CC BY
102
_____________УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Том 153, кн. 1 Естественные науки
2011
УДК 582.282.22.083.3
ИЗМЕНЕНИЯ РОСТА Aspergillus awamori И СОДЕРЖАНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ В ОТВЕТ НА ВОЗДЕЙСТВИЕ АМФОТЕРИЦИНОМ
А.А. Абдельрахман, О.В. Козлова, Д.И. Тазетдинова,
Ф.К. Алимова, Ф.Г. Куприянова-Ашина
Аннотация
В экспериментах с мутантным штаммом Аspergillus dwdmon 66 А, содержащим рекомбинантный Са2+-зависимый фоточувствительный белок - экворин, изучены клеточный и Са2-ответы на воздействие пермеабилизирующего фунгицида - амфотерицина В. Клеточный ответ фиксировали по изменениям роста и развития микромицета (инициация прорастания спор, разрастание мицелия, интенсивность спорообразования). Инкубирование спор A. awamori (24 ч, 30 °С) в жидкой среде Вогеля, содержащей амфоте-рицин в конечных концентрациях 2.5, 5.0, 10 мкМ, приводило к 2-3-кратному увеличению количества спор с ростковой трубкой по сравнению с контрольным вариантом (среда без фунгицида). С увеличением концентрации фунгицида до 20 мкМ число спор с проростковой трубкой оставалось на уровне контрольного варианта. Дозозависимый эффект амфотерицина был выявлен у А. awamori также в процессах разрастания мицелия и спорообразования при культивировании микромицета на плотной среде Вогеля. Изменения содержания внутриклеточного Са2+ в ответ на действие амфотерицина регистрировали методом рекомбинантного экворина по интенсивности люминесценции фотобелка экворина, экспрессированного в микромицет A. аwamori. Величина испускаемого света экворина коррелировала с уровнем цитозольного свободного Са2+. Показано, что сразу после внесения в клеточную взвесь высоких концентраций (10, 20 мкМ) фунгицида, в отличие от контроля и действия малых доз (2.5, 5.0 мкМ) этого антибиотика, в клетках А. awamori возникают кальциевые вспышки. Повышенный уровень внутриклеточного Са2+ не снижался до исходного на протяжении всего периода исследования и коррелировал с угнетением роста и развития гриба.
Ключевые слова: Аspergillus аwamori, рекомбинантный экворин, пермеабилизи-рующий фунгицид амфотерицин В, клеточный ответ, спорообразование, Са2-ответ, динамика Са2+.
Введение
Одним из важных направлений по ограничению развития патогенных мик-ромицетов, контаминирующих семена растений, является разработка биологических методов защиты растений. Так, в литературе имеются сведения [1], что обработка семян ячменя препаратами микробного происхождения приводит к снижению количества фитопатогенных микромицетов, хотя частота встречаемости сапротрофных грибов рода Aspergillus остается высокой, что может быть обусловлено как спорулирующим потенциалом, так и высокой антагонистической активностью гриба. Среди микромицетов рода Aspergillus присутствуют
микотоксичные и потенциально патогенные для человека виды. Многие виды Aspergillus вырабатывают микотоксины - вторичные метаболиты, обладающие токсическим, канцерогенным, мутагенным действием на организм человека и животных. Некоторые виды аспергилл продуцируют афлатоксины, оказывающие фитотоксический эффект в отношении вегетирующих растений. При действии на человека, особенно на детей, афлатоксины оказывают гепатотоксическое действие, угнетают физическое и умственное развитие, снижают общую жизнестойкость организма [2].
Высокая токсичность грибов рода Aspergillus и выраженная устойчивость к обработке различными противогрибковыми препаратами обусловливает поиск новых биологически активных веществ, способных полностью подавлять развитие аспергилл. Особый интерес в этом плане представляет амфотерицин В. Этот препарат, являясь представителем полиеновых антибиотиков, эффективный в отношении многих патогенных грибов, возбудителей различных заболеваний, в том числе не поддающихся лечению другими противогрибковыми препаратами [3], может оказаться перспективным в качестве противогрибкового средства в отношении аспергилл.
