Научная статья на тему 'Взаимосвязь изменений клеточного и кальциевого ответов Aspergillus awamori на действие кальций-модуляторов'

Взаимосвязь изменений клеточного и кальциевого ответов Aspergillus awamori на действие кальций-модуляторов Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
88
32
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
СТРЕССОВЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ / МИКРОМИЦЕТЫ АSPERGILLUS АWAMORI 66А / ВЕТВЛЕНИЕ ГИФОВ / ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ / СА2+-АНТАГОНИСТЫ (LA3+ И BAPTA) / MICROMYCES АSPERGILLUS АWAMORI 66A / HYPHAE'S BRANCHING / CA2+ -ANTAGONISTS (LA3+ AND BAPTA) / STRESSFUL INFLUENCES / PHARMACOLOGICAL PREPARATIONS

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Козлова Ольга Владимировна, Егоров Сергей Юрьевич, Куприянова-ашина Флера Гарифовна

На модели штамма Аspergillus аwamori 66А с рекомбинантным Са2+-зависимым фоточувствительным белком-экворином изучено изменение скорости ветвления гифов от проростковой трубочки микромицета в ответ на стрессовые воздействия (повышение уровня СаСl2 в среде, гипоосмотический и механический шок), индуцирующие «кальциевые вспышки» в цитозоле. Исследовано влияние ряда фармакологических препаратов, ингибирующих Са2+-сигнальные системы, на разрастание колоний и интенсивность спорообразования мицелиального грибка A. awamori. Обнаружено, что Са2+-антагонисты (La3+ и ВАРТА) в высоких концентрациях (20 и 5 мМ соответственно) подавляют рост колоний и спорообразование у A. awamori, в отличие от

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Козлова Ольга Владимировна, Егоров Сергей Юрьевич, Куприянова-ашина Флера Гарифовна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

KP4, не влияющего на параметры роста культуры микромицета.Using the culture of Аspergillus аwamori 66А with the recombinant Ca2+-dependent photosensitive protein-aequorin, the cellular response to stressful influences (increasing the level of CaCl2 in a medium, hyposmotic and mechanic shock) connected with the insignificant increase of hyphae's branching from the sprout tubule of micromyces was studied. The influence on the growth of colonies and sporulation of A. awamori by a number of pharmacological preparations that stimulate or inhibit Ca2+-signal systems was also investigated. It was discovered that Ca2+-antagonists (La3+ and BAPTA) in their high concentrations (20 and 5 mM) suppress the growth of colonies and sporulation of A. awamori in contrast to KP4 that has no influence on these parameters.

Текст научной работы на тему «Взаимосвязь изменений клеточного и кальциевого ответов Aspergillus awamori на действие кальций-модуляторов»

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА Том 151, кн. 1 Естественные науки 2009

УДК 582.282.22

ВЗАИМОСВЯЗЬ ИЗМЕНЕНИЙ КЛЕТОЧНОГО И КАЛЬЦИЕВОГО ОТВЕТОВ ASPERGILLUS AWAMORI НА ДЕЙСТВИЕ КАЛЬЦИЙ-МОДУЛЯТОРОВ

О.В. Козлова, С.Ю. Егоров, Ф.Г. Куприянова-Ашина Аннотация

На модели штамма Äspergillus üwamori 66А с рекомбинантным Са2-зависимым фоточувствительным белком-экворином изучено изменение скорости ветвления гифов от проростковой трубочки микромицета в ответ на стрессовые воздействия (повышение уровня СаС12 в среде, гипоосмотический и механический шок), индуцирующие «кальциевые вспышки» в цитозоле. Исследовано влияние ряда фармакологических препаратов, ингибирующих Са2+-сигнальные системы, на разрастание колоний и интенсивность спорообразования мицелиального грибка A. awamori. Обнаружено, что Са2+-антагонисты (La3+ и ВАРТА) в высоких концентрациях (20 и 5 мМ соответственно) подавляют рост колоний и спорообразование у A. awamori, в отличие от KP4, не влияющего на параметры роста культуры микромицета.

