CC BY
114
Литература
1. Визуальные методы дешифрирования / Т.В. Верещака, А.Т. Зверев, С.А. Сладкопевцев [и др.]. - М.: Недра, 1990. - 341 с.
2. Глушко, Е.В. Опыт применения системного подхода к изучению современных ландшафтов по космическим снимкам / Е.В. Гпушко // Исслед. Земли из космоса. - 1990. - №1. - С. 40-48.
3. Горшков, Г.П. Общая геология / Г.П. Горшков, А.Ф. Якушова. - М.: МГУ, 1973. - 592 с.
4. Кац, Я.Г. Основы космической геологии / Я.Г. Кац, А.В. Тевепев, А.И. Полетаев. - М.: Недра, 1988. - 235 с.
5. Мепуа, А.И. Космические природоохранные исследования / А.И. Мепуа. - Л.: Наука, 1988. - 175 с.
6. Незамов, В.И Аэрокосмические методы диагностики поврежденной растительности / В.И. Незамов. -Красноярск: Изд-во КГАУ, 2007. - 332 с.
7. Незамов, В.И. Космические методы в сельском хозяйстве / В.И. Незамов. - Красноярск: КГАУ, 2000. - 255 с.
8. Новиков, Ю.В. Экология, окружающая среда и человек / Ю.В. Новиков. - М.: ФАИР-ПРЕСС, 2002. - 560 с.
9. Рачкупик, В.И. Отражательные свойства и состояние растительного покрова / В.И. Рачкупик, М.В. Ситникова. - Л.: Гидрометеоиздат, 1981. - 287 с.
10. Реутов, Е.А. Экспериментальные исследования СВЧ-излучения засоленных почв / Е.А. Реутов, A.M. Шутко // Иссед. Земли из космоса. - l98o. - № 4. - С. 78-84.
11. Харин, Н.Г. Дистанционные методы и охрана природы пустынь / Н.Г. Харин. - М.: Наука. - 104 с.
12. Чешев, А.С. Основы землепользования и землеустройства / А.С. Чешев, В.Ф. Вапьков. - Ростов н/Д.: Март, 2002. - 544 с.
УДК 574: 579.29 В.Н. Торотенкова, Л.С. Тирранен, О.В. Сысоева
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ЧЕРЕЗ ПРОДУЦИРУЕМЫЕ ИМИ ЛЕТУЧИЕ ВЕЩЕСТВА*
В резупьтате исспедований взаимодействия микроорганизмов через продуцируемые ими петучие вещества обнаружена тенденция к снижению антагонистических отношений к концу эксперимента и росту допи нейтрапьных и попожитепьных действий, что свидетепьствует о стабипизации экосистемы. Выявпено, что гемопитической активностью обпадапи 19 % исспедованных штаммов, а коагупазной активностью -14 %.
Ключевые слова: экосистема, микроорганизмы, почвоподобный субстрат, взаимодействие, ингибирование, стимупяция, петучие метабопиты.
V.N. Torotenkova, L.S Tirranen, O.V. Sysoyeva MICROORGANISMS INTERACTIONS THROUGH THE VOLATILE SUBSTANCES PRODUCED BY THEM
As a result of research of the microorganisms interaction through the volatile substances produced by them, the tendency to the antagonistic relations decrease to the experiment end and growth of the share of neutral and positive actions that testifies to ecosystem stabilization is revealed. It is revealed that 19 % of the investigated strains possessed hematolytic activity, and 14 % possessed clotting activity.
Key words: ecosystem, microorganisms, soil similar substratum, interaction, inhibition, stimulation, volatile metabolites.
Введение. Микрофлора является неотъемлемой частью любой экосистемы. Микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности выделяют разнообразные продукты обмена.
Известно, что среди метаболитов, продуцируемых микроорганизмами, есть и летучие вещества [2; 8; 10]. Из-за своей летучести они обладают высокой скоростью распространения в окружающей среде, с их помощью может осуществляться дальнодействие микробных популяций в местах их естественного обитания, а также в условиях искусственного культивирования. При анализе условий сосуществования различных видов микроорганизмов в биоценозах необходимо учитывать взаимодействия через летучие вещества, которые присуще многим
* Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН при поддержке Международного гранта INTAS Ref. Nr. 05-1000008.