Как любое воздействие на клетку, эффект амфотерицина на микромицет A. аwamori является стрессорным. Для адекватного реагирования на действия стрессоров про- и эукариотные организмы выработали ряд внутриклеточных сигнальных систем. Универсальной молекулой сигнальных систем в клетке является кальций, осуществляющий процессы трансдукции различных внешних стимулов [3, 4]. Возникающие в ответ на внешние воздействия Са -вспышки оказывают влияние на такие физиологические процессы как рост и деление клетки, образование покоящихся форм у микроорганизмов, апоптоз у многоклеточных организмов. Вместе с тем в литературе имеются лишь единичные сообщения относительно участия Са2+ в регулировании процессов роста гиф и ветвления мицелия микроскопических грибов [5, 6]. Одной из причин этого было отсутствие практичных и надежных методов мониторинга внутриклеточных свободных ионов кальция в живых клетках. Широкие возможности регистрации изменений Са2+-ответа на внешние воздействия были получены при использовании в качестве тест-объекта мутантного штамма Аspergillus аwamori 66А с экспрессированным белком - экворином, эмиссия фотонов которого зависит от концентрации внутриклеточного Са2+.
Цель настоящей работы - оценка взаимосвязи роста А. awamori и содержания ионов кальция в цитозоле гриба рода Аspergillus, подвергнутого воздействию пермеабилизирующего фунгицида - амфотерицина В.
Материалы и методы
Объектом исследования был мутантный штамм Аspergillus аwamori 66А, трансформированный с помощью экворина, любезно предоставленный лабораторией исследования клеток микромицетов Эдинбургского университета [7].
А. аwamori культивировали при 30 °С в жидкой среде Вогеля с добавлением сахарозы (среда ВС) и на плотной среде (2%-ный агар) того же состава, обогащенной глюкозой (среда ОСГ) [8]. Эксперименты проводили на моноспоровой культуре А. аwamori, для получения которой готовили конидиальную суспензию
гриба с титром 20-30 спор/мл среды Вогеля. На поверхности жидкой среды гриб рос в виде отдельных микроколоний, которые через 24 ч инкубации переносили на плотную среду Вогеля. После 7-суточного выращивания при 30 °С споры с поверхности агаризованной среды смывали 0.8%-ным раствором NaCl (FZ), отмывали от среды и остатков мицелия центрифугированием (3000 g, 15 мин), ресуспендировали в (FZ) и хранили при 4 °С. Концентрацию спор определяли подсчетом в камере Горяева. Плотность взвеси спор, используемой в опытах составляла 300000 спор/мл.
В качестве фунгицида использовали амфотерицин В (фирма Sigma, США), синонимы антибиотика: Amfostat, Amphotericin B, Fungilin, Fundizone и др. [3]. Влияние антибиотика на размножение клеток А. аwamori учитывали при его действии в разные фазы роста гриба.
Начало прорастания спор А. owamori под действием амфотерицина определялось по скорости их набухания и количеству спор с ростковой трубкой. Набухание спор анализировали в капле жидкой среды Вогеля (10 мкл) на стекле при концентрации 300000 спор/мл и содержании амфотерицина в каждой пробе 2.5, 5.0, 10, 20 мкМ. Во избежание высыхания среды стекла со спорами помещали во влажную камеру (100%-ная влажность) и выдерживали при 30 °С в течение 6 ч. В опытном и контрольном (среда без фунгицида) вариантах через каждые 2 ч с помощью окуляр-микрометра измеряли диаметр спор (d, мкм) на микроскопе Zeiss Axioskop 40 (фирма Carl Zeiss, Германия).
Прорастание спор исследовали при их инкубации (30 °С) в жидкой среде Вогеля в пробирках. Концентрация спор в каждой пробирке достигала 300000/мл, содержание амфотерицина соответствовало 2.5, 5.0, 10, 20 мкМ. В течение 24часовой инкубации регистрировали количество спор с проростковой трубкой (начало лаг-фазы) и определяли ветвление ростковой трубки (начало экспоненциальной фазы). Количество спор с ростковой трубкой и ответвления гиф от главной проростковой трубки подсчитывали в камере Горяева в 20 полях зрения. В контрольном варианте в споровую суспензию добавляли растворитель амфотерицина (дистиллированная вода).
