CC BY
48
УДК 616. 24 — 053. 31 : 616. 155. 32 - 07 : 547. 963. 32 : 576. 8. 097. 3
ВЗАИМОСВЯЗЬ КОНЦЕНТРАЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК В ПЛАЗМЕ КРОВИ И СОДЕРЖАНИЯ АНТИТЕЛ К НАТИВНОЙ ДНК У НОВОРОЖДЕННЫХ С ПНЕВМОПАТИЕЙ
Н.О. Туаева, В.В. Софронов, В.А. Емикеева, З.И. Абрамова, В-Г. Винтер, Д.М. Мустафина, К.В. Туточкина
Кафедра биохимии (зав. — проф. В.Г. Винтер) Казанского государственного университета
им. Ульянова-Ленина, кафедра педиатрии лечебного факультета (зав. — проф. В.В. Сафронов), Казанского государственного медицинского университета, Городская клиническая больница № 4 (главврач — Е.И. Гурин), г. Казань
Интерес к внеклеточной ДНК плазмы крови в настоящее время все более возрастает, что связано с прогностической и диагностической значимостью этого показателя при онкологических, аутоиммунных заболеваниях [1, 9], неврологических расстройствах [2, 4, 5] и посттравматическом синдроме [11]. При перечисленной патологии существенно изменяются не только концентрация, но и фракционный состав внеклеточной ДНК: появление в плазме крови ее низкомолекулярных фрагментов зачастую возникает во время развития рака, инсульта, при ишемических процессах [1, 2].
Одним из наименее изученных аспектов остается количественная и качественная характеристики внеклеточной ДНК плазмы крови у новорожденных как в норме, так и при патологии. Наиболее тяжелым нарушением перинатального периода является респираторный дистресс-синдром, частным проявлением которого служит пневмопа-тия, занимающая одно из первых мест среди причин смертности новорожденных. В работах 2001 г. было показано, что при синдроме дыхательных расстройств у новорожденных наблюдается достоверное увеличение концентрации внеклеточной ДНК [14]. Однако неясны как происхождение этой ДНК, так и ее роль в патогенезе нарушения адаптации у детей в раннем неона-тальном периоде.
В ряде работ [9, 12, 16] отмечалась роль внеклеточной ДНК в формировании аутоиммунных расстройств у взрослых лиц. Появление в кровотоке большого количества ДНК вызывало аутоиммунный от-
вет, реализуемый в виде выработки аутоиммунных антител (ААТ) к ДНК. Следовательно, изучение уровня ААТ к ДНК при сопоставлении его с концентрацией внеклеточной ДНК у новорожденных с пневмопа-тией является актуальным.
Исследования ДНК ядер лимфоцитов и внеклеточной ДНК были проведены у 24 новорожденных с гестационным возрастом от 31 недели и выше; всем был поставлен диагноз пневмопатии. Новорожденные были пациентами отделения реанимации Детской городской клинической больницы № 1 г. Казани. Исследования осуществлялись с 1 по 5-й день пребывания детей в стационаре. Рожденные в срок и без патологий (n = 39) составили контрольную группу. Количество внеклеточной ДНК определяли флуоресцентным методом с использованием красителя Hoechst 33 342 ("Aldrich", USA), как описано ранее [15], а количество ядерной ДНК и уровень конденсации хроматина — путем окрашивания клеток по Фельгену [5] и измерения интенсивности окраски с помощью сканирующего светового микроскопа "Люмам ПМ-11". Площадь ядра (ПЯ) выражали в мкм2, среднюю оптическую плотность (СОП) и интегральную оптическую плотность (ИОП) — в БЕЛ*. СОП отражает уровень конденсации хроматина в ядре клетки и является десятичным логарифмом отношения фонового светового потока к световому потоку ядра клетки. ИОП — результат произведения ПЯ на СОП и характеризует общее количество ДНК клетки. Принципиальное значение имеет показатель биологической
* Условная единица получила свое обозначение от первых букв фамилии автора, разработавшего используемый метод (Белан, И.Б., Сибирское отделение РАМН, Новосибирск).
синхронизации внутриядерных процессов (КБС), отражающий согласованность морфологических и синтетических процессов в ядре клетки и являющийся коэффициентом корреляции (г) между ПЯ и СОП.
