CC BY
170
УДК 57.03
Взаимодействие ТВР с ТАТА-боксом промотора гена триозофосфатизомеразы человека в норме и при патологии, определенное в режиме реального времени
О. В. Аркова1, Н. А. Кузнецов2,3, О. С. Федорова2,3, Н. А. Колчанов1,3, Л. К. Савинкова1* 1Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 10 2Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090,
Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8
3Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2 *E-mail: savinkl@mail.ru Поступила в редакцию 27.11.2013 После доработки 21.02.2014
РЕФЕРАТ ТАТА-связывающий белок (TATA-Binding Protein, ТВР) - ключевой компонент транскрипционного комплекса РНК-полимеразы II. Самостоятельно или в составе базального фактора транскрипции TFIID ТВР связывает ТАТА-бокс, расположенный в коровой области ТАТА-содержащих промоторов генов II -го класса. Ранее методом «задержки ДНК в геле» мы изучали влияние однонуклеотидных полиморфизмов (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) на взаимодействие ТВР с ТАТА-боксом. Показано, что большинство SNPs в ТАТА-боксах ряда промоторов генов человека вызывают снижение в 2-4 раза сродства ТВР/ТАТА, ассоциированное с повышенным риском возникновения таких наследственных заболеваний, как Р-талассемии различной тяжести, гемофилия В Лейдена, инфаркт миокарда, рак легкого и др. В представленной работе, используя рекомбинантный ТВР человека и флуоресцентно меченные FRET-парой флуорофоров Cy3- и Су5-дуплексы, идентичные ТАТА-боксу промотора нормального гена триозофосфатизомеразы (TPI) человека и ТАТА-боксу, содержащему SNP -24T > G, методом «остановленной струи» в режиме реального времени исследован процесс образования комплекса ТВР/ТАТА. Впервые показано, что связывание ТВР с ТАТА-боксом промотора гена TPI происходит в течение 10 с и описывается одностадийной кинетической моделью. Образование комплексов ТВР с нормальным ТАТА-боксом происходит в 5.5 раза быстрее, а диссоциация - в 31 раз медленнее, чем в случае ТАТА-бокса, содержащего SNP. В первые секунды взаимодействия ТВР связывает и одновременно изгибает ТАТА-бокс, причем для промотора гена TPI дикого типа требуются меньшие концентрации ТВР, чем для SNP-содержащего ТАТА-бокса, ассоциированного с неврологическими и мышечными нарушениями, кардиомиопатией и другими заболеваниями. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА ТАТА-бокс, ТВР, полиморфизм, метод остановленной струи.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ТВР (TATA-Binding Protein) - ТАТА-связывающий белок; ТВР/ТАТА - комплекс ТВР с олигонуклеотидом, идентичным ТАТА-боксу с фланкирующими нуклеотидами.
ВВЕДЕНИЕ
Специфические нуклеотидные последовательности промотора и вокруг него служат кодом, который определяет когда, где и с какой эффективностью будут транскрибироваться отдельные гены. Этот код состоит из последовательностей трех типов: кор-промотора, проксимальной области промотора и более удаленных от промотора дистальных последовательностей. Кор-промотор - это область, рас-
положенная на расстоянии ~ 100 нуклеотидов слева (в 5'-области) и справа (в З'-области) от старта транскрипции, на которой сконцентрированы такие регуляторные элементы, как ТАТА-бокс, BRE (TFIIB-recognition element), Inr (Initiator), MTE (Motif Ten Element), DPE (Downstream Promoter Element), DCE (Downstream Core Element) и XCPE1 (Х Core Promoter Element 1) и др., количество которых может варьировать [1].
ТАТА-бокс, расположенный на расстоянии ~ 30 п.н. от старта транскрипции, наиболее изученный кор-промоторный элемент. Взаимодействие ТВР (TBP -TATA-Binding Protein) с ТАТА-боксом запускает сборку базального комплекса транскрипции РНК-полимеразы II и определяет точность расположения транскрипционной машины относительно стартового нуклеотида [1, 2]. От нуклеотидной последовательности ТАТА-бокса и контекста, в котором он находится, зависит сродство к нему ТВР, субъединицы базального фактора транскрипции TFIID, влияющее на активность промотора [3, 4].