О действии фунгицида на экспоненциальный рост А. аwamori судили по степени разрастания мицелия на плотной среде Вогеля (радиус колонии, мм). Для этого споры (300000 спор/мл) инкубировали в жидкой среде в течение 24 ч (начало фазы экспоненциального роста). В суточную культуру добавляли ам-фотерицин в разных концентрациях (2.5, 5.0, 10, 20 мкМ) и дополнительно растили ее в течение 24 ч. Затем культуру А. owamori (0.1 мкл) пересевали на агари-зованную среду по краю чашки Петри и выращивали при 30 °С в течение 7 сут. Радиус колонии миромицета на агаре измеряли через каждые 24 ч и высчитывали общую и удельную скорости роста гриба по методу [9].
При изучении влияния амфотерицина на спороношение растущей культуры А. awamori были соблюдены те же условия эксперимента, что и при регистрации разрастания колоний микромицета под действием этого фунгицида. Споры А. awamori, предварительно инкубированные (24 ч, 30 °С) в пробирках со средой Вогеля, содержащей амфотерицин (2.5, 5.0, 10, 20 мкМ), высевали (0.1 мкл) на плотную среду Вогеля. Через каждые 24 ч в процессе 7-суточного роста гриба вдоль линии окружности колонии лабораторным сверлом вырезали блоки
агаровой культуры, которые помещали в жидкую среду, и для освобождения спор встряхивали культуру на качалке (200 об./мин). Количество спор в определенном объеме взвеси подсчитывали в камере Горяева.
Влияние амфотерицина на содержание кальция в цитозоле А. аwamori определяли методом рекомбинантного экворина. Измерение концентрации кальция стало возможным благодаря использованию в работе мутантного штамма А. аwamori 66А с рекомбинантным геном медузы Aequorea victoria, ответственным за синтез Са2-зависимого фоточувствительного белка - экворина с молекулярной массой 21.400. Как известно [10], экворин состоит из одной полипеп-тидной цепи, апоэкворина, гидрофобного люминофора, коэлентеразина и связанного кислорода. В результате присоединения ионов кальция к двум из трех кальцийсвязывающих сайтов в экворине белок превращается в оксигеназу, которая катализирует окисление субстратного коэлентеразина с помощью связанного кислорода. Это приводит к люминесценции экворина (излучению голубого света, Amax = = 470 нМ), интенсивность которого зависит от концентрации свободных ионов кальция.
Измерение люминесценции экворина проводили в клетках культуры, которую выращивали в жидкой среде Вогеля в 96-клеточной матрице. В каждую ячейку матрицы вносили 100 мкл суспензии спор с начальной концентрацией 500000 клеток/мл и инкубировали при 30 °С до достижения начала фазы экспоненциального роста (24 ч). Затем культуру А. awamori инкубировали в течение 4 ч с селентразином для восстановления экворина. После этого в каждую ячейку с культурой вносили амфотерицин в конечных концентрациях: 2.5, 5.0,
10, 20 мкМ. В контрольные образцы вносили в тех же объемах растворитель антибиотика. Измерения на данном этапе скрининга осуществлялись за 10 мин.
Эмиссию света измеряли с помощью люминометра, выражая ее в относительных световых единицах (ОСЕ). Поскольку эмиссия света очень невелика, для ее измерения использовали специальный люминометр (Microlumat LB 96P, EG&G Berthold, Германия), оснащенный фотоумножителем. В экспериментах условия инкубации культуры А. аwamori 66А были такими же, как описано [11].
При обработке полученных результатов применяли метод вариационностатистического анализа с использованием критерия достоверности P < 0.05.
Результаты и их обсуждение
При исследовании влияния амфотерицина на прорастание спор и рост культуры А. аwamori прежде всего была подобрана их оптимальная концентрация, которая составляла 300000 спор/мл жидкой среды Вогеля. Использование суспензии спор более высокой плотности затрудняло проведение эксперимента вследствие агломерации спор и образования сложной сети из переплетенных гиф при их прорастании.
