CC BY
20
DOI 10.31588/2413-4201-1883-239-3-51-56
УДК 57,023:57,085.2
ВЗАИМОСВЯЗЬ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И ТКАНЯХ БЕЛЫХ БЕСПОРОДНЫХ КРЫС
Борискин П.В. - к.м.н., науч. сотр., *Гуленко О.Н. - к.б.н., доцент, Девяткин А.А. -д.м.н., науч. сотр., **Каримова Р.Г. - д.б.н., профессор, Павлова О.Н. - д.б.н., доцент, Тороповский А.Н. - к.м.н.
ООО «ТестГен» *ЧУОО ВО «Медицинский университет «Реавиз» **ФГБОУ ВО «Казанская государственной академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»
Ключевые слова: глутатионпероксидаза, перекисное окисление липидов, сыворотка крови, печень, головной мозг, сердце, скелетные мышцы
Keywords: glutathione peroxidase, lipid peroxidation, serum, liver, brain, heart, skeletal
muscle
Совокупность разнообразных факторов, сопровождающих процессы жизнедеятельности, от неблагоприятной экологической обстановки до депрессивных эмоциональных состояний, приводят к формированию патологических изменений в организме, которым сопутствуют повышенное образование свободных радикалов. Накопление активных агентов, приводящих к повреждениям клетки называют ок-сидативным стрессом и в основе лежит пе-рикисное окисление липидов (ПОЛ) [1]. ПОЛ негативно действует на клеточные мембраны, нарушает целостность клетки и соответственно ведет к дегенеративным процессам. В большом количестве накапливаются гидроперекиси липидов, диеновые конъюгаты, шиффовы основания, малоновый диальдегид вызывающие нарушение метаболизма на всех уровнях. Регу-
лирует свободно-радикальные процессы в организме антиоксидантная система, представленная комплексом защитных механизмов [2].
Одним из важнейших элементов ферментативного звена антиоксидантной защиты организма является глутатион-пе-роксидаза (ГП), способная катализировать реакцию детоксикации пероксидов без образования свободных радикалов, используя в качестве донора водорода восстановленный глутатион - у-глутамилцистеи-нилглицина (GSH), а также синтезирующий и восстанавливающий низкомолекулярные тиолы [3].
При этом сульфгидрильная группа GSH окисляется до дисульфидной формы, отдавая электроны пероксиду водорода или гидропероксиду липида:
2 Н2О2 + GSH ^ 2 Н2О + G-S-S-G.
Окисленный глутатион восстанавливается под действием глутатионредуктазы: G-S-S-G + NADPH + H+ ^ 2 GSH + NADP+.
Для теплокровных животных характерно наличие нескольких форм глутати-онпероксидаз, в зависимости от органа или ткани обнаружения. Чаще всего этот фермент является гомотетрамером, включающим в себя селеноцистеин, необходимый для протекания ферментативной реакции. По данным некоторых исследований считают, что селенозависимая ГП отсутствует
у растений, бактерий, простейших насекомых, но функционирует у всех видов рыб, червей, млекопитающих. Это эволюционно молодой фермент, приобретение которого стало важным преимуществом для позвоночных и, возможно, привело к превращению селена из обычного элемента в биоэлемент. Дефицит селена в организме вызывает увеличение активных форм кисло-
рода в клетках, а, следовательно, влечет за собой ослабление иммунной системы, развитие заболеваний, связанных с многочисленными изменениями в структуре и функциях биополимеров (белков, нуклеиновых кислот и липидов). Динамика образования ГП позволяет делать выводы о механизме компенсации дезадаптационных сдвигов, об особенностях метаболизма при регуляции процессов свободнорадикаль-ного окисления и прогнозировать развитие и динамику патологических состояний у теплокровных организмов [4]. Так, согласно имеющимся данным, активность глутатионпероксидазы уже на ранних стадиях сосудистой патологии головного мозга уменьшена почти вдвое по сравнению со здоровыми и имеет тенденцию к дальнейшему уменьшению по мере про-грессирования заболевания [5]. Таким образом, цель нашего исследования состояла в изучении взаимосвязей распределения активности глутатионпероксидазы в сыворотке крови и тканях белых беспородных крыс.
Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи: определить активность глутатионперокси-дазы в сыворотке крови и тканях печени, мозга, сердца, а также в скелетных мышечных тканях крыс; выявить взаимосвязи распределения активности ГП в сыворотке крови и тканях крыс.
Материал и методы исследований. Исследование проводили на белых
Еконт - Еопят • 2147= мкМ/мин/мг белка
Коэффициент вариации метода равен 1,8%.
Активность глутатионпероксидазы изучали в тканях печени, сердца, мозга и в скелетной мышечной ткани крыс, а также в сыворотке крови. Для этого крыс убивали в соответствии с этическими нормами под эфирным наркозом методом декапита-ции, затем проводили извлечение необходимых тканей, которые (кроме сыворотки крови) промывали физиологическим раствором и сразу замораживали. Гомогенаты готовили механическим измельчением тканей массой 1 г с 9 мл трис-буфера (рН
беспородных половозрелых здоровых крысах-самцах одного месяца рождения, массой 170-190 г в количестве 150 штук, которые содержались в виварии в стандартных условиях.
Определение активности глутатионпероксидазы осуществляли по методу В.М. Мойн [6]. 100 мкл гомогената ткани (сыворотки крови) преинкубировали с 830 мкл 0,1 М трис - HCl буфера (рН 8,3), содержащего 6 Мм ЭДТА и 12 Мм азида натрия, в течение 10 минут при температуре 37и С, затем добавляли 70 мкл 20 Мм раствора гидроперекиси третичного бутила (свежеприготовленного, разведением исходного реактива в 500 раз) и инкубировали 5 минут. Затем реакцию останавливали добавление 200 мкл холодной три-хлоруксусной кислоты (ТХУ), осажденные белки удаляли центрифугированием. 100 мкл супернатанта вносили в 10 мл трис-HCl буфера и добавляли 100 мкл реактива Элмана (0,01 М раствор дитионитробен-зойной кислоты в метаноле). Через 5 минут пробы фотометрировали при длине волны 412 нм. Контрольная проба отличалась тем, что гомогенат в среду вносили непосредственно перед осаждением белков. С учетом разведения биологического материала в данном методе коэффициент молярной экстинкции ТНФА при длине волны 412 нм составляет 11400. Активность глутатионпероксидазы рассчитывают в микромолях израсходованного в реакции субстрата по формуле 9:
печени (9)
7,4), со скоростью 5000 об/мин в сосуде с двойными стенками, постоянно охлаждаемым проточной водой [7]. Цифровой материал подвергали статистической обработке путем непараметрического корреляционного анализа по Спирмену, а также с использованием коэффициентов гамма корреляции и Кенделла Тау.
Результаты исследований. В результате экспериментов был получен массив числовых данных активности глутати-онпероксидазы в сыворотке крови и тканях крыс. Полученные результаты подвергали статистической обработке (табл.1). На
первом этапе проведения статистического анализа проводили проверку на соответствие нормальному распределению активности ГП в сыворотке крови и тканях крыс. Для этого использовался одновыборочный критерий Колмогорова - Смирнова. В ре-
зультате было установлено, что распределение активности ГП в сыворотке крови и тканях не соответствует нормальному. В связи с тем при дальнейшей статистической обработке нами были применены непараметрические методы анализа.
