CC BY
9
DOI: 10.23868/202112007
ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ КОЛИЧЕСТВОМ МИЕЛОИДНЫХ СУПРЕССОРНЫХ КЛЕТОК И КЛИНИКОЛАБОРАТОРНЫМИ ПАРАМЕТРАМИ У БОЛЬНЫХ ЦИРРОЗОМ ПЕЧЕНИ
О.Ю. Леплина, М.А. Тихонова, Т.В. Тыринова, И.В. Меледина, О.И. Желтова, А.А. Останин, Е.Р. Черных
Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии, Новосибирск, Россия
Поступила: 27.10.2021 Принята к печати: 02.122021 Опбликована on-line: 30.12.2021
THE RELATIONSHIP BETWEEN MYELOID-DERIVED SUPRESSOR CELLS AND CLINICO-LABORATORY PARAMETERS IN PATIENTS WITH LIVER CYRROSIS
O.Yu. Leplina, M.A. Tikhonova, T.V. Tyrinova, I.V. Meledina, O.I. Zheltova, A.A. Ostanin, E.R. Chernykh
Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology», Novosibirsk, Russia
e-mail: oleplina@mail.ru
Миелоидные супрессорные клетки играют важную роль в регуляции воспаления и фиброза, однако изменения в этой популяции и связь между содержанием миелоидных супрессо-ров и клинико-лабораторными особенностями цирроза печени, а также ответом на терапию остаются, во многом, неизученными.
Цель работы: исследование субпопуляций миелоидных су-прессорных клеток у больных циррозом печени, анализ взаимосвязи их содержания с тяжестью заболевания, а также оценка их прогностической значимости в качестве потенциальных предикторов ответа на комплексную терапию, включающую трансплантацию аутогенных клеток костного мозга. С помощью многоцветной проточной цитометрии определяли содержание различных субпопуляций миелоидных супрессоров (LirrHLA-DR-CD33+-, Lin-HLA-DR-CD33+CD66b+- и CD14+HLA-DRtow/--клеток) в периферической крови у 51 пациента: 33 пациентов с вирусным циррозом печени, 18 пациентов с «невирусным» (алкогольным или билиарным и аутоиммунным) циррозом печени.
Пациенты обеих групп характеризовались повышенным содержанием Lir-HLA-DR-CD33+-, Lin-HLA-DR-CD33+CD66b+-и CD14+HLA-DRlow/-- клеток, уровень которых при вирусном циррозе печени не зависел от типа и репликации вируса. При вирусном циррозе печени доля Lir-HLA-DR-CD33+-клеток прямо коррелировала с уровнем альбумина (Rs=0,45; р=0,029). При циррозе «невирусной» этиологии между этими показателями выявлялась обратная зависимость (Rs=-0,56; р=0,02), а содержание Lir-HLA-DR-CD33+- и CD14+HLA-DRlow/--клеток прямо коррелировало с баллом тяжести заболевания по шкалам Child-Pugh и MELD. Сопоставление исходного содержания мие-лоидных супрессоров с ответом на комплексную терапию, включающую трансплантацию аутогенных костномозговых клеток, показало, что количество Lir-HLA-DR-CD33+-клеток при вирусном циррозе печени имело прогностическую значимость и при значениях меньше 1,9% позволяло прогнозировать снижение балла по шкале Child-Pugh в течение 12 месячного наблюдения с чувствительностью 83,3% и специфичностью 71,4%.
Полученные данные свидетельствуют о сопряженности количества миелоидных супрессоров с уровнем альбумина, тяжестью заболевания и ответом на терапию, что позволяет рассматривать эти клетки в качестве новой терапевтической мишени при циррозе печени.
Ключевые слова: миелоидные супрессорные клетки, цирроз печени, тяжесть заболевания, прогноз, ROC-анализ.
Although myeloid-derived suppressor cells play a major role in inflammation and fibrosis, changes in this population and relationship between myeloid suppressors and clinico-laboratory features of liver cirrhosis as well as response to therapy, remain largely unexplored.
In the present study, we used multicolor flow cytometry assay to measure the numbers of various myeloid suppressor cell subpopulations (Lin-HLA-DR-CD33+, Lin-HLA-DR-CD33+CD66b+, and CD14+HLA-DRlow/-) in peripheral blood of 51 participants, including 33 patients with viral- and 18 patients with «nonviral» (alcoholic or biliary/autoimmune) liver cirrhosis.
Patients in both groups had increased proportions of Lin-HLA-DR-CD33+, Lin-HLA-DR-CD33+CD66b+, and CD14+HLA-DRlow/-cells which levels did not depend on the type and replication of the virus in viral liver cirrhosis. In viral liver cirrhosis, the relative numbers of Lin-HLA-DR-CD33+cells directly correlated with the albumin levels (Rs=0.45; p=0.029). In «nonviral» group an inverse relationship was found between these indicators (Rs = -0.56; p=0.02), in addition the proportion of Lin-HLA-DR-CD33+and CD14+HLA-DRlow/-cells directly correlated with disease severity scores (Child-Pugh and MELD) direct correlation of the proportion of Lin-HLA-DR-CD33+and CD14+HLA-DRlow/-cells with the disease severity scores (Child-Pugh and MELD). Comparison of the initial content of myeloid suppressors with the response to complex therapy (that included autologous bone marrow-derived cell transplantation), showed that in viral liver cirrhosis, the proportion of Lin-HLA-DR-CD33+cells was characterized by a prognostic significance and, at values <1.9%, allowed to predict a decrease in the Child-Pugh score at 12 month follow-up with a sensitivity of 83.3% and a specificity of 71.4%.