Действие амфотерицина на А. аwamori исследовали с учетом известных данных, что высокие концентрации антибиотика оказывают бактерицидное действие, а при средних дозах его наблюдается бактериостатическое действие, когда блокируются функции размножения клетки при сохранении ее жизнеспособности. Относительно низких концентраций антибиотиков имеются данные о ростостимулирующем действии их на клетку [12]. В соответствие с изложенным
Рис. 1. Динамика изменения размера спор A. аwamori при инкубации в среде Вогеля, содержащей разные концентрации амфотерицина: к - среда без фунгицида; оп - варианты опыта с фунгицидом в дозах 20 (а), 10 (б), 5.0 (в), 2.5 мкМ (г)
при подборе дозы амфотерицина исследовали его фитотоксический эффект на зернах ячменя (сорт Зазерский-85). После обработки предварительно замоченных семян ячменя амфотерицином в разных концентрациях регистрировали энергию прорастания и всхожесть зерен контрольного (необработанных антибиотиком зерен) и опытного вариантов. Согласно полученным результатам, максимальная доза амфотерицина, при которой рост зерна не угнетался, составляла
2.5 мкМ. По данным литературы [12], низкие стимулирующие концентрации антибиотика в 2-10 раз меньше величины бактерицидной дозы. Поэтому при изучении фунгицидного действия амфотерицина на микромицет A. аwamori в экспериментах использовали этот антибиотик в дозах: 2.5, 5.0, 10 и 20 мкМ.
О влиянии амфотерицина на первый этап прорастания спор A. аwamori в жидкой среде Вогеля судили по изменению их объема в результате набухания. Обычно набухание спор происходит вследствие превращений эндогенных
Рис. 2. Споры Л. аwamori с проростковой трубкой через 12 ч инкубации в жидкой среде Вогеля. Изображение на светлом фоне, полученное с помощью 40-кратного сухого объектива. Штрихравен 10 мкм. Стрелками обозначены ростковые трубки от спор
320 • 2 300 ■ О 280 ■ ^ 260 -2 240 • ^ 0 220 ‘ 1 3 1 1 4 р
с£ 3 200 -= £ 180 -^ 5 160 - 3 о 3 5 140 ■ о. і 120 • О О. С ЮО -§ 80 • 1 2
5 40 - =: О 20 -О - - 20 лмфоті 1 ю їриц . ИМ, МКІ 5 VI . 2.5
Рис. 3. Влияние амфотерицина на прорастание спор в жидкой среде Вогеля: 100% -количество проросших спор в контроле (среда без фунгицида); 1, 2, 3, 4 - количество спор с ростковой трубкой через 24 ч инкубации в среде с амфотерицином
и экзогенных субстратов и начальных процессов метаболизма. Было установлено, что на протяжении 6-часовой инкубации в среде с амфотерицином (опыт) изменение размера спор зависело от концентрации фунгицида. В отличие от контроля (среда без фунгицида), амфотерицин в дозах 2.5 и 5.0 мкМ через 2 ч инкубации стимулировал увеличение диаметра спор на 40% и 20% соответственно. Вместе с тем более высокое содержание фунгицида в среде (10, 20 мкМ) подавляло процесс набухания спор. Наиболее четко ингибирующий эффект амфотерицина в дозе 20 мкМ был выражен через 2 ч инкубации, который составлял 91.5% от контроля, принятого за 100%. К концу периода исследования (6 ч) эффект ингибиции нивелировал (рис. 1, а). При инкубации спор в среде с амфотерицином в дозе 10 мкМ ингибирующее действие фунгицида сохранялось до конца эксперимента (рис. 1, б).
Рис. 4. Стимуляция образования ветвей от ростковой трубки амфотерицином в концентрациях 2.5 и 5.0 мкМ. Изображение на светлом фоне, полученное с помощью 40-кратного сухого объектива. Штрих равен 10 мкм. Стрелками обозначены главная и дополнительная ростковые трубки от споры; 1-9 - ветви от главной ростковой трубки
На следующем этапе исследований с помощью микроскопии было установлено, что в контроле через 12 ч инкубации спор А. ам>атоп в жидкой среде Вогеля появляются споры с проростковой трубкой (рис. 2).
Вместе с тем в опытных вариантах прорастание спор зависело от концентрации амфотерицина в среде. Так, фунгицид в количестве 20 мкМ угнетал образование ростковых трубок у спор на 10% в сравнении с контролем, принятым за 100%. С уменьшением количества фунгицида в среде до 10 мкМ процесс прорастания спор ускорялся в два раза в сравнении с контролем. При добавлении в среду фунгицида в концентрациях 2.5 и 5.0 мкМ стимулирующий эффект возрастал в три раза (рис. 3). Таким образом, выявлен дозозависимый эффект фунгицида при действии его на А. ам>атоп на этапе прорастания спор.
