CC BY
70
Литература
1. Лесотаксационный справочник для южно-таежных лесов Средней Сибири / С.Л. Шевелев, В.В. Кузьмичев, Н.П. Павлов, А.С. Смольенов. - М.: ВНИИЛМ, 2002. - 166 с.
2. Вайс, А.А. Особенности регрессионных линий ^.3=^) и ^=^1,3) для деревьев сосны среднетаежной зоны /А.А. Вайс. - Красноярск, 2005.
3. Об утверждении перечня лесорастительных зон и лесных районов Российской Федерации: пр. МПР РФ от 28 марта 2007 г. №68. - М., 2007. - 10 с.
4. Третьяков, Н.В. Справочник таксатора / Н.В. Третьяков, П.В. Горский, Г.Г. Самойлович. - Л.: Гослес-бумиздат, 1952. - 852 с.
5. Тихомиров, Б.Н. Таблицы для таксации сосновых древостоев бассейна р. Ангары / Б.Н. Тихомиров // Тр. Сибир. лесотехн. ин-та. - Вып. VII. - Красноярск, 1967. - С. 113-133.
6. Серяков, А.П. Сырьевые ресурсы пневого осмола и их таксация на вырубках среднетаежных сосняков Иркутской области: автореф. дис. ... канд. с-х. наук: 06.03.02 / А.П. Серяков. - Красноярск, 1987. - 20 с.
УДК 574: 579.29 Л.С. Тирранен, В.Н. Торотенкова
АУКСАНОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ*
Исследовано попарное взаимодействие 8 культур микроорганизмов методом агаровых пластинок с использованием репликаторов. Получено и оценено 48 действий, среди которых 90% отрицательных, 4% положительных, остальные были нулевыми.
Ключевые слова: микроорганизмы, взаимодействие, оценка, влияние, ингибирование, стимулирование.
L.S. Tirranen, V.N. Torotenkova AUXANOGRAPHIC TECHNIQUE OF THE QUANTITATIVE ESTIMATION OF THE INTERMICROBIC INTERACTIONS
Pairwise interaction of в microorganism cultures is researched by the agar plates technique with replicators use. 48 actions among which 90% is negative, 4% is positive, the others are zero are received and estimated.
Key words: microorganisms, interaction, estimation, influence, inhibition, stimulation.
Введение
В естественной среде обитания (почва, вода, растения) микроорганизмы существуют не изолированно друг от друга, а как сложные ассоциации [6; 11]. Сосуществование микроорганизмов в различных микробных ассоциациях определяется рядом параметров среды их обитания (температура, рН, аэрация, пищевые ресурсы и др.) и влиянием микробов друг на друга [13].
Внутри сложных ассоциаций, формируемых микроорганизмами в естественных и искусственных системах, складываются различные взаимоотношения [5, 9, 10]. В любом сообществе эти взаимоотношения сложны и многообразны. Изучение характера взаимоотношений микроорганизмов из определенной микробной ассоциации позволит прогнозировать, а также регулировать эти взаимоотношения в нужном направлении.
Взаимоотношения в микробном мире, кроме конкурентных трофических связей, проявляются и через метаболиты, продуцируемые микроорганизмами в процессе своей жизнедеятельности [1, 2]. Выделяемые микроорганизмами биологически активные вещества могут играть роль регулятора в микробных сообществах [13].
Цель работы - количественная оценка межмикробных взаимодействий с помощью ауксанографиче-ского метода.
* Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН при поддержке Международного гранта INTAS Ref. Nr. 05-1000008.
14O
Методика исследования
Объектом исследования служили восемь культур микроорганизмов, предоставленных сотрудниками лабораторий УБФ Института биофизики СО РАН и МНЦИЭСО при президиуме Красноярского научного центра СО РАН: Acinetobacter species 15-17, Alcaligenes species, Bacillus subtilis 2335/pBMB105, Bac. subtilis 2335, Bac. species, Escherichia coli K12, Flavobacterium species, Pseudomonas desmolyticum.
Метод исследования
Изучение действия суммы метаболитов, продуцируемых испытуемыми культурами, на рост тест-организмов. При изучении взаимодействий микроорганизмов большое внимание уделяется выбору метода исследований. Вопросы методического характера в значительной степени определяют успех всех дальнейших исследований.