Содержание ААТ к ДНК, относящихся к классу IgG, в плазме крови новорожденных оценивали с помощью иммунофер-ментного анализа (ИФА). В качестве стандарта использовали пул образцов плазмы крови здоровых мужчин 20 — 25 лет, содержание АТ к ДНК у которых находилось в пределах доверительного интервала для данной группы. В качестве ДНК-антигена применяли коммерческий препарат ДНК эритроцитов цыплят ("Reanal", Венгрия), а для проведения реакции — АТ к IgG человека, конъюгированные с пероксидазой (CH1/HRP к IgG человека, "Сорбент ЛТД", Москва).
Для каждой выборки определяли медиану и перцентили (2,5; 25; 75 и 97,5). Для сравнения выборок использовали непараметрические критерии Манна—Уитни и Краскела—Уоллиса. Взаимосвязь внеклеточной ДНК и уровня АТ к ДНК изучали с помощью регрессионного анализа. Степень сопряженности связей оценивали с помощью коэффициента корреляции Спир-мена.
Исследования внеклеточной ДНК у детей с пневмопатией показали, что ее концентрация при данном заболевании значительно превышает этот показатель в контрольной группе [15]. Одним из морфомет-рических показателей, отражающих различные фазы жизни клетки (от пролиферации до гибели), является показатель ПЯ. Исследование ПЯ у детей вышеуказанных групп показало, что средняя величина ПЯ при пневмопатии ниже, чем в контрольной группе (см. табл.).
При пневмопатии выявлено снижение (p< 0,05) накопления ДНК в ядрах лимфоцитов, а также показателя конденсации хроматина. Практически нулевой показатель синхронизации биологических процессов в ядре клетки (КБС = 0,001) также наблюдался при пневмопатии.
Исследование АТ к нативной ДНК показало (рис. 1), что при пневмопатии уровень АТ к нативной ДНК у новорожденных (медиана — 0,908 отн. ед.) достоверно понижен по сравнению с таковым в контроле
Основные параметры метаболизма ДНК у новорожденных при пневмопатии и в контрольной группе
Параметры Дети с Контрольная
пневмопатией группа
Концентрация внеклеточ-
ной ДНК, нг/мл 51,22±12,21* 22,01 ± 2,32
ПЯ, мкм2 32,04 ± 0,79* 43,32 ± 0,45
Уровень содержания
ДНК в ядре (БЕЛ) 3,59 ± 0,12* 6,08 ± 0,07
Уровень конденсации
хроматина (БЕЛ) 0,11 ± 0,01* 0,14 ± 0,01
КБС -0,001 -0,650
* Разница показателей между группой наблюдения и контролем (p < 0,05).
—2,5 перцентиль • медиана -97,5 перцентиль
Пневмопатия
Контроль
Рис.1. Уровень АТ к ДНК у новорожденных.
(медиана — 1,274 отн. ед.; р = 0,05). Чтобы установить возможную взаимосвязь этих параметров, были проведены регрессионный и корреляционный анализы, с помощью которых было установлено, что зависимость уровня АТ от концентрации внеклеточной ДНК действительно существует (г = —0,367; р < 0,05) и носит экспоненциальный характер (рис. 2.). Однако повышение концентрации внеклеточной ДНК ведет не к увеличению содержания АТ, а к его снижению.
Работы прошлых лет наглядно доказывают возможность происхождения внеклеточной ДНК из лимфоцитов [8, 14]. Однако лимфоцит был выбран нами для данного исследования еще и потому, что, будучи центральным звеном иммунной системы, он является мигрирующей клеткой и способен отражать изменения, происходящие
3 т
P < 0,05
2 --
0
y = 1,9655e"0,012x г = -0,367
Рис.2. Взаимосвязь концентрации внеклеточной ДНК (ось Х) и содержания АТ к ДНК (ось Y) у новорожденных с пневмопатией.