В связи с установленным фактом стимуляции прорастания спор микромицета малыми дозами фунгицида на следующем этапе исследований определяли влияние амфотерицина на культуру в начале экспоненциальной фазы роста. В экспериментах споры инкубировали в жидкой среде Вогеля в течение 24 ч, то есть до начала экспоненциальной фазы роста. Затем в культуру вносили фунгицид в конечных концентрациях 20, 10, 5.0, 2.5 мкМ и через 6, 12, 18, 24 ч подсчитывали число ветвей гиф, образующихся от главной (самой длинной) проростковой трубки в микроколониях. Отмечено, что с увеличением времени инкубации как в контроле, так и в опыте возрастало число спор с ответвлениями от ростковой трубки. При этом амфотерицин только в низких концентрациях (2.5 и 5.0 мкМ) стимулировал образование ветвей от ростковой трубки (рис. 4.)
Стимуляция образования боковых гиф от ростковой трубки А. ам>атоп под действием низких концентраций амфотерицина подтверждена данными табл. 1. Как оказалось, после 12-часовой инкубации спор в жидкой среде с фунгицидом
Табл. 1
Динамика ветвления гиф в микроколониях А. ам>атоп после воздействия амфотерицина на 24-часовую культуру
Количество ветвей в микроколонии
Время действия фунгицида, ч Контроль* Опыт, среда с фунгицдом
20 мкМ 10 мкМ 5 мкМ 2.5 мкМ
0 1.13 ± 0.05 1.16 ± 0.07 1.16 ± 0.07 1.13 ± 0.05 1.15 ± 0.06
6 3.50 ± 0.50 3.10 ± 0.50 3.60 ± 0.50 4.60 ± 0.50 5.10 ± 0.50
12 4.60 ± 0.80 3.40 ± 0.70 4.70 ± 0.30 5.70 ± 0.60 6.40 ± 0.70
18 5.90 ± 1.00 3.90 ± 0.80 4.90 ± 0.40 6.40 ± 0.80 7.60 ± 1.20
24 6.60 ± 1.20 2.90 ± 0.40 4.70 ± 0.20 7.60 ± 1.00 8.90 ± 1.40
* Контролем служили клетки культуры, не подвергшиеся воздействию амфотерицина. Результаты представляют собой среднее + стандартное отклонение, п = 7.
количество гиф от ростковой трубки в контроле и опыте возрастало, что приводило к образованию сложной сети переплетения гиф. В связи с этим подсчет числа боковых гиф производили в предварительно разведенной культуре. Согласно данным табл. 1, после 24-часовой инкубации спор в присутствии фунгицида в больших дозах (10 и 20 мкМ) эффект ингибиции ветвления составлял соответственно 56% и 29% от контроля, принятого за 100%. Малые дозы амфотерицина (5.0 и 2.5 мкМ) стимулировали появление гиф на 15% и 35% в сравнении с контролем.
На следующем этапе работы исследовали влияние амфотерицина на процесс разрастания мицелия А. ам>атоп, о чем судили по величине растущей колонии (диаметр, мм) на агаризованной среде. В экспериментах на агаризованную среду Вогеля пересевали культуру, выращенную в течение суток в жидкой среде с добавленным антибиотиком в дозах 2.5, 5.0, 10 и 20 мкМ. Через каждые 24 ч роста микромицета на агаризованной среде в течение 7 сут определяли величину колонии, по которой судили о скорости разрастания мицелия А. ам>атоп. Эксперименты проводили трехкратно по 6 чашек в каждом варианте опыта (рис. 5, фото чашки). Из рис. 5 видно, что после 7-суточного культивирования размер колоний микромицета (диаметр, мм), подвергнутого действию фунгицида в дозах
2.5 и 5.0 мкМ, превышал величину колоний контрольного варианта, в то время как под действием амфотерицина в концентрациях 10 и 20 мкМ колонии были меньшего размера, чем в контроле. Полученные данные свидетельствуют о подавлении процесса разрастания мицелия большими дозами фунгицида, в отличие от малых концентраций, стимулирующих рост колоний А. ам>атоп.