The data obtained indicate the relationship between myeloid-derived suppressor cells and albumin levels, disease severity and response to therapy, suggesting myeloid suppressors as a new therapeutic target in the liver cirrhosis.
Key words: myeloid-derived suppressor cells, liver cirrhosis, disease severity, prognosis, ROC-analysis.
Введение
Цирроз печени (ЦП) и его осложнения являются серьезной медико-социальной проблемой из-за роста распространенности заболевания и сложности лечения. Недавние исследования выявили важную роль иммунных клеток в процессах воспаления, фиброза и иммуносу-прессии при этом мультисистемном заболевании и показали, что иммунные дисфункции сопряжены с тяжестью ЦП и его осложнениями [1].
Миелоидные супрессорные клетки (МС) представляют собой гетерогенную популяцию миелоидных
клеток, способных подавлять реакции врожденного и приобретенного иммунитета, и включают у человека 3 субпопуляции: гранулоцитарные, моноцитарные и ранние МС (Г-МС, М-МС и Р-МС, соответственно) [2], различающиеся по морфологии, экспрессии мембранных маркеров и механизмам супрессорной активности [3]. Супрессорный эффект МС в наибольшей степени проявляется в отношении Т-клеток и реализуется с вовлечением различных механизмов [4].
Исследования последних лет выявили увеличение содержания МС, циркулирующих в периферической
крови при хронических заболеваниях печени, что обусловлено стимуляцией костномозговых предшественников молекулами, ассоциированными с повреждением (DAMP и PAMP) на фоне повышенной концентрации мие-лоидных факторов роста и воспалительных сигналов [5]. Сведения о взаимосвязи между количеством MC и клиническими параметрами при хронических гепатитах немногочисленны и неоднозначны. MC могут играть протективную роль, ограничивая Т-клеточный иммунный ответ и защищая гепатоциты от избыточного повреждения. С другой стороны, подавление Т-клеточного иммунного ответа в случае вирусных гепатитов может способствовать хронизации инфекции и индуцировать опухолевый рост [6, 7]. Количественные изменения в содержании МС на конечных стадиях хронических заболеваний печени, в частности ЦП, охарактеризованы еще в меньшей степени, а сопряженность количества МС с тяжестью, прогнозом и ответом на терапию у таких больных остается практически неисследованной.
Как известно, наиболее эффективным методом лечения ЦП является трансплантация печени. Тем не менее, ограничения данного метода заставляют искать альтернативные подходы. Один из таких подходов — трансплантация клеток костного мозга, содержащих стволовые клетки и клетки с иммуномодулирующей активностью [8]. Безопасность и эффективность внутривенного введения клеток костного мозга в качестве компонента комплексной терапии была продемонстрирована нами ранее [9]. Однако клинический ответ наблюдался не у всех больных, обосновывая необходимость поиска предикторов ответа на терапию.
Учитывая вышесказанное, целью работы явилось исследование субпопуляций МС у больных ЦП, анализ взаимосвязи между их содержанием и тяжестью заболевания, а также оценка прогностической значимости наличия МС в качестве потенциальных предикторов ответа на комплексную терапию, включающую трансплантацию аутогенных клеток костного мозга.
Материал и методы
Настоящее проспективное когортное исследование выполняли в рамках фундаментальных и поисковых научных исследований. Общая когорта обследуемых включала 51 пациента (подробная характеристика пациентов представлена в табл. 1), которые были разделены на 2 группы. Первую группу составили 33 пациента с ЦП вирусной этиологии (вирусный ЦП), вторую группу — 18 пациентов с «невирусным» (алкогольным или билиарным и аутоиммунным) ЦП. Отбор пациентов в исследование проводили с учетом критериев включения и невключения из числа пациентов с ЦП различной этиологии, проходивших обследование и лечение на базе клиники иммунопатологии НИИФКИ в период с сентября 2018 г. по июнь 2020 г. Диагноз ЦП базировался на результатах предшествующего гистологического исследования и комплекса клинических, лабораторных и радиологических данных. Пациенты с вирусным ЦП на момент обследования и наблюдения не получали противовирусной терапии. Степень тяжести ЦП оценивали по шкалам Child-Pugh и MELD. Контрольную группу составили 27 сопоставимых по полу и возрасту доноров крови. Исследования проводили после получения от всех участников письменного информированного согласия, протокол был одобрен локальным этическим комитетом НИИФКИ (протокол заседание № 119 от 10.10.2019).