микроорганизмам и играют определенную экологическую роль, как в природных местообитаниях, так и в искусственных системах [12].
Цель исследований - оценить попарные взаимодействия микроорганизмов через продуцируемые ими летучие метаболиты.
Материалы и методы исследований. Объектом исследований служили культуры микроорганизмов, выделенные из естественно сложившейся микробной ассоциации раствора, использованного для выращивания разновозрастной поликультуры растений (чуфы, редиса и салата) на почво-подобном субстрате (ППС) [11].
Взаимодействия микроорганизмов через продуцируемые ими летучие метаболиты изучены на 11 штаммах, выделенных из фона, и 10 штаммах - в конце опыта (306-й день). Фоном служила микрофлора раствора на 66-й день эксперимента, когда в вегетационной камере присутствовали все возраста растений.
При изучении взаимодействия микроорганизмов через летучие метаболиты исключалось влияние прямого воздействия (через контакт) клеток микроорганизмов. Микроорганизмы выделяли и выращивали на пептонном агаре (ПА) (1 % пептона, 0,5 % ЫаО! на дистиллированной воде с 2 %-м агаром, pH 7,4).
Культуру, действие метаболитов которой изучали, далее именуем испытуемой, ту, на которой проверялось это действие, - тест-культурой. Все культуры поочередно исследовались и как испытуемые, и как тест-культуры.
Ранее нами разработан метод, позволяющий количественно оценить действие летучих биологически активных веществ, продуцируемых одним микроорганизмом, на рост другого [1; 12].
Сущность метода в том, что суспензией испытуемых культур засевали чашки Петри со средой и инкубировали в термостате. Суспензией тест-культур заполняли лунки станины репликатора (рис. 1). Затем с помощью ручки станины репликатора (рис. 1) делали реплики [9] до 50 тест-культур одновременно на поверхность незасеянной среды, разлитой мерно на дно чашек Петри.
Дно чашки Петри со средой и с газоном испытуемой культуры закрывали крышкой чашки Петри со средой и свеженанесенными методом реплик тест-культурами и инкубировали в термостате. Рост тест-организмов зависел от действия летучих метаболитов, которые продуцировала испытуемая культура, росшая на противоположной стороне чашки.
Рис. 1. Репликатор: вверху - ручка со штырьками; внизу - станина с лунками
Реакции тест-микробов на действие летучих метаболитов других культур оценивали на третьи сутки их совместного роста по разнице в диаметрах колоний тест-организмов в опыте и контроле. Контролем служили чашки с тест-культурами, не подвергавшиеся действию летучих продуктов жизнедеятельности испытуемых микроорганизмов.
Воздействие испытуемой культуры на тест-культуру оценивали как положительное (стимулирующее) или отрицательное (ингибирующее), когда размер тест-культур в опыте был соответственно достоверно увеличен или снижен по сравнению с контролем. Если размер колоний в опыте достоверно не отличался от контроля, действие испытуемой культуры оценивали как нулевое.
Изучение биологических свойств исследуемых микроорганизмов. Для определения гемолитической активности использовали кровяной агар, разлитый в чашки Петри [4; 6]. Посев проводили с использованием репликатора по описанной выше методике, затем инкубировали в термостате в течение 24 ч. Результаты учитывали путем измерения гемолитических зон вокруг колоний.
Для коагулазной пробы использовали сухую цитратную кроличью плазму, для чего содержимое ампулы (1г) разводили 1 мл стерильного физиологического раствора и разводили из расчета 1:5 тем же раствором. Полученный раствор разливали по 0,5 мл в стерильные тщательно вымытые пробирки и добавляли по
0,5 мл суспензии исследуемых микроорганизмов и перемешивали. В качестве контроля использовали пробирку с плазмой, не содержащую испытуемую культуру. Пробирки с исследуемыми культурами выдерживали в термостате при 37°С в течение суток. Через 3 и 24 ч учитывали свертывание плазмы и образование сгустков. Обычно культуры, активно продуцирующие коагулазу, дают положительную реакцию уже через 2-3 ч [7].