Изучение динамики изменения размера колоний показало (рис. 6), что на протяжении 7-суточного роста микромицета на агаризованной среде начиная со 2-х суток культивирования амфотерицин в больших дозах подавлял процесс разрастания мицелия на 20-30% в сравнении с контролем. Фунгицид в низких концентрациях стимулировал рост колонии в течение всего периода исследования. Наиболее выражен эффект малых доз фунгицида (превышение контрольного уровня на 60-40%) на протяжении первых суток роста культуры. Впоследствии эффект стимуляции снижался, но оставался до конца исследования на более высоком уровне, чем в контроле, что коррелирует с увеличением ветвления гиф под действием малых доз фунгицида.
10.0 мкМ амфотерицина 20.0 мкМ амфотерицина
Рис. 5. Влияние амфотерицина в разных концентрациях на разрастание мицелия А. см>атоп в плотной среде Вогеля
Рис. 6. Динамика роста колоний А. см>атогі (радиус, мм) на плотной среде после воздействия разных концентраций амфотерицина: 1, 2, 3, 4 - концентрация амфотерицина: 2.5, 5, 10, 20 мкМ соответственно. К - контроль (среда без амфотерицина), принятый за 100%
0.015 2-
Время.Час
Время,Час
Рис. 7. Изменение удельной скорости A. awamori в зависимости от концентрации амфо-терицина. log d -диаметр колонии в логарифмическом выражении. к - среда без фунгицида. а, б, в, г - концентрации фунгицида: 20, 10, 5.0, 2.5 мкМ соответственно
Анализируя полученные данные, следует отметить положительную корреляцию между увеличением диаметра колонии микромицета, индуцированным малыми дозами амфотерицина, и возрастанием удельной скорости роста культуры А. аwamori (рис. 7, в, г) до максимальных значений уже через 24 ч после посева микромицета на агаризованную среду, что характерно для экспоненциальной фазы роста культуры, когда удельная скорость роста достигает максимума. В вариантах опыта с высокими концентрациями фунгицида (рис. 7, а, б) удельная скорость роста культуры через 24 ч была ниже, чем в контроле (рис.
7, к), что свидетельствует об угнетении роста культуры А. аwamori большими дозами амфотерицина.
Табл. 2
Влияние амфотерицина на спорообразование в динамике роста культуры А. Ам>ашвгі
Количество спор (1-108 спор/мл)
Время действия фунгицида, ч Концентрация фунгицида, мкМ
Контроль 2G.GG m.GG 5.GG 2.5G
0 3.GG і G.5G З.Ш і G.G7 3.2G і G.G7 З.Ш і G.G5 3.3G і G.G6
24 3.2G і GJG 3.4G і G.5G 3.6G і G.5G 4.5G і G.5G 5,Ю і G.5G
48 4.GG і G.2G 3.6G і G.7G 4.Ю і G.3G 5.GG і G.6G 5.4G і G.7G
72 5.Ш і G.8G 3.9G і G.8G 4.9G і G.4G б.Ш і G.8G 6.6G ^.GG
96 5.7G і G.2G 4.4G і G.4G 4.7G і G.2G 6.6G і І.GG 6,9G і G.4G
120 б.Ш і G.8G 4.9G і G.4G 5.Ю і G.G7 7.Ю і G.6G 7.2G і G.2G
144 6.3G і G.5G 5.3G і G.2G 5.5G і G.m 7.6G і G.G5 7.8G і G.3G
168 б.5б і G.7G 5.6G і G.m 5.6G і G.G8 7.8G і G.G8 8.39 і G.W
0 - начальное время посева суспензии спор на плотную среду.
Контроль - культура, не подвергнутая воздействию фунгицида. Результаты представляют собой среднее + стандартное отклонение, п = 6.
Результаты изучения дозозависимого влияния амфотерицина на спорообразование А. ам>атоп, представленные в табл. 2, показали, что в динамике роста культуры контрольного и опытных вариантов количество спор к концу 7-х суток в культуре возрастает. Под действием больших доз амфотерицина (20 и 10 мкМ) спорообразование подавлялось в сравнении с контролем начиная со 2-х суток культивирования. Вместе с тем этот процесс стимулировался при уменьшении дозы антибиотика до 2.5 и 5.0 мкМ.
Таким образом, результаты наших исследований согласуются с данными литературы [12], позволившими признать, что эффект антибиотиков при действии на клетки про- и эукариот зависит от их концентрации. Если высокие концентрации оказывали фунгицидное, то низкие - стимулирующее действие на микробную клетку.