Таблица 1 - Распределение значений активности глутатиопероксидазы в сыворотке
крови и тканях белых беспородных крыс
Описательная
статистика объединённы N М Ме Мт Мах 25 Регс 75 Регс 10 Регс 90 Регс
х групп
сыворотка 15 123,5 123,50 122,10 125,10 123,10 124,20 122,60 124,7
крови 0 0
печень 15 0 1316,4 8 1316,5 0 1314,6 0 1318,2 0 1315,6 0 1317,2 0 1315,2 0 1317, 50
головной мозг 15 0 126,10 126,15 124,80 127,90 125,40 126,70 125,20 127,0 0
сердце 15 0 272,04 271,90 270,70 273,80 271,50 272,60 271,25 273,1 0
скелетные 15 143,30 143,40 141,70 145,20 142,70 143,80 142,20 144,3
мышцы 0 5
Для оценки взаимосвязи распределения активности ГП в сыворотке крови и тканях малых экспериментальных животных проводили исследование корреляций внутри группы наблюдения по непа
раметрическому коэффициенту коре-ляции Спирмена (табл. 2), а также с использованием коэффициентов гамма корреляции (табл.3) и Кенделла Тау (табл.4).
Таблица 2 - Коэффициент корреляции Спирмена по распределению активности ГП в сыворотке крови и тканям крыс и значение р_
Корреляция по Спирмену во всех объединённых измерениях УаНё N Бреагшап Я р-1еуе1
сыворотка крови & печень 150 0,166924 0,041188
сыворотка крови & мозг 150 0,020437 0,803957
сыворотка крови & сердце 150 0,177898 0,029408
сыворотка крови & мышцы 150 0,074324 0,366039
По данным, представленным в таблице 2, прослеживается достоверно наличие слабой силы прямой корреля-ционной связи между активностью ГП в сыворотке крови и тканях печени (0,17 при р < 0,041188) и сыворотке крови и тканях сердца (0,18 при р < 0,029408). Так как ни-
каких других взаимосвязей между активностью глутатиопероксидазы в сыворотке крови и тканях крыс с помощью коэффициента корреляции Спирмена выявлено не было, решено было провести анализ с использованием критериев гамма корреляции (табл.3) и Кенделла Тау (табл.4).
Таблица 4 - Коэффициент Кенделла Тау корреляции по распределению активности ГП в сыворотке крови и тканям крыс
Таблица 3 - Коэффициент гамма корреляции по распределению активности ГП в сы-
воротке крови и тканям крыс
MD pairwise deleted Mar ced correlations are signi ficant at p <,05000
Valid N Gamma Z p-level
сыворотка крови & печень 150 0,129765 2,228047 0,025877
сыворотка крови & мозг 150 0,014160 0,243504 0,807615
сыворотка крови & сердце 150 0,136009 2,351434 0,018701
сыворотка крови & мышцы 150 0,055708 0,966356 0,333866
MD pairwise deleted Marked correlations are signi: leant at p <,05000
Valid N Kendall Tau Z p-level
сыворотка крови & печень 150 0,122696 2,228047 0,025877
сыворотка крови & мозг 150 0,013409 0,243504 0,807615
сыворотка крови & сердце 150 0,129490 2,351434 0,018701
сыворотка крови & мышцы 150 0,053216 0,966356 0,333866
По данным, представленным в таблицах 3 и 4 видно, что при изучении распределения активности ГП в сыворотке крови и тканях крыс выявлены прямые достоверные корреляционные связи слабой силы между активностью глутатион-пе-роксидазы в сыворотке крови и тканях печени, а также в сыворотке крови и тканях сердца белых беспородных крыс.
Заключение. Таким образом, все три примененные способа непараметрического корреляционного анализа для оценки взаимосвязи распределения активности глутатионпероксидазы в сыворотке крови и тканях крыс выявили, что при активности ГП в организме животных в пределах физиологической нормы достоверно определяется слабая прямая корреляционная связь между активностью ГП в сыворотке крови и тканях печени, а также в сыворотке крови и тканях сердца.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Венгеровский, А.И. Методические указания по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ / А.И. Венгеровский, И.В. Марков, А.С. Са-ратиков; под ред. В.П. Фисененко // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению любых фармакологических веществ. - 2000. - С. 228-231.
2. Донченко, Г.В. Активность ферментов антиоксидантной защиты организма и
изменения липидного состава микросом при действии витамина Е и его производных / Г.В. Донченко и др. // Биоантиокси-дант: тезисы докл. VI конф. - 2002. - С. 167-169.