Статистическую обработку данных проводили по Г.Ф. Лакину [3]. Учитывали среднюю арифметическую величину диаметра колоний (X), ошибку средней арифметической (т). Критерием оценки служила стандартная величина нормированного отклонения (ктьюдента), с которой сравнивалось фактическое значение этого критерия разнос™) для 95-99,9% уровня значимости.
Результаты исследований и их обсуждение. В матрице взаимодействий размерности 21х21 экспериментально определены 441 достоверных действий, среди которых 64 (15%) - отрицательных, 62 (14%) -положительных и 315 (71%) - нейтральных. Фрагмент матрицы дан в табл. 1.
Таблица 1
Действие летучих метаболитов испытуемых культур, выделенных из раствора,
на рост тест-организмов
Испытуемая культура № тест-культур*
1 2 3 4 5 6 7
1. Pseudomonas putida - + - 0 - 0 0
2. Pseudomonas dacunhae - + - 0 - 0 0
3. Pseudomonas cerevisiae 0 + - 0 + 0 0
4. Achromobacter album - 0 - - 0 0 0
5. Staphylococcus tetragenus 0 0 - - 0 - 0
6. Pseudomonas longa - + - - 0 0 0
7. Achromobacter album - 0 - 0 - 0 0
Примечание. Действия достоверны: - - отрицательное; 0 - нейтральное; + - положительное; * - номера тест-культур совпадают с номерами испытуемых культур.
При изучении попарных взаимодействий через летучие метаболиты 11 испытуемых культур, выделенных в фоне, на рост тех же 11 тест-культур определены 121 действие, из которых 39 (32 %) - отрицательных, 31 (26 %) - положительных. Нейтральных действий было 51 (42 %).
При изучении попарных взаимодействий через летучие метаболиты 10 испытуемых культур, выделенных в конце опыта, на рост тех же 10 тест-культур экспериментально определено 100 действий, среди которых выявлено 25% отрицательных, 31% - положительных, 44 % - нейтральных действий.
Обнаружено, что большинство из исследованных культур продуцирует ингибирующие летучие вещества, а стимулирующее действие встречается реже. Установлено, что каждый штамм микроорганизмов обладает индивидуальным спектром действия на рост тест-культур. У некоторых культур спектры действия перекрывались, но никогда не совпадали.
Аналогично распределена и чувствительность культур к летучим метаболитам. Число ингибируемых культур выше, чем число стимулируемых. Спектры чувствительности микроорганизмов, как и спектры действия, могут перекрываться, но никогда не совпадают.
Полученные данные подтверждают вывод о том, что микроорганизмы продуцируют разные летучие вещества, и на тест-культуру действует не один метаболит, а несколько, что объясняет индивидуальность спектра действия и спектра чувствительности [12].
При анализе 210 попарных взаимодействий исследуемых микроорганизмов, исключая внутриштаммо-вые, найдены все шесть типов возможных взаимодействий, среди которых наиболее часто встречались «00» и «0-» (рис. 2).
0- -- 0 0 0+ -+ ++
Типы взаимодействий □ В целом по сообществу □ В фоне □ В конце опыта
Рис. 2. Распределение типов взаимодействия микроорганизмов через их летучие метаболиты
Обнаруженная тенденция к снижению антагонистических взаимоотношений к концу эксперимента и росту доли нейтральных и положительных действий по-видимому подтверждает высказывание Е. Одума о том, что отрицательные взаимодействия в биоценозах со временем становятся менее заметными, если экосистема достаточно стабильна и обеспечивает возможность взаимного приспособления популяций [5].
Биологические свойства микроорганизмов, выделенных из раствора. Замкнутая система жизнеобеспечения предполагает длительное пребывание в ней испытателей. Бурный рост численности микроорганизмов, опасных для человека или растений, может привести к нарушению работы экосистемы. В связи с этим необходимы исследования как состава микробиоты раствора, так и изучение биологических свойств доминирующих видов микроорганизмов, населяющих искусственную экосистему.