в организме [6]. Полученные результаты свидетельствуют о существенных изменениях показателей клеточной и внеклеточной ДНК, которые сопровождают пневмо-патию. Тот факт, что при достоверном снижении величины ПЯ и накопления ядерной ДНК наблюдается достоверное повышение концентрации внеклеточной ДНК в плазме крови, может указывать на лимфоцитар-ное происхождение внеклеточной ДНК плазмы крови при пневмопатии. Каким образом ДНК в таком случае выходит из лимфоцитов, изучено еще недостаточно, и на этот счет имеются только предположения. Одно из них состоит в том, что обозначенные выше изменения являются отражением процесса самодеструкции клетки — апоптоза, который обусловлен уменьшением в крови содержания продуктов жизнеобеспечения, в частности кислорода при гипоксии [13]. Другое предположение касается процесса выхода ДНК из активированных лимфоцитов экскреторным путем, что уже не раз наблюдалось при изучении внеклеточной ДНК лимфоцитарного происхождения [8, 10]. Наиболее вероятно, что в организме новорожденных с пневмопатией имеют место оба упомянутых механизма.
О функциях внеклеточной ДНК из источников литературы известно немного. По-видимому, в норме высокомолекулярная внеклеточная ДНК влияет на выработку антител к ДНК и, как следствие, на обмен веществ человека. Установлено, что динамика содержания ДНК в сыворотке крови тесно связана с интенсивностью обменных процессов в лимфоцитах. Р.М. Хаитов и др. [7] обнаружили, что снижение биосинтеза нуклеиновых кислот в циркулирующих лимфоцитах, наблюдаемое при
хронических воспалительных процессах, в конечном итоге приводит к нарушению иммунитета. Последнее проявляется в снижении количества и угнетении функций Т-лимфоцитов (особенно Т-супрессоров), в дисбалансе В-звена иммунитета и гуморальных факторов естественной антиинфекционной резистентности, а также в формировании аутоиммунных реакций.
Нами констатировано снижение уровня АТ к ДНК у новорожденных с пневмопа-тией как результат расходования материнских антител к ДНК с образованием иммунных комплексов АТ и ДНК, неактивных в реакции ИФА. Однако это явление можно объяснить и особенностями состояния иммунной системы новорожденного, описанными Н.Н. Володиным и др. [3]. В таком случае можно предположить, что внеклеточная ДНК при пневмопатии оказывает угнетающий эффект на иммунную систему новорожденного. Это предположение подтверждается появлением обратной корреляции между содержанием ядерной ДНК (ИОП) и частотой инфекционных заболеваний на протяжении первого года жизни (г = -0,36; p < 0,05).
Исходя из представленных результатов, можно заключить, что у детей с пневмопа-тией, наряду с высокой концентрацией внеклеточной ДНК, наблюдается потеря ДНК лимфоцитами периферической крови. Потеря ДНК клеткой столь велика, что даже при достоверном уменьшении размеров ядра, плотность упаковки хроматина в лимфоцитах не достигает нормального уровня. Дискуссионным остается вопрос о причинах появления в крови внеклеточной ДНК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Владимиров В.Г., Васильева И.Н., Шарова Л.А. // Клин. мед. и патофизиол.— 1998. — № 1-2. — С. 112—119.
2. Вознюк И.А, Одинак М.М., Васильева И.Н. и др. Современные подходы к диагностике и лечению нервных и психических заболеваний. /Мат. юбил. конф., 14-16, июня 2000 г., посвященной 140-летию кафедры нервных и душевных болезней. — СПб, 2000. — С. 358.
3. Володин H.H., Дегтярева М.В, Дегтярев Д.Н. и др. // Int. J. on Immunorehabilitation. — 1999. — №11. — С. 82—91.
4. Ганнушкина И.В., Фараго М.Л., Антела-ва И.Н. и др. // Вестн. РАМН.—1998.—№ 15. — С. 16— 22.
5. КозинецГ.И., Котельников В.М., ГольдбергВ.К. Цитофотометрия гемопоэтических клеток. — Томск, 1986. — С.76.
6. Нарциссов З.П. Прогностические возможности клинической цитохимии / В кн.: Советская педиатрия. Вып.2. - М., 1984. - С.267—275.
7. Хаитов P.M., Земсков A.M., Земсков В.М. // Иммунология. — 1996. — № 3. — С. 7—10.
8. Янева И.С., Федоров Н.А., Боровкова Т.В., Севастьянова М.Г. // Биохимия. —1990. —Вып. 4. — С. 745—753.