3. Павлова, О.Н. Природа оксидатив-ного стресса и способы его коррекции / О.Н. Павлова, С.А. Симакова // Материалы IV Всероссийской конференции с международным участием: «Медико-физиологические проблемы экологии человека», 2630 сентября 2011 г. - Ульяновск. - 2011. -С.244-246.
4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общ. ред. Р.У. Хабриева.- 2-изд., перераб. и доп.- М.: Медицина, 2005.- 832 с.
5. Шульгин, К.К. Получение и свойства глутатионпероксидазы / К.К. Шульгин, Т.Н. Попова, Т.И. Рахманова // Прикладная биохимия и микробиология. -2008. - Т. 44. - № 3. - С. 276-280.
6. Яворская, В.А. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов и активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах при начальных формах сосудистых заболеваний головного мозга / В.А. Яворская, В.А. Малахов, А.М. Белоус // Неврологический вестник. — 1995. — Т. XXVII. - Вып. 3-4. — С. 15-17
ВЗАИМОСВЯЗЬ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И ТКАНЯХ БЕЛЫХ БЕСПОРОДНЫХ КРЫС
Борискин П.В., Гуленко О.Н., Девяткин А.А., Каримова Р.Г., Павлова О.Н., Тороповский А.Н.
Резюме
Некомпенсированное образование активных форм кислорода или окислительный стресс приводит к ряду патологических состояний. Противостоит свободнорадикальному окислению биосубстратов антиоксидантная защита организма, центральным звеном которой является глутатионредуктазная/глутатионпероксидазная система, обеспечивая детоксикацию пероксидов, сохраняя тем самым целостность клеточных мембран. Антиоксидантный эффект глутатиопероксидазы (ГП) в цепи свободнорадикального окисления липидов и белков, инициируемый активными формами кислорода, заключается в следующем: селенсодержа-щая ГП предотвращает продолжение процесса свободно-радикального окисления, во-первых, обезвреживая уже образовавшиеся гидроперекиси жирных кислот, во-вторых, предупреждает их образование, расщепляя перекись водорода, которая реагируя с супероксидным анион-радикалом, генерирует радикал гидроксила, чрезвычайно активно окисляющий органические молекулы всех типов. Динамика образования ГП позволяет делать выводы о механизме компенсации дезадаптационных сдвигов, об особенностях метаболизма при регуляции процессов свободнорадикального окисления и прогнозировать развитие и динамику патологических состояний у теплокровных организмов. При достижении цели исследования - изучении взаимосвязей распределения активности глутатионпероксидазы в сыворотке крови и тканях крыс, были решены следующие задачи: определена активность глутатиоперокси-дазы в сыворотке крови и тканях печени, мозга, сердца, а также в скелетных мышечных тканях крыс; выявлена взаимосвязь распределения активность глутатиопероксидазы в сыворотке крови и тканях крыс. В статье представлены результаты непараметрического корреляционного анализа для оценки взаимосвязи распределения активности глутатиопероксидазы в сыворотке крови и тканях белых беспородных крыс.
INTERRELATION OF THE DISTRIBUTION OF THE ACTIVITY OF GLUTATHIONPEROXIDASE IN THE SERUM OF BLOOD AND TISSUES OF WHITE
IMPEDIQUE RATS
Boriskin P.V., Gulenko O.N., Devyatkin A.A., Karimova R.G., Pavlova O.N., Toropovsky A.N.
Summary
Uncompensated formation of reactive oxygen species or oxidative stress leads to a number of pathological conditions. The antioxidant defense of the body, which is central to the glutathione reductase / glutathione peroxidase system, counteracts the free radical oxidation of biosubstrates, ensuring the detoxification of peroxides, thereby preserving the integrity of cell membranes. The antioxidant effect of glutathione peroxidase (HG) in the chain of free radical oxidation of lipids and proteins, initiated by reactive oxygen species, is as follows: the selenium-containing HM prevents the continuation of the free radical oxidation process, first of all, neutralizing the fatty acid hydroperoxides that have already formed, and second, prevents them formation, splitting hydrogen peroxide, which reacts with a superoxide anion radical, generates a hydroxyl radical that is extremely actively oxidizing organic molecules seh types. The dynamics of the formation of HP allows to draw conclusions about the mechanism of compensation of maladaptation shifts, about the features of metabolism in the regulation of free radical oxidation processes and to predict the development and dynamics of pathological states in warm-blooded organisms. When the goal of the study was achieved, the relationship between the distribution of glutathione peroxidase activity in rat blood serum and tissues was solved, the following tasks were solved: the activity of glutathioperoxidase in
blood serum and tissues of the liver, brain, heart, and rat skeletal muscle tissue was determined; The interrelation of the distribution of the activity of glutathio peroxidase in the serum and tissues of rats was revealed.The article presents the results of a non-parametric correlation analysis for assessing the relationship between the distribution of the activity of glutathioperoxidase in blood serum and tissues of white outbred rats.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-239-3-56-61 УДК 591.1:616.12-07
ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЙ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИСЕРДЦА И МЕХАНИЗМОВ ЕЕ РЕГУЛЯЦИИ У МЕЛКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ АДАПТАЦИИ К МЫШЕЧНЫМ ТРЕНИРОВКАМ
Вахитов И.Х. - д.б.н., профессор, Волков А.Х. - д.в.н., профессор, Чинкин С.С. - к.б.н., доцент, Вахитов Л.И. - аспирант, *Ибатуллин И.Р. - ст. препод.
ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» * Казанский инновационный университет им В.Г. Тимерясова
Ключевые слова: мышечные тренировки, крысы, ударный объём крови, частота сердечных сокращений, насосная функция сердца
Keywords: muscle training, rats, stroke volume, heart rate, pumping function of the heart
Изучению закономерностей влияя-ния различных режимов двигательной активности на функции сердца и механизмы его регуляции в постнатальном онтогенезе посвящены исследования ряда авторов [1,4,5,7,8]. Однако, значительное число работ выполнено по изучению особенностей хронотропной функции сердца, тогда как, изменения ударного объема крови у неполовозрелых животных изучены не достаточно.
В лаборатории КФУ ряд исследователей проводили эксперименты, по изучению ударного объема крови и механизмов его регуляции у неполовозрелых животных, подверженных различным режимам двигательной активности [2,3,9,10,11,12]. При этом, большинство исследователей систематические мышечные тренировки крысят начинали с 21 -дневного возраста. Вместе с тем, особенности изменений показателей насосной функции сердца и механизмы его регуляции у неполовозрелых животных подверженных мышечным тренировкам на более ранних этапах постнатального развития остаются не достаточно изученными. В этой связи нами были впервые проведены исследования по изучению показателей насосной функции сердца и механизмов ее
регуляции у крысят, подверженных мышечным тренировкам с 14-дневного возраста.
Материал и методы исследований. В экспериментах использовали белых беспородных лабораторных крысят, которые были условно разделены на две подгруппы.
Животных первой экспериментальной группы, начиная с 14-дневного возраста и до 70-дней жизни, подвергли принудительным мышечным тренировкам - плаванием (ПДА). Крысят второй экспериментальной группы, с 14 до 70-дневного возраста, содержали в обычных условиях вивария по 6-8 животных (свободная двигательная активность - СДА). Показатели насосной функции сердца регистрировали в 14, 42 и 70-дневных возрастах. Для определения ударного объема крови использовали метод тетраполярной грудной рео-графии [13]. Дифференцированную рео-грамму регистрировали с помощью прибора РПГ-204 у наркотизированных крыс этами-налом натрия (40 мг/кг) при естественном дыхании. Для изучения симпатических влияний на насосную функцию сердца крыс в яремную вену через катетер вводили 0,1 % раствор обзидана в дозе 0,8 мл/100 г, и прозазин в концентрации