Биологические свойства исследуемых микроорганизмов изучены по наличию у них гемолитической и коагулазной активности. Гемолитическую активность учитывали по образованию зон гемолиза на кровяном агаре (табл. 2).
Таблица 2
Диаметр зон лизиса на кровяном агаре, мм
Культура Количество часов культивирования
14 24
Bacillus subtilis (2 штамма) 13 18
Bacillus brevis б 1G
Pseudomonas aeruginosa 4 19
Коагулазная активность (по свертыванию плазмы или образованию сгустков) обнаружена у трех культур - у двух штаммов Bacillus subtilis и Pseudomonas cerevisiae.
Таким образом, выявлено, что гемолитической активностью обладали 19 % исследованных штаммов, а коагулазной - 14 %. Только 2 штамма (оба Bacillus subtilis) могут представлять потенциальную опасность для испытателей, хотя отсутствуют литературные данные об их отрицательном влиянии на человека. Но для этого требуются дальнейшие исследования.
Выводы
1. Установлено, что спектры действия и спектры чувствительности микроорганизмов индивидуальны, перекрываются, но никогда не совпадают, что говорит о продукции микроорганизмами разных летучих веществ.
2. Обнаружена тенденция к снижению антагонистических отношений к концу эксперимента и росту доли нейтральных и положительных действий, что свидетельствует о стабилизации экосистемы.
3. Выявлено, что гемолитической активностью обладали 19 % исследованных штаммов, а коагулазной активностью - 14 %.
Литература
1. 1565882 А1; МКЛ С12 М 1/22. Устройство для выращивания микроорганизмов на агаризованных средах / В.И. Безруких, Л.С. Тирранен, Г.Д. Кропачев, М.М. Сатаров // Изобретения: Официальный патентный бюллетень. - 1990. - № 19.
2. Влияние уксусного альдегида и этилена на рост тест-культур микроорганизмов / Е.В. Бородина, Л.С. Тирранен, Г. Т. Титова [и др.] // Экология. - 1997. - №3. - С. 197-199.
3. Лакин, Г.Ф. Биометрия: учеб. пособие / Г.Ф. Лакин. - М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.
4. Мари, П.Р. Клиническая микробиология. Краткое руководство: пер. с англ. / П.Р. Мари, И.Р. Шей. - М.:
Мир, 2006. - 425 с.
5. Одум, E. Экология: пер. с англ. / Е. Одум. - М.: Мир, 1986. - Т 1. - 328 с.; Т. 2. - 376 с.
6. Практикум по микробиологии: учеб. пособие / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук [и др.]; под
ред. А.И. Нетрусова. - М.: Академия, 2005. - 608 с.
7. Смирнова, А.М. Микробиология и профилактика стафилококковых инфекций / А.М. Смирнова, А.А. Трояш-кин, Е.М. Падерина. - Медицина, 1977.
8. Volatile metabolites from microorganisms grown on humid building materials and synthetic media / A.S. Claeson, J.O. Levin, G. Blomquist // J. Environ. Monitor, 2002. - № 4 (5). - P. 667-672.
9. Miller, J. Experiments in molecular genetics / J. Miller. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1972. - 436 p.
10. Humphris, S.N. The effects of volatile microbial secondary metabolites on protein synthesis in Serpula la-
crymans / S.N. Humphris, A. Bruce, E. Buultjens // FEMS Microbiol. Lett. - 20O2. - № 210 (2). - P. 215-219.
11. Tikhomirov, A.A. Operation characteristics of the “SLS-Higher Plants” complex in the bioregenerative life support systems' structure / A.A. Tikhomirov, S.A. Ushakova, V.V. Velichko// Book of abstracts 17th IAA Humans in Space Symposium (June 7-11, 2009, Moscow). - M., 2009. - 140 p.
12. Tirranen, L.S. The role of volatile metabolites in microbial communities of the lSS higher plant link / L.S. Tir-
ranen, I.J. Gitelson // Adv. Space Res. - 2006. - Vol.38. - P. 1227-1232.