Сравнение аминокислотных последовательностей ТВР человека, мыши, плодовой мушки, дрожжей и других организмов показало, что ТВР состоит из высококонсервативного С-концевого домена из 180 аминокислотных остатков и вариабельного N-концевого домена [5]. У ТВР разных видов С-концевой домен идентичен более чем на 80% [5]. Рентгеноструктурный анализ, футпринтинг и анализ расположения триптических пептидов С-концевого домена [6] показали, что ТВР состоит из двух субдоменов, H2 и H2', которые образуют непрерывный, слегка изогнутый антипараллельный P-лист, формирующий вогнутое ДНК-связывающее седло, и четырех а-спиралей, лежащих на верхней стороне молекулы. С-Концевой домен ТАТА-связывающего белка контактирует с двухцепочечной ДНК вдоль малой бороздки в основном посредством неполярных и гидрофобных взаимодействий и вызывает ее локальное расплетание и изгиб спирали. Это создает уникальную конформацию, строго необходимую для сборки преинициаторного комплекса и эффективной транскрипции in vitro и in vivo [7]. С верхней, выпуклой, стороной ТВР взаимодействуют различные регуляторные белки [8].
Однонуклеотидные полиморфизмы, или SNPs, в ТАТА-боксах и окружающих нуклеотидах, влияющие на сродство к ним ТВР, могут вносить вклад в различные комплексные заболевания человека -гипертонию, артрит, онкологические, сердечнососудистые и иммунные заболевания, а также быть причиной таких моногенных заболеваний, как Р-талассемии различной тяжести, Коппок-подобная катаракта и др. [9].
Ген триозофосфатизомеразы (TPI) экспрессируется во всех типах клеток, он относится к генам «домашнего хозяйства» [10]. В тканях человека обнаружены множественные формы TPI, которые кодируются одним геном и образуются в результате посттрансляционных модификаций [10]. TPI катализирует превращение дигидроацетонфосфата в D-глицеральдегид-З-фосфат, завершая тем самым первую стадию гликолиза. Недостаток фермента
приводит к накоплению в клетке дигидроацетонфос-фата и фруктозодифосфата.
SNP -24T > G в ТАТА-боксе промотора гена TPI, обнаруженный в работе [11], приводит к синтезу недостаточного количества мРНК (далее под SNP понимаем аллель G ТАТА-бокса). Активность фермента в эритроцитах носителей этого аллеля снижается и составляет 3-10% от активности в клетках здоровых доноров [8, 11, 12]. У них развиваются нейроде-генеративные расстройства, кардиомиопатия, мышечные нарушения и, реже, гемолитическая анемия [11]. Кроме того, триозофосфатизомераза способна превращать лекарственно устойчивые клетки рака желудка в чувствительные [13], что повышает эффективность химиотерапии и делает фермент потенциальной мишенью для новых противоопухолевых препаратов.
Экспериментальное и компьютерное изучение влияния SNPs в составе ТАТА-боксов, находящихся в контексте ДНК промоторов генов человека [14, 15], на взаимодействие с ТВР позволило нам определить термодинамические (KD) и кинетические (kon и koff) параметры образования комплексов ТВР с «нормальным» и SNP-содержащим ТАТА-боксом промотора гена TPI.
Так, показано [14], что SNP -24Т > G в ТАТА-боксе этого гена очень сильно снижает сродство ТВР/ТАТА - равновесная константа диссоциации комплексов, KD, возрастает в 25 раз, что коррелирует с низкой экспрессией гена [11]. В присутствии SNP константа скорости образования комплексов (kon) TBP/TATA снижается в 35 раз, а константа скорости диссоциации (koff) уменьшается на 30%.