Взятие периферической крови для иммунологических и общелабораторных исследований проводили
однократно при поступлении пациента в клинику. Биохимический анализ крови (уровень билирубина, ЛДГ, АСТ/АЛТ, альбумина) выполняли на анализаторе VitaLine 200 (Россия). Комплексное лечение пациентов включало стандартную базисную терапию (с учетом класса ЦП) и внутривенную инфузию аутогенных костномозговых клеток, как описано ранее [9]. Наличие ответа на терапию расценивали как отсутствие изменений (стабилизация) или снижение балла по шкале Child-Pugh (объективный ответ) при повторном обследовании через 12 мес., отсутствие ответа — при нарастании балла по шкале Child-Pugh к моменту повторного обследования или летальном исходе в течение 12 мес.
Мононуклеарные клетки (МНК) из венозной крови выделяли стандартным методом градиентного центрифугирования в градиенте плотности фиколла-верографина р=1,077 (Биолот, Россия). При необходимости проводили лизис эритроцитов раствором VersaLyse (BeckmanCoulter, Франция) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Относительное содержание МС определяли методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител: anti-LineageCocktail 1 (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 и CD56, конъюгированные с FITC, BDBiosciences, США), anti-CD14 (FITC, BDBiosciences, США), anti-CD33 (PerCP-Cy5.5, BDBiosciences, США), anti-CD66b (APC, BioLegend, США), anti-HLA-DR (PerCP или APC-Cy7, BDBiosciences, США). В качестве негативного контроля использовали изотипические антитела, конъюгирован-ные с аналогичными флуорохромами.
Стратегия гейтирования представлена на рис. 1. Общую популяцию ранних и гранулоцитарных МС (Lin-HLA-DR-CD33+-клетки) оценивали путем анализа региона МНК (Р1, рис. 1А), из которого выделяли область Li^-клеток (Р2), а из гейта Lin-негативных клеток выделяли регион HLA-DR-негативных клеток, в котором оценивали относительное содержание CD33+-клеток (Р3). Для изучения Г-МС из области Li^-клеток (Р1, рис. 1А) выделяли регион CD33+-клеток, далее в области Lin-CD33+-клеток (Р4) оценивали распределение клеток по экспрессии HLA-DR и CD66b молекул; регион СD66b+HLA-DR--клеток (Р5) относили к Г-МС. Для гей-тирования использовали APC-Cy7-конъюгированные anti-HLA-DR и PerCP-Cyb.b-конъюгированные anti-CD33 антитела, соответственно. Относительное содержание Г-МС вычисляли как доля клеток с фенотипом Lin-HLA-DR-CD33+CD66b+ среди МНК. Для анализа количества М-МС в регионе мНк (Р1, рис. 1Б) оценивали распределение CD14 и HLA-DR и клетки с фенотипом CD14+HLA-DRlow/-относили к М-МС. Анализ проводили после накопления не менее 100000 событий в регионе Li^-клеток, или — при оценке субпопуляции моноцитарных МС — не менее 50 000 событий в регионе СD14+-клеток.
Статистический анализ
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0. Данные представлены в виде медианных значений (Ме) и квартильного диапазона (LQ-UQ, 25-75% квартили). Для выявления значимых различий сравниваемых показателей использовали непараметрические критерии: U-критерий Манна-Уитни и парный критерий знаков. Корреляционный анализ выполняли с помощью ранговой корреляции Спирмена (Rs). Различия считали значимыми при p<0,05. ROC-анализ для оценки прогностической значимости субпопуляций миелоидных
Рис. 1. Стратегия гейтирования субпопуляций миелоидных супрессорных клеток (МС) периферической крови. Представлены данные репрезентативного пациента с циррозом печени: А — гейтирование гранулоцитарных и ранних МС.; Б — гейтирование М-МС
супрессоров проводили с использованием программы Graph-PadPrism 5.
Результаты
Характеристика пациентов
Все обследуемые пациенты (n=51, табл. 1) были разделены на 2 группы. Первую группу составили 33 пациента с ЦП вирусной этиологии (вирусный ЦП), среди которых у 1 9 пациентов диагностировали хронический гепатит С, у 12 — хронический гепатит В (в 8 случаях в сочетании с гепатитом D, в 2 случаях — сочетанная HCV и HBV/HDV-инфекция). При HCV-ассоциированном ЦП генотип Ib выявляли у 10 и генотип 3а — у 7 пациентов. В 2 случаях определить генотип не представлялось возможным. Репликативная форма вирусной инфекции была диагностирована у 1 6 пациентов, включая 5 больных с HCV-инфекцией, 9 пациентов с HBV/HDV-инфекцией (HBV — у 5 и HDV- у 4 пациентов) и 2 пациентов с сочетанной HCV+HBV/HDV-инфекцией (у одного из которых была зарегистрирована репликация HCV, у другого -HDV). Пациенты с алкогольным (n=7), билиар-ным (n=8) и аутоиммунным (n=3) ЦП были объединены во вторую группу (n=1 8), которую условно обозначили как ЦП «невирусной» этиологии.
Анализ пациентов c учетом тяжести поражения печени показал, что класс А (5-6 баллов) по шкале Child-Pugh в группе с вирусным ЦП был выявлен у 21 (63,6%), класс В (7-8 баллов) — у 10 (30,3%) и класс С (9-10 баллов) — у 2 (6%) пациентов. Таким образом, доля больных с ЦП (В+С) по шкале Child-Pugh составила 36,4%. Схожая частота пациентов с ЦП была выявлена в группе с ЦП (В+С) «невирусной» этиологии. Больные
ЦП в сформированных группах были сопоставимы по баллу шкал Child-Pugh и MELD.
Содержание субпопуляций МС у больных ЦП
Оценка количества МС (табл. 2) как в общей выборке, так и группах с ЦП вирусной и «невирусной» этиологии выявила статистически значимое увеличение относительного содержания всех анализируемых субпопуляций МС в периферической крови. Анализ содержания субпопуляций МС в подгруппах пациентов с HCV- и HBV/HDV-инфекцией у больных вирусным ЦП не показал значимых различий. Сравнение содержания МС в подгруппах с наличием и отсутствием репликации вируса также не выявило значимых различий, свидетельствуя о том, что экспансия МС на стадии ЦП не зависит от типа вируса и его репликации. Значимое увеличение количества всех циркулирующих субпопуляций МС было также характерно для группы пациентов с ЦП невирусной этиологии. При этом, мы не обнаружили значимых различий между подгруппами пациентов с алкогольным ЦП и билиарным и аутоиммунным ЦП, так же, как и между пациентами с ЦП вирусной и «невирусной» этиологии.
Сопряженность содержания субпопуляций
МС с маркерами печеночных повреждений
Анализ корреляционных связей между содержанием субпопуляций МС (табл. 3) и лабораторными показателями, отражающими повреждение печеночных клеток (уровень билирубина, ЛДГ, АСТ/АЛТ, альбумина), в общей выборке больных не выявил каких-либо сопряженностей. Однако ряд ассоциаций регистрировали при анализе в подгруппах с вирусным и «невирусным» ЦП. Так, при
Таблица 1. Характеристика больных
Этиология ЦП
Параметры Общая группа Вирусный Алкогольный Билиарный и аутоиммунный
Количество пациентов, n 51 33 7 11
Возраст, лет (Me; min-max) 51 (35-66) 48 (35-57) 57 (48-62) 55 (44-60)
Пол (М/Ж) 27/24 23/10 5/2 1/10
Child-Pugh, балл (Ме; LQ-UQ) 6,0 (6,0-7,0) 6,0 (6,1-7,0) 7,0 (6,0-8,0) 6,0 (5,0-7,0)
Класс А, n (%) 30 (58,8%) 21 (63,6%) 3 (42,8%) 7 (63,6%)
Класс В, n (%) 18 (35,2%) 10 (30,3%) 3 (42,8%) 4 (36,4%)
Класс C, n (%) 3 (5,8%) 2 (6,0%) 1 (14,3%) 0 (0%)
Класс B+C, n (%) 21 (41,2%) 12 (36,4%) 4 (57,1%) 4 (36,4%)
Балл MELD, балл (Ме; LQ-UQ) 13 (10-15) 12,0 (9,6-13,0) 13 (10-16) 11,0 (8,2-17,0)
Примечание: представлена характеристика больных ЦП в общей группе и в группах с разной этиологией. Тяжесть пациентов оценивали по шкалам Child-Pugh и MELD (Model for End-stage Liven Disease). Child-Pugh класс А — 5-6 баллов, класс B — 7-8 баллов, класс C — 9-10 баллов; n- количество наблюдений, в скобках указана доля (%) от общей выборки.
Таблица 2. Содержание субпопуляций МС у больных ЦП различной этиологии
Субпопуляции МС (%)
Группы Lin-HLA-DRCD33+ CD14+HLA-DRlow/- LinHLA-DR-CD33+CD66b+
(1) Доноры, п=27 0,6 (0,3-0,8) 2,0 (1,0-3,0) 0,03 (0,07-0,09)
(2) ЦП, п=51 Р(1-2) 2,0 (1,2-3,5) 0,00001 3,5 (2,0-6,0) 0,00055 0,35 (0,18-0,61) 0,0002
(3) Вирусный ЦП, п=33 Р(1-3) 2,0 (1,3-3,1) 0,00001 3,8 (2,5-7,3) 0,00002 0,3 (0,16-0,66) 0,00081
Н^, п=17 HBV/HDV, п=12 Р(НСУ против HBV/HDV) Репл. (+), п=15 Репл. (-), п=16 Р(Репл.(+) против Репл (-) (4) Невирусный ЦП, п=18 Р(1-4) Р(3-4) 1,7 (0,7-2,7) 2,7 (2,0-3,5) 0,08 2,1 (1,4-3,1) 1,9 (0,91-3,0) 0,46 2,1 (1,3-3,6) 0,0012 0,65 4,0 (2,0-6,0) 3,0 (2,5-6,0) 0,62 3,3(3,0-6,0) 4,0 (2,0-6,0) 0,98 3,8 (2,0-5,0) 0,0008 0,74 0,38(0,17-0,66) 0,3 (0,1-0,35) 0,22 0,31(0,14-0,44) 0,35(0,14-0,35) 0,48 0,37 (0,2-0,69) 0,0027 0,39
(5) Алкогольный ЦП, п=7 Р(1 —5) Р(3-5) 2,3 (1,0-3,6) 3,5 (2,0-4,0) 0,33 (0,2-0,61)
0,0015 0,28 0,004 0,25 0,0014 0,27
(6) Билиарный и аутоиммунный ЦП, п=11 Р(1-б) Р(3-6) Р(3-4) 1,7 (1,0-3,6) 3,1 (2,0-5,0) 0,36 (0,16-0,49)
0,0004 0,84 0,44 0,0056 0,59 0,65 0,001 0,96 0,29
Примечание: данные представлены в виде медианы и интерквартильного диапазона (в скобках). Репл. (+) и Репл. (-) — наличие или отсутствие репликации вируса у пациентов с вирусным ЦП; р — значимость различий между группами (критерий Манна-Уитни), анализируемые группы обозначены в скобках цифрами; п — количество наблюдений.