Одним из подходов к выяснению механизма действия пермеабилизирую-щего фунгицида на клетки А. ам>атоп является изучение проницаемости плазматической мембраны микромицета для ионов, в том числе ионов кальция. Нарушение ионного равновесия является одной из наиболее ранних реакций клетки на внешние воздействия. Кальций, осуществляющий процессы транс-дукции различных внешних стимулов, представляет особый интерес в области регуляции роста и развития микроорганизмов и их устойчивости к воздействию внешних факторов. Возникновение кальциевых вспышек в ответ на действие стрессоров, зачастую ведущих к нарушению ионного гомеостаза, отражается на активности таких физиологических процессов, как рост и деление клетки. Первичное увеличение концентрации кальция в цитозоле возникает вследствие его транспорта как из окружающей среды, так и из клеточных органелл, являющихся его резервуарами [13]. В связи с этим логично провести анализ изменения содержания кальция в цитозоле микромицета, подвергнутого воздействию амфотерицина В в тех же дозах, которые использовались при изучении ростовых процессов гриба.
Рис. 8. Влияние амфотерицина В на уровень цитозольного Са + в зависимости от примененной дозы. Результаты представляют среднее ± стандартная ошибка. ОСЕ - относительные световые единицы
Рис. 9. Влияние амфотерицина В на кинетику развития Са +-вспышки. Результаты представляют среднее ± стандартная ошибка. Измерения проводились с использованием протокола повторных измерений. Время одного цикла - 11.6 с
Исследование динамики изменения Са2+ в цитозоле А. ам>атоп при воздействии на микромицет амфотерицином в разных концентрациях показало, что уже 2 мкМ фунгицида индуцируют кальциевые вспышки в клетках аспергилла. С увеличением дозы пермеабилизирующиего фунгицида концентрация внутриклеточного кальция возрастает (рис. 8).
На рис. 9 видно, что после внесения в среду больших доз фунгицида (10-20 мкМ) кальциевый ответ развивался сразу, в то время как при низких концентрациях амфотерицина (2.5, 5.0) он формировался медленнее.
Значительное как по величине, так и продолжительности изменение пула внутриклеточного кальция, возможно, обусловлено тем, что клетки микроми-цета не справлялись с функцией восстановления исходного уровня Са2+ в результате резко повышающейся проницаемости плазматической мембраны под действием высоких концентраций пермеабилизирующего фунгицида. Поскольку высокие концентрации Са2+ токсичны для клетки вследствие взаимодействия кальция с фосфатсодержащими соединениями [14], можно было ожидать, что именно нарушение Са2+-гоместаза, вызванного воздействием на клетки ам-фотерицина, является основной причиной ингибирования роста культуры А. ам>атоп большими дозами пермеабилизирующего фунгицида.
Summary
A.A. Abdelrakhman, O.V. Kozlova, D.I. Tazetdinova, F.K. Alimova, F.G. Kupriyanova-Ashina. Changes in Growth Patterns and Concentrations of Intracellular Calcium of Aspergillus awamori Treated with Amphotericin B.
This study describes effects of permeabilizing fungicide Amphotericin B on changes in growth patterns and intracellular calcium concentration in the cells of Aspergillus awamori transformed with the recombinant aequorin gene. Changes in growth and development of the fungus were investigated using the following parameters: spore germination, mycelial growth and intensity of sporulation. Incubation of A. awamori spores (24 h, 30 °C) in liquid Vogel’s medium containing 2.5, 5 and 10 цМ of Amphotericin B resulted in 2-3 times increase in the number of germinated spores compared with a control medium not containing Amphotericin B. At 20 цМ of Amphotericin B the number of germinated spores was the same as in the control. Amphotericin B also had a dose-dependent effect during the mycelia growth and sporulation when cultivated on solid Vogel’s medium.
The changes in intracellular Ca2+ concentrations under the effects of Amphotericin B were also analysed by monitoring the luminescence of the photoprotein aequorin. It was demonstrated that additions of high concentrations of Amphotericin B (10 and 20 цМ) caused instantaneous increases in the [Ca2+]c compared with the lower concentrations (2.5 and 5 цМ) and control. The level of [Ca2+]c remained elevated for the length of the experiments and correlated with the inhibition of mycelia growth and development.
Key words: Aspergillus awamori, recombinant aequorin, permeabilizing fungicide Amphotericin B, cell response, sporulation, Ca2+ signaling, Ca2+ dynamics.