9. DavidS. Pisetsky// Autoimmun. Rev. — 2004. — Vol.3. — P. 500—504.
10. Distelhorst C.W., Dennin R.H., Cramer K., Rogers J.C. // J. Clin. Invest. — 1978. — Vol.62. — P. 1204—1217.
11. Lam N. Y. L., Rainer T.H., Chan L.Y.S. et al. // Clin. chem. — 2003. — Vol.49. — P. 15.
12. Lorenz H-M., Herrmann М., Winkler Т. et al. // Apoptosis. — 2000. — Vol.5. — P. 443—449.
13. Slavikova M„ Miler I. // Ces. Pediatr. — 1989. — Vol. 44. — P. 54—55.
14. Stroun M., Lyautey J, Lederrey C. et al. // Clinica Chimica Acta. — 2001. — № 313. — P. 139—142.
15. Tuaeva N.O., Vinter V.G., Belokchvostov A.S. et al. // Clin. Chem.— 2005. — Vol. 51. — P. 21.
16. Wiktorowich K., Szyfter K., Furmaniuk M. et al. // Immunologia Polska. —1987. — Vol. 12.— P. 33—43.
Поступила 09.03.06.
RELATIONSHIP BETWEEN LEVELS OF EXTRACELLULAR DNA AND ANTIBODIES AGAINST DOUBLE STRANGE DNA IN NEW BORNS WITH PNEUMOPATHY
N.O. Tuaeva, V.V. Sofronov, V.A. Emikeeva, Z.I. Abramova, V.G. Winter,1 D.M. Mustafina, K.V. Tutochkina
S u m m a r y
Relationship between extracellular DNA amount and the level of antibodies against double strange DNA (dsDNA) was studied in newborns with pneumopathy. The concentration of extracellular DNA was measured by fluorescent spectrophotometry, the level of nuclear DNA by scanning light microscopy, the level of antibodies by ELISA. It was found that in newborns with pneumopathy the level of nuclear DNA is significantly decreased while the concentration of extracellular DNA is increased. A correlation between concentration of extracellular DNA and level of antibodies against dsDNA was established and that has an exponential manner.
УДК 616. 322 — 002. 2 : [576. 315/. 316] : 615. 375
НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ГЕНОМА У БОЛЬНЫХ АНГИНОЙ И ВОЗМОЖНОСТИ ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ
КСИМЕДОНОМ
И.Э. Кравченко, Р.Г.Зарипова, В.Х. Фазылов, В.В. Семенов, А.В. Семенов, В.И. Погорельцев
Кафедра инфекционных болезней (зав. — проф. В.Х. Фазылов), кафедра медицинской биологии с курсом генетики (зав. — проф. В.В. Семенов) Казанского государственного медицинского университета, Казанский научный центр РАН (председатель — акад. РАН А.И. Коновалов)
До появления антибактериальных препаратов серьезные инфекции, вызванные ß-гемолитическим стрептококком группы А (БСГА), были достаточно частыми. Полагали, что с началом использования пенициллина стрептококки группы А будут фактически элиминированы как патогенные микроорганизмы. Однако последнее десятилетие характеризуется заметным повышением случаев инвазивных инфекций, индуцированных Streptococcus pyogenes во всем мире. Эпидемиология и патогенез инфекций, вызванных БСГА, до сих пор до конца не изучены, а контроль этих инфекций и их осложнений, представляющих угрозу для здоровья людей и в развитых странах, весьма несовершенен [11].
Клеточный иммунитет при инфекциях, инициированных стрептококком, существенно снижен, что проявляется в уменьшении уровня Т- и В-лимфоцитов, подав-
лении фагоцитарной активности лейкоцитов и биосинтеза иммуноглобулинов [5] и в последующем ослаблении противоинфек-ционной, а также противомутагенной защиты организма [4].
Отсюда важен поиск средств, способных уменьшить мутагенное воздействие инфекционных агентов на хромосомный аппарат человека [9].
Схемы лечения ангины как инфекционного заболевания в настоящее время представлены достаточно хорошо, однако в комплексной терапии ангины не используются методы целенаправленной защиты генома. Большой экспериментальный и клинический материал, накопленный казанскими учеными при изучении лекарственного средства ксимедона, являющегося представителем пиримидинового ряда, позволил использовать его в комплексной терапии больных ангиной. Препарат обладает ши-
17. «Казанский мед. ж.», № 4.
257