Культура, действие метаболитов которой изучали, далее именуется испытуемой. Культура, на которой проверяли это действие, - тест-культурой. Каждая культура использовалась и в качестве испытуемой, и в качестве тест-культуры.
Для изучения взаимодействия микроорганизмов на твердых средах используют разнообразные методы [2, 4], из которых только один [7] - метод агаровых пластинок с использованием репликаторов (МАПР), позволяет количественно оценить действие суммы (летучих и нелетучих) биологически активных веществ, продуцируемых одним микроорганизмом, на рост другого. Остальные методы не позволяют количественно оценить полученные данные, что затрудняет проведение сравнительного анализа различных экспериментов [12].
Мы использовали ауксанографический метод, который, так же, как и другие, основан на диффузии в плотную среду метаболитов, образуемых в процессе жизнедеятельности испытуемой культурой. Но сущность метода другая, которая заключается в следующем.
Микроорганизмы выращивали на пептонном агаре: 1% пептона, 05% NaCl, 2% агар-агара, pH 7,2-7,4 [4]. Пептонный агар (ПА) разливали в стеклянные кольца, помещенные в чашки Петри (рис. 1).
Рис. 1. Стеклянное кольцо, помещенное в чашку Петри
После застывания питательной среды кольцо удаляли, а получившуюся пластинку переносили в чашку с предварительно разлитым мерно (по 30 мл) ПА. Таким образом, на одной чашке две агаровые пластинки располагались одна на другой (рис. 2).
1
2
Рис. 2. Чашка Петри с двумя агаровыми пластинками: 1 - верхняя пластинка; 2 - нижняя пластинка
Из 2-суточных испытуемых культур по стандарту мутности на 10 единиц готовили суспензию, 0,05 мл которой засевали газоном поверхность верхней пластинки и инкубировали 6 суток. В течение этого времени метаболиты испытуемой культуры диффундируют в нижнюю пластинку. Затем из чашки верхнюю пластинку с испытуемой культурой удаляли. Из 2-суточных тест-культур также по стандарту мутности готовили суспензию, которой пастеровскими пипетками заполняли лунки станины репликатора [8]. С помощью репликатора делали реплики в область, где ранее находилась пластинка с испытуемой культурой. Инкубировали при температуре 28 оС. Рост тест-организмов зависел от суммарного действия метаболитов, выделенных испытуемой культурой.
Реакции тест-культур на действие суммы метаболитов, продуцируемых испытуемой культурой, оценивали на 3 сутки по разнице в диаметрах колоний тест-организмов в опыте и контроле (рис. 3). Контролем служили чашки с тест-культурами, не подвергавшиеся действию продуктов жизнедеятельности испытуемых микроорганизмов.
Рис. 3. Рост тест-культур: слева - контроль; справа - опыт
Воздействие оценивали как положительное (стимулирующее) или отрицательное (ингибирующее), когда размер диаметра колоний тест-культур в опыте достоверно был увеличен или снижен по сравнению с контролем. Если размер колоний в опыте достоверно не отличался от контроля, действие испытуемой культуры оценивали как нулевое.
С помощью данного метода можно обнаружить не только антагонистов, но и микробов - стимуляторов роста. МАПР позволяет выразить полученные результаты в относительных единицах, что облегчает проведение сравнительных анализов, позволяет оценить достоверность результатов.
Статистическая обработка данных. Статистическая обработка проведена по Лакину [3]. Учитывались средняя арифметическая, ошибка средней арифметической. Критерием оценки служила стандартная величина нормированного отклонения (критерий Стьюдента), с которой сравнивалось фактическое значение этого критерия ((разности) для р<0,05; для р<0,01 и для р<0,001.
Результаты исследований и их обсуждение
При изучении попарных взаимодействий микроорганизмов через сумму продуцируемых испытуемыми культурами метаболитов выявлено, что большинство из исследованных культур выделяет ингибирующие летучие вещества, а стимулирующее действие встречается реже (рис. 4). Из 48 экспериментально исследованных взаимодействий получено достоверных 43 (90%) отрицательных действия; 2 (4%) достоверных действия были положительными, остальные 3 (6%) действия были индифферентными.