вирусном ЦП относительное содержание ип-Н1_А-0П-С033+-клеток на уровне тренда обратно коррелировало с концентрацией ЛДГ (р=0,06) и прямо — с концентрацией альбумина (р=0,029). Как видно более высокие показатели количества данной субпопуляции МС ассоциировались с менее выраженными признаками поражения печени и более сохранной белково-синтетической функцией.
В то же время в группе с ЦП «невирусной» этиологии концентрация альбумина обратно коррелировала с долей Ып-Н_А-0П-С033+-МС (р=0,02) и на уровне выраженного тренда с количеством М-МС (р=0,06). Таким образом, более высокое содержание указанных субпопуляций МС ассоциировалось с меньшим содержанием альбумина, т. е. более выраженными признаками поражении печеночных клеток.
Таблица 3. Корреляционные связи между содержанием субпопуляций МС и лабораторными поражения печени
индикаторами
Группы
Общая группа (n=51)
Вирусный ЦП (n=33)
Невирусный ЦП (n=18)
Корреляционные взаимосвязи с уровнем
ип-Н_А-0П-С033+-МС
С014+Н_А-0П|°™/--(М-МС)
иггН1_А-йР-Сй33+Сй66Ь+-(Г-МС)
Корреляционные взаимосвязи с уровнем
ип-Н1_А-0П-С033+-МС
С014+Н_А-0П|°'"/--(М-МС)
ип-Н_А-0П-С033+С1366Ь+-(Г-МС)
Корреляционные взаимосвязи с уровнем
Ып-Н_А-0П-С033+-МС
С014+Н_А-0П'°™/--(М-МС)
ип-Н_А-0П-С033+С1366Ь+-(Г-МС)
Корреляционные взаимосвязи с уровнем
_1п-Н_А-0П-С033+-МС
С014+Н_А-0П'°™/--(М-МС)
_1п-Н_А-0П-С033+С066Ь+-(Г-МС)
билирубина
-0,06 (0,72) 0,19 (0,20) -0,06 (0,68) АСТ/АЛТ
-0,20 (0,19) -0,08 (0,57) -0,07 (0,69)
ЛДГ
-0,18 (0,23) 0,12 (0,41) -0,21 (0,21) сывороточного альбумина
0,13 (0,40) -0,03 (0,24) 0,1 (0,53)
-0,08 (0,67) 0,18 (0,34) 0,03 (0,88)
-0,22 (0,27) 0,08 (0,69) 0,02 (0,94)
-0,37 (0,06) 0,09 (0,64)
-0,16 (0,46)
0,450 (0,029)
-0,06 (0,85) 0,07 (0,74)
0,15 (0,58) 0,17 (0,51) 0,03 (0,9)
0,03 (0,90) 0,14 (0,59) -0,10 (0,96)
-0,17 (0,52) -0,05 (0,84) -0,29 (0,27)
-0,56 (0,02) -0,47 (0,06) -0,15 (0,57)
Примечание: данные представлены в виде коэффициентов корреляции по Спирмену, в скобках: р — значимость коэффициента.
Сопряженность количества
циркулирующих МС с тяжестью ЦП
При анализе общей группы пациенты с тяжестью ЦП класса B+C по шкале Child-Pugh характеризовались на уровне тренда более высоким содержанием М-МС и Г-МС по сравнению с аналогичными показателями у пациентов с тяжестью ЦП класса А по шкале Child-Pugh (табл. 4). Однако в группе пациентов с ЦП «невирусной» этиологии декомпенсированная стадия ассоциировалась со статистически значимым более высоким уровнем содержания иггН1_А-йП-Сй33+-МС, иггН1_А-йП-Сй33+Сй66Ь+-МС и на уровне выраженного тренда — с содержанием Сй14+Н_А-йП|0И/--МС. Таким образом, связь количества циркулирующих МС с более тяжелой стадией ЦП в наибольшей степени проявлялась у пациентов с ЦП «невирусной» этиологии.
Связь содержания МС с тяжестью заболевания была подтверждена также корреляцией между количеством МС и баллом тяжести ЦП (табл. 5). В общей группе пациентов балл по шкале СЫИ-РидЬ| прямо коррелировал с относительным содержанием CD14+HLA-йП|0И/--М-МС (р=0,025), хотя сила корреляционной связи была весьма умеренной (Rs=0,31). В группе пациентов с вирусным ЦП значимых корреляционных зависимостей выявлено не было. В то же время в группе с ЦП «невирусной» этиологии балл по шкале СЫИ-РидЬ| прямо коррелировал с относительным содержанием ЫгтН_А^^33+- и CD14+HLA-DRl0w/--клеток и на уровне тренда — с относительным содержанием _in-H_A-DR-CD33+CD66b+-МС, причем сила корреляций возрастала до 0,43-0,68. При сопоставлении количества МС с тяжестью заболевания по шкале MELD в общей группе пациентов была обнаружена прямая корреляция тяжести ЦП с долей Ып-Н_А^^33+-МС (р=0,04) и Г-МС (р=0,04). В группе больных с вирусным ЦП умеренная прямая
корреляция _in-H_A-DR-CD33+CD66b+-МС с тяжестью ЦП проявлялась на уровне тренда (р=0,08). В то же время при ЦП «невирусной» этиологии балл по шкале MELD прямо коррелировал с содержанием Ып-Н_А^^33+(р=0,013), CD14+HLA-DR|ow/-(p=0,03) и на уровне тренда (р=0,09) — с содержанием _in-H_A-DR-CD33+CD66b+-МС. Таким образом, выявленная в группе пациентов с ЦП «невирусной» этиологии прямая сопряженность между тяжестью заболевания и содержанием МС проявлялась в наибольшей степени в отношении Ып-Н_А^^33+-МС и CD14+H_A-DRl0w/--М-МС.
Сопряженность содержания субпопуляций
МС с ответом на терапию
В общей выборке ответ на терапию был отмечен у 38 (84,4%) пациентов и включал стабилизацию (п=32) и уменьшение балла тяжести заболевания (объективный ответ; п=6). 7 пациентов (18,4%) не ответили на терапию: в 6 случаях наблюдалось нарастание балла тяжести по шкале Ш№-РидЬ| и в одном случае был зарегистрирован летальный исход через 6 мес. после терапии. Пациенты в группе «ответчиков» и «неответчиков» значимо не различались по полу, возрасту и баллу тяжести заболевания по шкалам Ш^-РидЬ| или MELD. Поскольку все пациенты с объективным ответом и отсутствием ответа (за исключением одного случая) имели вирусную этиологию ЦП, ассоциацию между ответом и содержанием субпопуляций МС исследовали именно в этой группе. Сравнение пациентов с наличием и отсутствием ответа не выявило различий в содержании исследуемых субпопуляций МС. В то же время при сравнении пациентов, оппозитных по объективному ответу (табл. 6), было установлено, что пациенты со снижением через 12 мес. балла по шкале №И-РидЬ| характеризовались значимо
Таблица 4. Субпопуляционный состав МС у больных ЦП различной тяжести
Группы LinHLA-DRCD33+ CD14+HLA-DRlow/- LinHLA-DRCD33+CD66b+
ЦП (общая группа)
класс А (п=30) 2,0 (1,2-3,1) 3,0 (2,0-5,0) 0,33 (1,70-5,10)
класс В+С (п=21) 2,1 (1,2-3,6) 4,0 (3,0-7,0) 0,45 (0,25-0,66)
р(А против В+С) 0,5 0,05 0,16
Вирусный ЦП
класс А (п=21) 2,1 (1,4-3,3) 3,0 (2,0-6,5) 0,35 (0,16-0,68)
класс В+С (п=12) 1,96 (1,20-3,00) 4,0 (3,0-8,7) 0,26 (0,16-0,55)
р(А против В+С) 0,6 0,16 0,39
«Невирусный» ЦП
класс А (п=10) 1,40 (0,98-2,30) 2,1 (2,0-4,0) 0,29 (0,19-0,38)
класс В+С (п=8) 3,7 (2,7-4,2) 5,5 (3,5-7,5) 0,58 (0,40-1,00)
р(А против В+С) 0,007 0,059 0,01
Примечание: данные представлены в виде медианы и интерквартильного диапазона (в скобках) значений относительного содержания указанных субпопуляций МС у больных ЦП в общей группе и в зависимости от этиологии. Тяжесть пациентов оценивали по шкале Child-Pugh: класс А — 5-6 баллов, класс B — 7-8 баллов, класс C — 9-10 баллов; n — количество наблюдений; р — значимость различий между группами (критерий Манна-Уитни), анализируемые группы обозначены в скобках; n — количество наблюдений.
Таблица 5. Сопряженность содержания субпопуляций МС с тяжестью ЦП
Параметры
LinHLA-DRCD33+
CD14+HLA-DRlow/-
LinHLA-DRCD33+CD66b+
Корреляция с Child-Pugh баллами
Общая группа, n=51 0,18 (0,21)
Вирусный ЦП, n=33 -0,13 (0,48)
Невирусный ЦП, n=18 0,680 (0,002) Корреляция с MELD баллами
Общая группа, n=51 0,16 (0,28)
Вирусный ЦП, n=33 -0,04 (0,84)
Невирусный ЦП, n=18 0,59 (0,013)
0,31 (0,025) 0,22 (0,24) 0,520 (0,026)
0,29 (0,04) 0,16 (0,4) 0,52 (0,033)
0,22 (0,08) -0,04 (0,82) 0,43 (0,07)
0,32 (0,047) 0,38 (0,08) 0,42 (0,09)
Примечание: данные представлены в виде коэффициентов корреляции по Спирмену, в скобках: р — статистическая значимость коэффициента.
Таблица Б. Субпопуляции МС у пациентов с вирусным ЦП, оппозитных по объективному ответу
Субпопуляции МС Снижение балла тяжести (n=6) Отсутствие изменений или возрастание балла тяжести (n=22) Pu
Ып-Н_А^^33+ 1,30 (0,72-1,80) 2,2 (1,7-3,5) 0,023
CD14+H_A-DRlow/- 4,5 (3,5-12,0) 4,0 (3,0-6,0) 0,4
_in-H_A-DR-CD33+CD66b+ 0,24 (0,15-0,36) 0,33 (0,20-0,66) 0,17
Примечание: данные представлены в виде медианы и интерквартильного диапазона (в скобках) значений относительного содержания указанных субпопуляций МС у больных ЦП, ответивших на терапию снижением тяжести заболевания по шкале Child-Pugh, и больных ЦП без изменения или с возрастанием тяжести заболевания по шкале Child-Pugh через 12 мес. после проведенного комплексного лечения; ри — значимость различий между группами (U — критерий Манна-Уитни).
меньшим исходным содержанием _in-H_A-DR-СD33+-клеток по сравнению с оппозитной группой.
ROC-анализ (рис. 2) показал, что относительное содержание _in-H_A-DR-СD33+-МС может являться предиктором объективного ответа. Так, площадь под ROC-кривой при построении прогностической модели, основанной на оценке _in-H_A-DR-СD33+-клеток,
составила 0,85, и при значениях иггН1_А-йП-Сй33+-клеток меньше 1,9% объективный ответ прогнозировался с чувствительностью 83,3% и специфичностью 71,4%. В то же время модели, основанные на оценке балла по шкале ШИ-РидИ или MELD, не достигали «хорошего» качества прогноза (площадь под ROC-кривой составляла <0,7).
Рис. 2. Прогностическая значимость иггН1_А-ОР-ГО33+-клеток в качестве предиктора объективного ответа через 12 мес. на комплексную терапию у больных циррозом печени вирусного генеза (ГОС-анализ)
Обсуждение
Настоящее исследование показало, что пациенты с ЦП характеризуются повышенным относительным содержанием Lin-HLA-DR-CD33+-,CD14+HLA-DRlow/--и Lin-HLA-DR-CD33+CD66b+-MC в периферической крови. Схожие данные об увеличении в циркуляции доли М-МС (CD14+HLA-DR-) получены недавно C. Bernsmeier c соавт. (2018) при исследовании общей выборки пациентов со стабильным и декомпенсированным ЦП [10]. В то же время H. Li с соавт. (2015) не выявили увеличения количества МС (Lin-HLA-DR-CD33+CD11b+) при аутоиммунном ЦП [11], что можно объяснить различиями гейтирования МС и разнородностью исследуемых когорт пациентов. При этом нами впервые показано, что увеличение количества субпопуляций МС, затрагивающее одновременно М-МС и Г-МС, регистрируется как при вирусной, так и «невирусной» этиологии ЦП, включая алкогольный и билиарный и аутоиммунный ЦП, и экспансия МС при вирусном ЦП не связана с типом и репликацией вируса.
Вторым важным моментом настоящей работы являются данные о неоднозначной роли МС при вирусном и «невирусном» ЦП. Так, при вирусном ЦП содержание Lin-HLA-DR-СD33+-клеток прямо коррелировало с уровнем альбумина, свидетельствуя о протективной функции этих клеток. В то же время при ЦП «невирусной» этиологии между долей Lin-HLA-DR-СD33+-клеток и уровнем альбумина отмечалась обратная зависимость, указывающая на прямую сопряженность МС с поражением печени. В литературе имеются данные о прямой корреляции Lin-HLA-DR-CD33+CD11b+-клеток с маркерами поражения печени при аутоиммунном ЦП [11], что согласуется с нашими данными. Однако нами впервые выявлена связь МС с баллом по шкалам СИМ-РидИ и MELD при ЦП «невирусной» этиологиии и показано, что не только содержание Lin-HLA-DR-СD33+-МС, но и содержание CD14+HLA-DRlow/--МС коррелирует
с тяжестью ЦП. Учитывая вовлечение активированных Т-клеток в патогенез аутоиммунного и билиарного ЦП [12] и сохранную супрессорную активность МС при ЦП [11], можно предполагать, что экспансия МС у пациентов с ЦП «невирусной» этиологии направлена на сдерживание воспалительного процесса, опосредованного активированными Т-клетками, однако данный механизм не является эффективным. При вирусных гепатитах МС могут оказывать как негативный (подавление вирус-специфического Т-клеточного ответа), так и позитивный (ограничение воспалительного ответа) эффект [6]. Отсутствие значимой корреляции между содержанием МС и тяжестью ЦП в нашем исследовании возможно связано с тем, что на стадии цирроза антиген-специфические Т-клетки находятся в состоянии Т-клеточного истощения [13], не играют доминирующей роли в сдерживании прогрессии заболевания и репликации вируса и не подвержены регуляции со стороны МС. Тем не менее, прямая корреляция между содержанием иг-Н_А-0П-С1333+-клеток и уровнем альбумина может косвенно указывать на вовлечение МС в ограничение неспецифического Т-клеточного ответа, причастного к поражению печеночных клеток, и свидетельствовать об эффективной протективной роли МС.