Ключевые слова: стрессовые воздействия, микромицеты АspergШus üwamori 66А, ветвление гифов, фармакологические препараты, Са2+-антагонисты (La3+ и BAPTA).

Введение

В концепции о значении вторичных посредников в регуляции клеточного метаболизма особое место отводится универсальной роли кальция, функции которого в качестве мессенджера заключаются в трансдукции различных внешних стимулов в клетках про- и эукариот [1, 2]. Есть сведения, что в ряду биологически важных элементов клетки (S, P, Ca, K) удельное содержание Са2+, имеющего функции универсального клеточного эффектора и стабилизатора биомакромолекул и мембран, существенно меняется в зависимости от физиологического возраста культуры, а соотношения Ca/K и P/S служат показателем особенностей элементного состава активно метаболизирующих клеток, покоящихся и нежизнеспособных форм [3]. В литературе мало такого рода исследований на клетках микромицетов, несмотря на то, что эти организмы отличаются лабильностью реагирования на стрессовые воздействия и могут служить хорошей моделью для изучения регуляторной роли Са2+ в клеточной адаптации. Имеются единичные сообщения относительно влияния Са2+ на рост и развитие мицели-альных грибов. Показано участие кальция в процессах роста окончаний гифов и ветвления мицелия плесневого гриба [4, 5]. Имеются единичные сообщения о том, что некоторые ингибиторы активности Са2-каналов L-типа (верапамил), индуцирующие изменение пула Са в цитозоле, угнетают процессы разветвления и роста гифов у N. crassa и B. cinerea [6]. С учетом указанных известных данных представляется интересным исследовать влияния изменений пула

внутриклеточного кальция на характер роста и развития культуры плесневых грибов. Ранее на клетках мутантного штамма Аspergillus awamori 66А с рекомбинантным Са2-зависимым фоточувствительным белком - экворином - нами был проведен анализ Са2-ответа на различные стимулы [7]. По величине времени подъема и релаксации амплитуды люминесценции экворина было установлено, что стрессовый ответ клеток микромицета на внешние воздействия (гипоосмотический и механический шок повышение уровня внеклеточного кальция, действие Са2+-блокаторов) характеризуется повышением уровня Са2+ в цитозоле.

Целью настоящей работы является определение роли «кальциевых вспышек», индуцированных внешними стимулами, в регулировании физиологических процессов, включающих ветвление гифов, рост колоний и спорообразование культуры Аspergittus awamori.

1. Условия эксперимента

Объектом исследования был штамм Аspergillus awamori 66А, являющийся мутантом с экспрессированным фотобелком - экворином [8], полученный из лаборатории исследования клеток микромицетов Эдинбургского университета.

Культивирование А. awamori 66А осуществляли при 30 °С в жидкой среде Вогеля [9], инокулированной спорами, для получения которых использовали обогащенную жидкую среду с добавление глюкозы (ОСГ) [8]. Выращивание культуры А. awamori 66А на плотной среде (2%-ный агар) проводили в чашках Петри, засеянных суспензией дегидратированных спор и выдержанных в темноте (30 °С) в течение 8 дней. После этого в 0.8%-ный раствор NaCl собирали суспензию конидий с конидиеносцев микромицета, размешивали, центрифугировали (15 мин, 3000 об/мин). Выпавшие в осадок споры дважды отмывали 0.8%-ным раствором NaCl и хранили в этом растворе при 4 °С.

Физико-химические методы воздействия на рост культуры микромицета, индуцирующие Са -вспышки в цитозоле, описаны ранее [7].

Блокаторы Са2-каналов: LaC13 - ингибитор притока Са2+ в клетки Neurospora crassa [10, 11]; ВАРТА - 1,2-бис(2-аминофенокси)этан-К^,№,№-тетраацетатная кислота) - хелирует Са2+ - ингибитор гипоосмотического шока у Saccharomyces cerevisiae [12] и KP4 - единственный, пока известный, специфичный для микромицетов ингибитор Са2+-каналов, продуцируемый Ustilago maydis [13]. При этом LaC13 растворяли в дистиллированной воде и полученный основной раствор стерилизовали при помощи фильтра (Nalgene), чтобы избежать изменений его во время автоклавирования. Плохо растворимый в воде ВАРТА добавляли в определенных концентрациях в среду Вогеля и затем авто-клавировали. При работе с KP4 необходимое количество основного раствора добавляли в среду после ее автоклавирования. Контрольные препараты включали растворитель в соответствующей концентрации.

Скорость прорастания спор и ветвления гифов мицелия А. awamori, подвергнутых воздействию физико-химических факторов, определяли после выращивания культуры в жидкой среде Вогеля на покровном стекле в течение 24 ч при 30 °С. В каждой капле среды (50 мкл) концентрация спор составляла от 500

до 500000 спор/мл. Количество ветвей, образующихся из одной проростковой трубочки от каждой споры, подсчитывали в 75 полях зрения микроскопа.

Влияние блокаторов Са -каналов на разрастание ветвления гифов анализировали при выращивании культуры А. awamori в плотной среде Вогеля, на поверхности которой помещали стерильный целлофан (диаметр - 8.5 см), ино-кулированный суспензией спор. После инкубации 24 ч при 30 °С целлофан переносили в плотную среду, содержащую исследуемое вещество. Через каждый час инкубации (30 °С) отбирали пробы культуры путем отделения их скальпелем вместе с целлофаном на покровное стекло и анализировали с помощью темнопольного микроскопа.

Воздействие Са -антагонистов на рост микромицета и спорообразование регистрировали в результате выращивания культуры в чашках Петри на агари-зованной среде Вогеля. Для этого на поверхность агара помещали фильтровальную бумагу диаметром 8.5 см (Wahtman International Ltd, Англия), в центр которой устанавливали специальный диск диаметром 6 мм (Schleicher & Schuell, Дассел, Германия), пропитанный споровой суспензией (5-105 спор/мл). Через 24 ч выращивания при 30 °С фильтровальную бумагу вместе с диском снимали с поверхности среды Вогеля и помещали в плотную среду, содержащую исследуемые фармакологические препараты. Через каждые 24 ч в течение 8 дней определяли рост колонии по величине диаметра колонии микромицета. Уровень спорообразования измеряли по плотности суспензии конидий, собранных с конидиеносцев, которую определяли в гемоцитометре после 10-кратного разбавления.

Морфология гифов мицелия А. awamori определялась с использованием красителя FM4064 (Molecular Probes Inc, Eugene, Oregon, США.) и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. С этой целью плотную среду Вогеля засевали спорами А. awamori, инкубировали 24 ч при 30 °С, после чего содержащие мицелий кусочки агара (размером 1x0.8) вырезали из среды и помещали в перевернутом виде на среду, содержащую исследуемый фармакологический препарат. В контроле кусочки агара помещали на среду Вогеля с растворителем препарата. По истечении 30 мин и далее через каждый час осуществляли конфокальную микроскопию с помощью системы Bio-Rad MRC600, оснащенной ионным лазером Argon, мощностью 25 мВ, которая была установлена на темнопольном микроскопе Nikon Diaphot TMD.

Статистическая обработка результатов осуществлялась с использованием построения доверительных интервалов (x + 2s). 95%-ные доверительные интервалы для долей строили биномиальным распределением.

2. Результаты и обсуждение

Для определения начала ветвления гифов, идущих от главной проростко-вой трубочки, культуру А. awamori выращивали в жидкой среде Вогеля. При этом важно было подобрать исходную плотность суспензии спор, чтобы избежать их склеивания и образования сложной сети переплетенного мицелия в процессе роста микроколоний. Из четырех протестированных концентраций спор (5-102 - 5-105 в 1 мл инокулята) оптимальной явилась плотность взвеси, соответствующая 5-10 спор/мл, когда через 24 ч культивирования наблюдались

Табл. 1

Влияние различных физико-химических стимулов на ветвление гифов мицелия А. awamori

Время после стимуляции Контроль Механическо воздействие Гипоосмотический шок Добавление 5 мМ CaCl2

1-й ч 1.13 ± 0.05 1.16 ± 0.05 1.16 ± 0.05 1.16 ± 0.05

3-й ч 1.46 ± 0.08 1.44 ± 0.07 1.37 ± 0.08 1.47 ± 0.16

5-й ч 1.59 ± 0.10 1.59 ± 0.08 1.49 ± 0.14 1.48 ± 0.08

7-й ч 1.96 ± 0.12 1.92 ± 0.14 1.72 ± 0.9 1.6 ± 0.08

отдельные микроколонии гриба с проростковой трубочкой и идущими от нее еще 1-2 трубочками на много короче первой. При воздействии на 24-часовую культуру А. аwamori таких физико-химических факторов, как механический и гипоосмотический шок, повышение уровня кальция в среде за счет добавления

5 мМ СаС12, ветвление гифов мицелия анализировали по числу ветвей, образующихся от проростковой трубочки в течение 7 ч после действия на культуру. Было установлено, что при всех вариантах воздействия количество разветвлений от проростковой трубочки со временем возрастало, но незначительно (Р < 0.05) в сравнении с контролем (табл. 1).

Анализ морфологии гифов микромицета методом конфокальной микроскопии после выращивания А. аwamori на агаризованной среде Вогеля не выявил существенных изменений мицелия при всех трех видах стрессового воздействия на культуру.

Постановка вышеописанных экспериментов представляется логичной и целесообразной, особенно если учесть, что даже незначительные изменения пула Са2+ способны активировать самые разнообразные сигнальные процессы [14], в том числе сопряженные с изменениями физиологии микробных культур. Это интересно в связи с тем, что в ранее проведенной работе мы установили временное увеличение содержания Са2+ в клетках А. аwamori, индуцированное теми же внешними факторами [7]. При этом содержание внутриклеточного кальция в ответ на механическое воздействие, гипоосмотический шок и высокие концентрации экзогенного кальция быстро (через 1-5 мин) возвращалось к норме, что не противоречит данным литературы о необходимости поддержания Са в клетке на низком уровня для нормального фосфатного метаболизма [2].

Контролем служили культуры, не подвергавшиеся никакому воздействию. Результаты представляют собой среднее + стандартное отклонение п = 75. Статистические данные показали отсутствие существенной разницы при 5%-ном уровне достоверности между исследуемыми культурами в определенный момент времени.

С учетом выявленных изменений в содержании внутриклеточного кальция при воздействии на микромицет экзогенного Са2+, нами был проведен более детальный анализ влияния на рост колоний и спорообразование А. аwamori СаС12 в зависимости от его содержания в среде (0.5 и 5 мМ). Как оказалось,

0.5 мМ СаС12, как и в контроле, не оказывал влияния на рост колоний и спо-робразование А. аwamori. Вместе с тем СаСі2 в концентрации 5 мМ, не вызывая изменений в интенсивности спорообразования, стимулировал рост колоний,

Табл. 2

Влияние экзогенного СаС12 на рост колоний А. /татоп

Время после воздействия, час Контроль Воздействие СаС12 0.5 мМ 5.0 мМ Стимуляция, % 5.0 мМ СаС12

24-й 0 0 0 0

48-й 2.5 ± 0.08 2.5 ± 0.07 2.6 ± 0.06 0

72-й 6.0 ± 0.07 6.0 ± 0.08 7.0 ± 0.09 0

96-й 8.0 ± 0.11 8.0 ± 0.09 10.0 ± 0.10 12.5

120-й 13.0 ± 0.10 12.5 ± 0.11 15.0 ± 0.09 15.3

144-й 17.5 ± 0.13 18.0 ± 0.12 20.0 ± 0.11 11.6

168-й 22.5 ± 0.17 22.5 ± 0.19 28.5 ± 0.13 12.1

192-й 27.4 ± 0.19 27.5 ± 0.17 32.5 ± 0.13 11.9

Результаты представляют собой среднее ± стандартная ошибка.

Контроль - клетки подвергнуты механическому воздействию.

Стимуляция роста колонии в % по отношению к контролю, принятому за 100%.

Величина колоний дана в радиусах (мм).

повышая величину радиуса колонии микромицет через 96 ч после воздействия примерно на 12% в сравнении с контролем (табл. 2).

Сопоставляя результаты этого эксперимента с ранее полученными данными

об изменении уровня Са2+ в зависимости от интенсивности (концентрации СаС12) стрессового воздействия на клетки, определяемом с помощью рекомбинантного экворина, можно считать информативным характер амплитуды люминесценции, учитывающий ее величину, время подъема и релаксациия. Для вариантов воздействия на А. ам>атоп СаС12 в концентрации 5 мМ характерна была наибольшая величина амплитуды люминесценции при меньшем времени релаксации. В случае использования 0.5 мМ СаС12 при низкой амплитуде люминесценции наблюдалась длительная релаксация [7]. Анализируя эти данные, можно видеть, что более высокая «кальциевая вспышка», индуцированная 5 мМ СаС12, коррелировала со стимулированием роста колонии микромицета в сравнении с контролем.

Существенно, что кальциевый ответ клетки на воздействие экзогенного кальция зависел не только от концентрации Са1С2, но и от физиологического возраста микромицета. Как было показано ранее [7], реакция клеток активнора-стущих культур (24-й, 48-й час) на внесение в среду СаС12 была слабее, чем при воздействии СаС12 в этих же концентрациях на клетки стационарной культуры (72-й час). В клетках А. ам>атоп поздней стационарной фазы (96-й час) Са2-ответ вновь уменьшался. Вероятнее всего, внутриклеточный Са2+ в стационарных клетках находится в связанном состоянии, выполняя функции стабилизатора клеточных биополимеров и надмолекулярных структур, и потому не определяется применяемым методом, что не противоречит данным литературы о присутствии Са2+ в покоящихся формах микроорганизмов в связанном состоянии [15, 16].

Таким образом, физико-химические стимулы, индуцирующие кратковременные «кальциевые вспышки» в клетках без сопутствующих изменений (возникновение вторичного кальциевого ответа) и потому не вызывающие серьезных

нарушений механизма гомеостаза Са2+ в клетках микромицетов, не оказывают существенного влияния на рост и развитие мицелиального гриба, что, однако, варьирует в зависимости от интенсивности стрессового воздействия и физиологического состояния культуры.

Следующей задачей настоящей работы было определение ветвления гифов мицелия, интенсивности роста колоний и спорообразования у A. awamori, подвергнутых воздействию фармакологическими препаратами, известными своей способностью влиять на Са -сигнальные системы и (или) гомеостаз этих ионов внутри гифов мицелия. С этой целью в экспериментах тестировались Са -антагонисты (Ьа3+, КР4, ВАРТА), способные ингибировать различные кальциевые каналы, что было показано на клетках животных и растений [17, 18]. При изучении влияния этих блокаторов Са на рост культуры A. awamori препараты исследовали в концентрации 1С50, а также использовали и самые высокие концентрации, применявшиеся нами в люминометрических экспериментах [7]. Вследствие ограниченного количества препарата КР4 наивысшая концентрация его при изучении влияния на рост гриба составила 5.4 мкМ. Самая высокая исследованная концентрация препарата ВАРТА составила 5 мМ, что было связано с его ограниченной растворимостью.

Разрастание колонии микромицета регистрировали через каждые 24 ч по величине диаметра колонии (радиус, мм) в течение 8 дней после переноса 24часовой культуры плесневого гриба в агаризованную среду, содержащую исследуемые Са2-антагонисты. Влияние ЬаС13, известного блокатора кальциевых каналов Ь-типа, на рост культуры мицелиального гриба исследовали в двух концентрациях (10 и 20 мМ). При выращивании A. awamori в агаризованной среде с ЬаС13, добавленным в дозе 10 мМ наблюдалась стимуляция разрастания колонии, особенно четко выраженная по сравнению с контролем после 72 ч инкубации (табл. 3). Рост культуры в среде с ЬаС13 в более высоких концентрациях (20 мМ) угнетался. Наиболее четко ингибирующее действие 20 мМ ЬаС13 проявлялось после 120 ч, когда скорость разрастания колонии замедлялась на 23-30% в сравнении с контролем (табл. 3).

Механизм выявленного эффекта можно объяснить, анализируя данные литературы [10], согласно которым Ьа в низких концентрациях (до 5 мМ) вызывает деполяризацию мембран у Neurospora crassa и, как следствие, изменения ее функциональной активности. В результате поток Са2+ в цитоплазму осуществляется как через мембрану цитоплазматическую, так и мембраны внутриклеточных резервуаров Са2+, то есть неспецифически. Показанная нами ранее [7] избирательность Са2-ингибирующего действия Ьа3+ на гипоосмотический шок и воздействие экзогенным СаС12 свидетельствуют о более сложном характере воздействия на клетки микромицета высоких концентрациий Ьа3+. Эффект заключается в том, что при концентрации 20 мМ лантан не только способствует уменьшению амплитуды люминесценции экворина у гриба, но и индуцирует возникновение вторичной Са2-вспышки, соответствующей выходу Са2+ из клеточных органелл. Помимо этого, Ьа3+ при любой концентрации, превышающей 5 мМ, также вызывал превышение конечного уровня содержания Са над нормой [7]. В связи с изложенным можно предположить, что угнетение скорости роста колоний микромицета под действием высоких доз лантана обусловлено

Табл. 3

Влияние ЬаС13 на скорость разрастания колоний микромицета А. ам>ашоп, культивируемого на плотной среде Вогеля

Время после воздействия, час Контроль Воздействие СаС12 10 мМ 20 мМ Ингибиция Стимуляция 20 мМ ЬаС13 10 мМ ЬаС13

24-й 0 0 0 0 0

48-й 2.6 ± 0.08 2.6 ± 0.07 2.4 ± 0.06 1.0 0

72-й 6.0 ± 0.10 6.0 ± 0.08 5.0 ± 0.07 17.0 0

96-й 8.0 ± 0.11 9.0 ± 0.09 7.0 ± 0.09 13.0 12.5

120-й 13.0 ± 0.10 15.0 ± 0.11 10.0 ± 0.09 14.0 15.3

144-й 18.0 ± 0.13 21.0 ± 0.12 14.0 ± 0.11 23.0 11.6

168-й 23.5 ± 0.17 28.5 ± 0.19 17.5 ± 0.13 25.6 12.1

192-й 28.4 ± 0.19 33.5 ± 0.17 19.5 ± 0.13 31.5 11.9

Результаты представляют собой среднее ± стандартная ошибка.

Контроль - клетки подвергнуты механическому воздействию.

Ингибиция, стимуляция роста колонии в % по отношению к контролю, принятому за 100%.

Скорость разрастания колоний микромицета - радиус (мм).

нарушениями гомеостаза ионов кальция внутри гифов микромицета, сопряженными с изменением физиологического состояния клеток.

Дальнейшие исследования роста и развития А. ам>ашоп показали замедление процесса спорообразования у микромицета, что коррелирует с уменьшением скорости разрастания колоний приблизительно на 30%. Очевидно, угнетение роста и спорообразования у А. ам>ашоп возрастающими концентрациями лантана (20 мМ) можно объяснить токсичностью ЬаС13 для клеток [10], обусловленной возникновением вторичной «Са2+-вспышки», и сохранением длительное время кальция в клетке на более высоком уровне, чем в норме.

Следующим Са -блокатором, использованным в экспериментах был КР4, который, как было показано на примере и. шaydis, действует аналогично хелато-рам (БОТА) и ингибитору Са -канала (Cd )[19]. Отметим, что показатели 1С50 для КР4 выражены в мкМ, в отличие от 1С50 для ЬаС13, который дан в мМ. В этой связи представляется вполне вероятным, что КР4 проявляет более высокую специфичность для Са -каналов, чем ЬаС13. Тем не менее в результате воздействия на микромицет не было обнаружено заметного влияния этого препарата на скорость разрастания колоний и на спорообразование ни в одной из исследованных (0.4 и 5.4 мкМ) концентраций, хотя наши данные люминометрических опытов выявили способность КР4 в зависимости от дозы ингибировать кальциевый ответ на осмотический шок и внесение в среду высоких концентраций СаС12, что сопровождалось уменьшением амплитуды Са вспышки и увеличением продолжительности периода восстановления Са2+ до нормального уровня.

Под действием препарата ВАРТА (1 мМ) скорости разрастания колоний и образования спор у А. awaшori не отличались от контроля, но при увеличении его концентрации до 5 мМ резко замедлялось разрастание колоний микромице-та: через 24 ч скорость их роста составляла 25-30%, через 192 ч - 18-20% от контроля, принятого за 100%. Угнетение роста микромицета коррелирует со способностью ВАРТА (Са2+-хелатор) в дозе 5 мМ полностью ингибировать Са2-ответ микромицета на механическое воздействие и осмотический шок [1].

Суммируя результаты, описанные в данной работе, можно сделать следующие выводы.

• Физико-химические методы воздействия (механическая стимуляция, ги-поосмотический шок и высокая концентрация внеклеточного СаС12), которые вызывали кратковременные повышения уровня Са2+ в клетках микромицета, не оказывали влияния на скорость разрастания колоний, спорообразование и морфологию гифов.

• Такие Са2-антагонисты, как La3+ и препарат ВАРТА, ингибирующие кальциевый ответ микромицета на физико-химические стимулы, в высоких концентрациях ингибировали процессы спорообразования и роста колоний микромицета.

• Эффект подавления разрастания колоний микромицета и спорообразования мог быть обусловлен токсичностью высоких концентраций La3+ для клеток, обусловленной возникновением вторичной Са -вспышки, и сохранением длительное время кальция в клетке на более высоком уровне, чем в норме.

Summary

O.V. Kozlova, S.U. Egorov, F.G. Kuprianova-Ashina. Interrelation of Cellular and Calcium Responses of Aspergillus awamori to Influence of Ca2+ modulators.

Using the culture of Aspergillus awamori 66А with the recombinant Ca2+-dependent photosensitive protein-aequorin, the cellular response to stressful influences (increasing the level of CaCl2 in a medium, hyposmotic and mechanic shock) connected with the insignificant increase of hyphae’s branching from the sprout tubule of micromyces was studied. The influence on the growth of colonies and sporulation of A. awamori by a number of pharmacological preparations that stimulate or inhibit Ca2+-signal systems was also investigated. It was discovered that Ca2+-antagonists (La3+ and BAPTA) in their high concentrations (20 and 5 mM) suppress the growth of colonies and sporulation of A. awamori in contrast to KP4 that has no influence on these parameters.

Key words: stressful influences, micromyces Aspergillus awamori 66A, hyphae’s branching, pharmacological preparations, Ca2+ -antagonists (La3+ and BAPTA).

Литература

1. Rasmussen H., Barret P.Q. Calcium messenger system an integrated view// Physiol. Rev. -1984. - V. 64, No 1. - P. 938-984.

2. Gadd G.M. Signal transduction in fungi // Gow N.A.R., Gadd G.M. (eds.) The Growing Fungus. - London: Champan & Hall, 1995. - P. 183-210.

3. Мулюкин А.Л., Демкина Е.В., Козлова Ф.Н. и др. Синтез аутоиндукторов анабиоза у неспорообразующих бактерий как механизм регуляции их активности в почве и подпочвенных осадочных породах // Микробиол. - 2001. - Т. 70, № 5. - С. 620-628.

4. Schmid J., Harold F. Dual role for calcium ions in apical growth of Neurospora crassa // J. Gen. Microbiol. - 1988. - V. 134. - P. 2623-2631.

5. Jackson S.L., Heath L.B. Effects of exogenous calcium ions on tip growth, intracellular Ca2+ concentration, and actin arrays in hyphae of the fungus Saprolegnia ferax // Ex-perim. Mycolog. - 1989. - V. 13, No 1. - P. 1-12.

6. Hudecova D., Varecka L., Vollek V., Betina V. Growth and morphogenesis of Botrytjs cinerea. Effects of exogenous calcium ions, calcium channel blockers and cyclosporin A // Folia Microbiol. - 1994. - V. 39, No 4. - P. 269-275.

7. Козлова О.В., Егоров С.Ю., Куприянова-Ашина Ф.Г., Ник Рид, Эль-Регистан Г.И. Анализ Са2+-ответа мицелиальных грибов на внешние воздействия с использованием рекомбинантного экворина // Микробиол. - 2004. - Т. 73, № 6. - С. 734-740.

8. Nelson G. Development of the recombinant aequorin method and its evaluation for cal-

cium measurements in filamentous fungi: Ph.D. thesis. - Edinburgh: University of Edinburgh, 1999.

9. Vogel H.J. A convenient growth medium for Neurospora (Medium N) // Microbial. Gen. Bull. - 1956. - V. 51. - P. 107-124.

10. Corzo A., Sanders D. Inhibition of Ca2+ uptake in Neurospora crassa by La3+: a mecha-

nistic study // J. Gen. Microbiol. - 1992. - V. 138, No 9. - P. 1791-1795.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

11. Gibbon B.C., Kropf D.L. Cytosolic pH gradients associated with tip growth // Science. -1994. - V. 263. - P. 1419-1421.

12. Batiza A.F., Schulz T., Masson P.H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse // J. Biol. Chem. - 1996. - V. 271, No 38. - P. 23357-23362.

13. Koltin K., Day R.P. Specificity of Ustilago maydis killer proteins // Appl. Microbiol. -1975. - V. 30, No 4. - P. 694-696.

14. Sanders D., Brownlee C., Harper J. Communicating with calcium // Plant Cell. - 1999. -V. 11, No 4. - P. 691-706.

15. Мулюкин А.Л., Сорокин В.В., Лойко Н.Г., Сулима Н.Е., Дуда В.И., Воробьева Е.А., Эль-Регистан Г.И. Сравнительное изучение элементного состава вегетативных и покоящихся клеток микроорганизмов // Микробиол. - 2002. - Т. 71, № 1. - С. 37-48.

16. Феофилова Е.П. Биохимическая адаптация грибов к температурному стрессу // Микробиол. - 1994. - Т. 63, № 5. - С. 757-773

17. White P.J. Calcium channels in higher plants // Biochim. Biophys. Acta. - 2000. -V. 1465, No 1-2. - P. 171-189.

18. Johannes E., Brosnan J.M., Sanders D. Calcium channels and signal transduction in plant cells // BioEssays. - 1991. - V. 13. - P. 331-336.

19. Gage M.J., Bruenn J., Fischer M., Sander D., Smith T.J. KP4 fungal toxin inhibits growth in Ustilago maydis by blocking calcium uptake // Mol. Microbiol. - 2001. -V. 41, No 4. - P. 775-785.

Поступила в редакцию

11.09.08

Козлова Ольга Владимировна - кандидат биологических наук, научный сотрудник кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: [email protected]

Егоров Сергей Юрьевич - доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: [email protected]

Куприянова-Ашина Флера Гарифовна - доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: [email protected]

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.