Литература
1. Маликова А.Р., Алимова Ф.К., Захарова Н.Г., Егоров С.Ю. Исследование микрофлоры пивоваренного ячменя, используемого на АО «Красный Восток» // Нива Татарстан. - 2000. - № 5-6. - С. 32-33.
2. Монастырский О.А. Токсины фитопатогенных грибов // Защита растений. - 1996. № 8. - С. 12-14.
3. Медведев С. С. Кальциевая сигнальная система растений // Физиол. раст. - 2005. -Т. 52, № 2. - С. 282-305.
4. Bootman M.D., Cheek T.R., Moreton R.B., Bennet D.L., Berridge M.J. Smoothly graded Ca2+ release from inosistol 1,4,5-trisphosphate-sensitive Ca2+ stores // J. Biol. Chem. -1994. - V. 269, No 40. - P. 24783-24791.
5. Rao J.P., Reena G., Subramanyam C. Calmodulin-dependent protein phosphorylation during conidial germination and growth of Neurospora crassa // Mycolog. Res. - 1997. V. 101, No 12. - P. 1484-1488.
6. Pitt D., Barnes J.C. Calcium homeostasis, signalling and protein phosphorylation during calcium-induced conidiation in Penicillium notatum // J. Gen. Microbiol. - 1993. -V. 139, No 12. - P. 3053-3063.
7. Nelson G., Kozlova-Zwinderman O., Kollis A.G., Knight M.R., Fincham J.R.S., Stan-ger C.R., Renwick A., Hessing J.G.M., Punt P.J., van den Hondel C.A.M.J.J., Read N.D. Calcium measurement in living filamentous fungi expressing codon-optimized aequorin // Mol. Microbiol. - 2004. - V. 52, No 2. - P. 1437-1450.
8. Vogel H.J. A convenient growth medium for Neurospora (Medium N) // Microbiol. Genet. Bull. - 1956. - V. 13. - P. 42-43.
9. Билай В. И. Определение роста и биосинтетической активности грибов // Методы экспериментальной микологии: справ. - Киев: Наукова думка, 1982. - С. 138-152.
10. Knight M.R., Campbell A.K., Smith S.M., Trewavas A.J. Recombinant aequorin as a probe for cytosolic free Ca2+ in Escherichia coli // FEBS Lett. - 1991. - V. 282, No 2. -P. 408-405.
11. Козлова О.В., Егоров С.Ю., Куприянова-Ашина Ф.Г., Ник Рид, Эль-Регистан Г.И. Анализ Ca^-ответа мицелиальных грибов на внешние воздействия с использованием рекомбинантного экворина // Микробиол. - 2004. - Т. 73, № 6. - С. 734-740.
12. Шигаева М.Х., Ахматуллина Н.Б., Джангалина Н.К., Мустафин К.Г. Стимуляция жизнедеятельности микроорганизмов и вирусов. - Алма-Ата: Наука, 1986. - 184 с.
13. Крутецкая З.Н., Лебедев О.Е. Механизмы внутриклеточной сигнализации. - СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2003. - 208 с
14. Gadd G.M. Signal transduction in fungi // Gow N.A.R., Gadd G.M. (eds.) The Growing. Fungus. - London: Champan & Hall, 1995. - P. 183-210
Поступила в редакцию 10.12.10
Абдельрахман Атеф Абдельмохсен - аспирант кафедры биохимии Казанского (Приволжского) федерального университета, ассистент кафедры агрохимии факультета сельского хозяйства, Миниа университет, Эль-Миниа, Египет.
Е-таі1: atefnagi2000@yahoo.coш
Козлова Ольга Владимировна - кандидат биологических наук, научный сотрудник Эдингбургского университета, Англия.
Е-таі1: O.Kozlova@hw.ac.uk
Тазетдинова Диана Ирековна - кандидат биологических наук, ассистент кафедры биохимии Казанского (Приволжского) федерального университета.
Е-таі1: tazetdinova. di@gmail.com
Алимова Фарида Кашифовна - доктор биологических наук, заведующий кафедрой биохимии Казанского (Приволжского) федерального университета.
Е-таі1: farida_aliшova@hotшail.coш
Куприянова-Ашина Флера Гарифовна - доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник НИЛ ББФ кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.
Е-таі1: flera.ashina@ksu.ru