Цель представленной работы заключалась в измерении и анализе кинетических параметров взаимодействия ТВР/ТАТА в режиме реального времени. Использованный нами при изучении термодинамических и кинетических параметров комплексов TBP/TATA классический метод EMSA не позволяет изучать динамику взаимодействия молекул TBP и TATA-бокса промотора гена TPI в миллисекундном и секундном диапазонах времени. Поэтому процесс связывания TBP и TATA-бокса промотора гена TPI мы изучали методом «остановленной струи». В основе метода лежит быстрое, в течение ~1 мс, смешивание взаимодействующих веществ и регистрация сигнала FRET (Forster Resonance Energy Transfer). Мы использовали рекомбинантный полноразмерный ТВР человека и 15-звенные флуоресцентно меченные красителями Cy3 и Cy5 олигонуклеотиды, идентичные ТАТА-боксу с фланкирующими нуклеотидами нормального промотора TPI и промотора, содержащего SNP в ТАТА-боксе. Этот метод позволяет определить константы скорости узнавания ТАТА-связывающим
; «и/ иу-' г
Су3 0<^м-(СНЛ-о~реСТСТАТА(Т/С)ААСТСС <?"•>• 4 Су5
ССАСАТАТ(А/С)ТТСАСС р~о-(СН2)-м^о
Рис. 1. Использованные в работе ДНК-дуплексы, идентичные последовательности ТАТА-бокса промотора гена ТР1 дикого типа и содержащего SNP -24Т > G, меченные FRET-парой флуорофоров Су3/Су5
белком ТАТА-бокса дикого типа и выявить особенности структуры комплекса ТВР/ТАТА в режиме реального времени в норме и при патологии.
экспериментальная часть
В работе использовали полноразмерный рекомбинантный ТВР человека, содержащий только природные аминокислотные последовательности. ТВР экспрессировали в клетках Escherichia coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pAR3038-hTBP (любезно предоставлена проф. B. Puhg, Center for Gene Regulation, Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, USA). Трансформацию E. coli BL21(DE3) проводили согласно работе [16]. Экспрессию и очистку ТВР выполнили по методике, описанной в [17], при использовании ИПТГ в концентрации 0.1 мМ. Время индукции - 3 ч. Концентрацию ТВР в препарате белка определяли по методу Брэдфорд [18].
Олигодезоксинуклеотиды (ОДН) длиной 15 п.н., меченные по 5'-концам цепей цианиновыми флуоро-форами Су3 и Су5, были синтезированы и очищены в ООО «НаноТех-С», Новосибирск.
Cвязывание ТВР с ДНК-дуплексом, соответствующим нормальному ТАТА-боксу промотора гена TPI (gctcTATATAAgtgg, аллель Т и gctcTATAGAAgtgg, аллель G), анализировали методом «остановленной струи» на спектрометре SX20 (Applied Photophysics, Великобритания). Длина волны возбуждения флуоресценции красителя Су3 равна 550 нм, напряжение на детекторе - 575 В. Флуоресценцию красителя Су5 регистрировали на длинах волн более 645 нм при использовании светофильтра RG-645 (Scott, Германия). Процесс связывания с ДНК-дуплексами изучали с использованием ТВР в следующих концентрациях: аллель Т - 1 х 10-7, 2 х 10-7, 4 х 10-7, 6 х 10-7, 8 х 10-7, 10 х 10-7, 20 х 10-7 М; аллель G - 4 х 10-7, 6 х 10-7, 8 х 10-7, 10 х 10-7, 20 х 10-7, 30 х 10-7, 40 х 10-7 М. Концентрация ДНК-дуплексов во всех случаях была равна 1 х 10-7 М, время измерения - 50 с, общее количество точек на одну кривую - 6000. Опыты проводили при температуре 25°С.
Для определения кинетической модели взаимодействия ТВР с ДНК-дуплексами и расчета констант скорости всех элементарных стадий реакции использовали программу Dynafit (Вюкт, США) [19].
результаты и обсуждение
Исследование предстационарной кинетики позволяет детально проанализировать механизм реакции. Преимуществом метода «остановленной струи» является возможность наблюдать быстро протекающие реакции и регистрировать конформационные переходы белка и ДНК в процессе взаимодействия в режиме реального времени. Хотя этот подход более сложен технически, а его использование требует более трудоемкого математического анализа, изучение процесса связывания ТАТА-боксов ТАТА-связывающим белком в предстационарных условиях позволяет в значительной степени углубить знания о механизме их взаимодействия.
В работе использовали FRET-субстраты (рис. 1), содержащие на концах дуплекса пару донор (СуЗ)-акцептор (Су5), при этом центральная часть дуплекса представляла собой ТАТА-бокс нормального промотора гена TPI и при наличии SNP.
Кинетика связывания ДНК-дуплексов с ТВР, представленная на рис. 2 и 3, свидетельствует о том, что образование комплекса ТВР/ТАТА приводит к росту интенсивности флуоресценции Су5. