Те(АСТВ-ЕОРР)10ЪД (ОкаЬе ег а1., 1997) трансплантировали в стриатум взрослого животного по координатам: от брегмы +0,45 мм, латерально 2 мм,
2,5 мм в глубину. Для трансплантации фрагмента использовали стеклянную иглу. В случае трансплантации суспензии фрагмент неокортекса предварительно диссоциировали в растворе 0,1% трипсина, затем трансплантировали с помощью шприца Гамильтон.
Анализ приживления проводился через 7 и 30 сут после трансплантации. Для этого мозг фиксировали, извлекали и приготавливали срезы на микротоме с замораживающим столиком. Затем проводили иммуногистохимическое окрашивание антителами против GFAP, NeuN, PCNA, Tyrosine Hydroxylase.
Результаты и обсуждение
Через 7 и 30 сут у экспериментальных животных были обнаружены трансплантаты по флуоресценции GFP. Тканевые трансплантаты, в отличие от клеточных, как правило, имели четкие границы. На 30-е сут происходило заметное увеличение размеров тканевых трансплантатов, тогда как изменения размеров клеточных трансплантатов были менее выражены. Вероятно, это связано с потерей межклеточных контактов и гибелью клеток в процессе приготовления суспензии, что, возможно, повлекло нарушение микроокружения в трансплантате. Наблюдалась миграция единичных клеток из трансплантатов в стриатум и кору. Наиболее обширная миграция в обоих случаях трансплантаций была обнаружена вдоль нервных волокон мозолистого тела (рис. 1). Вокруг клеточных и тканевых трансплантатов выявлялась глиальная реакция, снижающаяся на 30-е сут, что было обнаружено при окраске антителами на GFAP (маркер клеток астроглии) (рис. 2). Однако вокруг клеточного трансплантата глиальная реакция была выражена слабее, что, вероятно, связано с меньшим повреждением. Анализ пролифератив-ной активности с использованием антител против
Рис. 1. Миграция вдоль волокон мозолистого тела. А: Миграция вдоль волокон мозолистого тела на 30-е сутки (тканевый трансплантат). Стрелками обозначены клетки. Б: Миграция вдоль волокон мозолистого тела на 30-е сутки (клеточный трансплантат). Стрелками обозначены отростки клеток. Мозолистое тело (СС) выделено линиями
Рис. 2. Глиальная реакция вокруг тканевого трансплантата на 30-е сутки. А: GFP. Б: Окраска антителами против GFAP
РСМЛ показал, что на 30-е сут деление полностью останавливается. Мы полагаем, что трансплантат повторяет (с задержкой) развитие нормального мозга, при котором к моменту рождения останавливается пролиферация. На 30-е сут после трансплантации быши обнаружены дифференцированные нейроны по окраске антителами против белка, который синтезируется в зрелых нейронах (рис. 3). По окраске антителами против ОБЛР было обнаружено, что клетки дифференцируются в астроглиаль-ном направлении как на 7-е, так и на 30-е сут в обоих случаях. Кроме того, окраска антителами против ОБЛР позволила обнаружить миграцию аст-роцитов хозяина внутрь тканевого трансплантата, причем зачастую миграция происходила вдоль сосудов донора. Глиальная дифференцировка клеток трансплантатов наблюдалась как на 7-е, так и на 30-е сутки после операции в обоих случаях (рис. 4). Использование антител против тиро-зингидроксилазы (ТН), которые выявляют в стриатуме отростки дофамин-
Рис. 3. Клетки тканевого трансплантата дифференцируются в нейроны на 30-е сут после трансплантации. А — ОРР. Б: Окраска антителами против №и1Ч. Тр — трансплантат. В: Наложение микрофотографий А и Б
Рис. 4. Клетки трансплантата дифференцируются в астроциты (отмечены стрелками). Аст-роциты реципиента проникают в тканевый трансплантат (отмечены звездочками). Острие стрелки указывает на сосуд. 30 суток после трансплантации А: GFP. Б: Окраска антителами против GFAP. В: Наложение микрофотографий А и Б
Рис. 5. Нервные волокна дофаминергических нейронов реципиента врастают в тканевый трансплантат на 30-е сутки. А: ОБР. Б: Окраска антителами против тирозингидроксила-зы (ТН). В: Наложение микрофотографий А и Б. Тр — трансплантат
ергических нейронов черной субстанции, позволило обнаружить врастание волокон хозяина в ткань трансплантата (рис. 5).
Таким образом, как тканевые, так и клеточные трансплантаты способны переживать не менее 30 сут без отторжения, при этом клетки в них дифференцируются в нейроны и глию. Однако ткане-
вые трансплантаты демонстрируют большую способность к росту. Глиальная реакция, вызванная процедурой трансплантации и первичной реакцией ткани мозга реципиента на трансплантат, снижается к 30-м сут. Имплантированная эмбриональная нервная ткань стимулирует волокна нейронов реципиента врастать внутрь трансплантата.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Maisonpierre P.C., Belluscio L., Friedman B., Alder-son R.F., Wiegand S.J., Furth M.E, Lindsay R.M., Yanco-poulos G.D. NT-3, BDNF, and NGF in the developing rat nervous system: parallel as well as reciprocal patterns of expression // Neuron. 1990. Vol. 5(4). P. 501-509.
2. Franklin R.J.M., Blakemore W.F. The peripheral nervous system - central nervous system regeneration dichotomy: a role for glial cell transplantation // J. Cell Science, 1990. Vol. 95. P. 185-190.
3. Das G D, Hallas B H, Das K.G. Transplantation of brain tissue in the brain of rat. I. Growth characteristics of
neocortical transplants from embryos of different ages // Am. J. Anat. 1980. Vol. 158(2). P. 135-145.
4. Magavi S.S., Lois C. Transplanted neurons form both normal and ectopic projections in the adult brain // Dev. Ne-urobiol. 2008.Vol. 68(14). P. 1527-37.
5. Girman., S. V., Golovina I.L. Electrophysiological study of afferent connections of embryonic neocortex allotrans-plants grafted into progection areas of the adult rat cortex // Neirofiziologiia. 1988. Vol. 20. N 4. P. 47-56.
Поступила в редакцию 28.05.10
PATTERNS OF DEVELOPMENT OF SUSPENSION AND TISSUE NEURAL TRANSPLANTS
K.K. Sukhinich, O. V. Podgorny
Frontal cortex tissue obtained from green fluorescent protein (GFP) transgenic mice embryos was transplanted into the striatum of adults. In the present experiments, we have compared survival of solid neural grafts with grafts of neuronal cell suspensions. Histological evaluation showed that tissue transplants size increased distinctly compared to cell transplants. Axonal outgrowth from both graft types and host was detected. Also transplanted cells were capable to differentiate into neurons and glial cells.
Key words: transplantation, embryonic neural tissue, GFP.
Сведения об авторах
Сухинич Кирилл Константинович — студент, кафедра эмбриологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. E-mail: transpl@hotmail.com
Подгорный Олег Владимирович — ст. науч. сотр. лаборатории экспериментальной нейробиологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. E-mail: olegpodgor-ny@inbox.ru