Рис. 4. Рост колоний тест-культур: слева - контроль (без действия метаболитов испытуемой культуры); справа - опыт (действие метаболитов испытуемой культуры Bacillus subtilis 2335 на рост колоний
тест-культур)
Во многих случаях подавление роста одних видов микроорганизмов другими видами связано с выделением ими специфических химических веществ, обладающих бактерицидным или бактериостатическим действием. Культуры, между которыми осуществляются взаимодействия, могут быть гетерогенными, гомогенными и изогенными.
Фрагмент матрицы взаимодействий исследуемых микроорганизмов дан в таблицах 1-2.
Таблица 1
Диаметр колоний тест-культур под действием суммы метаболитов, продуцируемых испытуемыми культурами, мм
Испытуемая культура Acinetobacter species 15-17 Pseudomonas desmolyticum Bacillus species
X ± m X ± m X ± m
контроль опыт контроль опыт контроль опыт
Bacillus subtilis 2335/pBMB105 8,З±0,19 З,5±0,З З,6±0,15 З,З±0,2 1З,З±0,9 З,0±0,6**
Bacillus subtilis 2335 8,З±0,19 6±0,7 З,6±0,15 З,0±0,0 1З,З±0,9 6,5±0,0**
Alcaligenes species 8,З±0,19 6,0±0,З З,6±0,15 З,8±0,8 1З,З±0,96 6,8±1,1
Acinetobacter species 15-17 8,З±0,19 З,9±0,5 * З,6±0,15 0,0±0,0 1З,З±0,9 4,8±0,5
Escherichia coli K12 8,З±0,19 4,8±0,2 З,6±0,15 З,З±0,2 1З,З±0,9 5,З±0,8
Pseudomonas desmolyticum 8,З±0,19 З,5±0,8 З,6±0,15 5,8±0,2 * 1З,З±0,96 7,5±0,0
Bacillus species 8,З±0,19 4,З±0,2 З,6±0,15 5,5±0,6 1З,З±0,96 O*
Примечание: «0» - нет роста; * - изогенные культуры; ** - гомогенные культуры, остальные культуры - гетерогенные.
Подобные взаимодействия наиболее полно отобразили весь спектр действия метаболитов, продуцируемых испытуемыми культурами на рост тест-культур: от бактерицидного до стимулирующего действия.
Культуры, взаимодействия между которыми осуществляются, называются гетерогенными, если микроорганизмы относятся к разным родам. В качестве испытуемых культуры Pseudomonas desmolyticum и Bacillus species проявили себя достаточно активно: наблюдалось как отрицательное, так и положительное влияние на тест-культуры. Бактерицидным действием обладала испытуемая культура Acinetobacter species 15-17, метаболиты которой действовали бактерицидно на рост тест-культур Flavobacterium species и Pseudomonas desmolyticum.
Культуры, взаимодействия между которыми осуществляются, называются гомогенными, если микроорганизмы относятся к разным видам одного рода. В результате исследования установлено, что все взаимодействия (5) между гомогенными культурами являются достоверно отрицательными.
Таблица 2
Достоверность Юности) между диаметром колоний тест-культур в опыте и контроле
Испытуемая культура t* Тест-культура Культуры
1 2 3 4
Bacillus subtilis 2335/pBMB105 21,4 Bacillus subtilis 2335/pBMB1O5 Изогенные
Acinetobacter species 15-17 8,1 Acinetobacter species 15-17 Изогенные
Bacillus species 16,9 Bacillus species Изогенные
Bacillus species 7,2 Bacillus subtilis 2335 Гомогенные
Окончание табл. 2
1 2 3 4
Bacillus subtilis 2335/pBMB105 9,2 Bacillus species Гомогенные
Bacillus subtilis 2335 7,03 Bacillus species Гомогенные
Bacillus subtilis 2335/pBMB105 13,9 Acinetobacter species 15-17 Гетерогенные
Alcaligenes species 6,69 Acinetobacter species 15-17 Гетерогенные
Escherichia coli K12 1,11 Pseudomonas desmolyticum Гетерогенные
Примечание: Р - разница в диаметре колоний тест-культур в опыте и контроле; различия достоверны при t разности ^ =2,78для р < 0,05; tst = 4,60дляр <0,01; tst =8,61 дляр<0,001).