Наконец, еще одним важным фактом явилось выявление зависимости между содержанием МС и ответом на комплексную терапию. В литературе имеются единичные сообщения о прямой сопряженности наличия М-МС с ответом на терапию урсодезоксихолевой кислотой при первичном билиарном холангите [14] и эффективностью лечения пэгилированным интерфероном в комбинации с рибавирином при хроническом гепатите С [15]. Нами впервые показана прогностическая значимость _1г-Н_А-0П-С033+-клеток как биомаркера ответа на терапию, включающую трансплантацию костномозговых клеток. Так, снижение балла по шкале ШИ-РидИ через 12 мес. после терапии отмечалось у пациентов с исходно более низким содержанием _1г-Н_А-0П-С033+-МС. Согласно данным экспериментальных исследований антифиброзный эффект костномозговых клеток связывают с присутствием среди них субпопуляции МС (С011 Ь+0г1ЫдМ), способной продуцировать 1_-10, особенно после контакта со звездчатыми клетками печени. Усиление продукции 1_-10 костномозговыми клетками после взаимодействия со звездчатыми клетками описано также у человека [16] и может отчасти объяснять наиболее выраженный терапевтический эффект костномозговых клеток у пациентов с меньшим содержанием в циркуляции иг-Н_А-0П-С033+-МС.
Благодарности
Работа выполнена за счет средств федерального бюджета на проведение фундаментальных научных исследований (FGMN 2021 -0003, интернет номер 1021062512015-4) и поисковых научных исследований (FGMN-2020-0002, интернет номер 1021032424289-2).
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Albillos A., Martin-Mateos R., Van der Merwe S. et al. Cirrhosis-associated immune dysfunction. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2021; 61(6): 1385-96.
2. Gabrilovich D.I. Myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol. Res. 2017; 5(1): 3-8.
3. Rajabinejad M., Salari F., Karaji A.G. et al. The role of myeloid-derived suppressor cells in the pathogenesis of rheumatoid arthritis; anti- or proinflammatory cells? Artif. Cells, Nanomed. Biotechnol. 2019; 47(1): 4149-58.
4. Consonni F.M., Porta C., Marino A. et al. Myeloid-Derived Suppressor Cells: Ductile Targets in Disease. Front. Immunol. 2019; 10: 949.
5. Veglia F., Sanseviero E., Gabrilovich D.I. Myeloid-derived suppressor cells in the era of increasing myeloid cell diversity. Nat. Rev. Immunol. 2021; 21: 485-98.
6. Sehgal R., Kaur N., Ramakrishna G. et al. Immune surveillance by Myeloid derived suppressor cells (MDSCs) in liver diseases. Dig. Dis. 2021; doi: 10.1159/000517459.
7. Hammerich L., Tacke F. Emerging roles of myeloid derived suppressor cells in hepatic inflammation and fibrosis. World J. Gastrointest. Pathophysiol. 2015; 6(3): 43-50.
8. Zhou G.P., Jiang Y.Z., Sun L.Y. et al. Therapeutic effect and safety of stem cell therapy for chronic liver disease: a systematic review and metaanalysis of randomized controlled trials. Stem Cell Res. Ther. 2020; 11: 419.
9. Shevela E.Y., Starostina N., Pal'tsev A. et al. Efficiency of Cell Therapy in Liver Cirrhosis. Bull. Exp. Biol. Med. 2016; 160(4): 542-7.
10. Bernsmeier C., Triantafyllou E., Brenig R. et al. CD14+ CD15-HLA-DR- myeloid-derived suppressor cells impair antimicrobial responses in patients with acute-on-chronic liver failure. Gut 2018; 67(6): 1155-67.
11. Li H., Dai F., Peng Q. et al. Myeloid-derived suppressor cells suppress CD4+ and CD8+ T cell responses in autoimmune hepatitis. Mol. Med. Rep. 2015; 12(3): 3667-73.
12. Longhi M.S., Ma Y., Vergani M. et al. Aetiopathogenesis of autoimmune hepatitis. J. Autoimmun. 2010; 34: 7-14.
13. Kong X., Sun R., Chen Y. et al. yST cells drive myeloid-derived suppressor cell mediated CD8+ T cell exhaustion in hepatitis B virus-induced immunotolerance. J. Immunol. 2014; 193(4): 1645-53.
14. Zhang H., Lian M., Zhang J. et al. A functional characteristic of cysteine-rich protein 61: modulation of myeloid-derived suppressor cells in liver inflammation. Hepatology 2018; 67(1): 232-46.
15. Zeng Q., Yang B., Sun H.Q. et al. Myeloid-derived suppressor cells are associated with viral persistence and downregulation of TCR Z chain expression on CD8 (+) T cells in chronic hepatitis C patients. Mol. Cells 2014; 37(1): 66.
16. Suh Y.G., Kim J., Byun J. et al. CD11b(+) Gr1(+) bone marrow cells ameliorate liver fibrosis by producing interleukin-10 in mice. Hepatology 2012; 56(5): 1902-12.