Культуры, взаимодействия между которыми осуществляются, называются изогенными, если микроорганизмы относятся к одному роду и одному виду. В большинстве случаев культуры сами на себя влияли бактериостатически, что может свидетельствовать об отрицательном действии собственных метаболитов. Наиболее сильным действием обладали культуры Bacillus subtilis 2335/pBMB105 и Bacillus species, сами на себя оказывавшие бактерицидное действие. Остальные культуры обладали бактериостатическим действием. Культура Pseudomonas desmolyticum оказалась устойчива к действию собственных метаболитов. Более того, наблюдалась достоверная стимуляция роста.
Результаты, полученные на основе разработанных экспрессных методов количественной оценки межмикробных взаимодействий, могут найти применение при решении задач по регулированию численности видов в биоценозах, при формировании микробных сообществ.
Выводы
1. Выявлено, что биологически активные вещества, выделяемые бактериями, обладают различным действием на рост тест-организмов. Обнаружено бактерицидное, бактериостатическое и нейтральное действие.
2. Найдено, что метаболиты гетерогенных культур обладали широким спектром действия: от бактерицидного до стимулирующего.
3. Обнаружено, что метаболиты всех исследованных гомогенных культур действовали отрицательно на рост тест-культур.
4. Установлено, что изогенная культура Pseudomonas desmolyticum положительно относится к собственным метаболитам, а остальные изогенные культуры - отрицательно.
Литература
1. Бурмистрова, А.Л. Антибиотики и антибиотикорезистентность. Проблемы и пути решения / А.Л. Бурмистрова, Л.И. Бахарева, Н.Э. Шафикова. - Челябинск: Изд-во «Челябинский Дом печати», 2004. -179 с.
2. Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров. - М.: Высш. шк., 1994. - 448 с.
3. Лакин, Г.Ф. Биометрия: учеб. пособие для биол. спец. вузов. - 3-е изд., перераб. и доп. / Г.Ф. Лакин. -М.: Высш. шк., 1990. - 352 с.
4. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов [и др.]; под ред. А.И. Нетрусова. - М.: Изд. центр «Академия», 2005. - 608 с.
5. Одум, E. Экология: пер. с англ. / Е. Одум. - М.: Мир, 1986. - Т. 1. - 328 с.; Т. 2. - 376 с.
6. Семенов, А.М. Структура микробного сообщества. Поиски и характеристика причин и механизмов динамики и стабильности / А.М. Семенов // Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов: мат-ты конф. - М., 2000. - С. 21-25.
7. А.с.1752771 (51) БС1201/02, C12Q/06. Способ определения биологической активности микроорганизмов / Л.С. Тирранен, Г.Т. Титова. - Опубл. 1992, Бюл. №29.
8. Miller, I. Experiments in molecular genetics / I. Miller. - N.Y.: Cold Spring Harbor, 1972.
9. Morello, J.E. Negative cross-communication among wheat rhizosphere bacteria: effect on antibiotic production by the biological control bacterium Pseudomonas aureofaciens / J.E. Morello, E.A. Pierson, L.S. Pierson // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - 70 (5). - P. 3103-3109.
10. Mounier, J. Microbial Interactions Within a Cheese Microbial Community / J. Mounier [and al.] // Appl. Environ Microbiol. - 2006. - № 2.
11. Tirranen, L.S. Formation of higher plant component microbial community in closed ecological system / L.S. Tirranen// Acta Astronautica. - 2O01. - Vol. 49. - № 1. - P. 47-52.
12. Tirranen, L.S. Comparison of three methods of estimate of microorganism antagonistic action / L.S. Tirranen,
E.V. Durdenko, V. N. Torotenkova // Ecology & Safety: 17th International Symposium. June 9-13, Sunny
Beach resort. - Bulgaria, 2008. Published in: www.science-journals.eu Paper 8 p.
13. Tirranen, L.S. The role of volatile metabolites in microbial communities of the lSS higher plant link / L.S. Tir-
ranen, I.J. Gitelson // Adv. Space Res. - 2006. - Vol.38. - P. 1227-1232.
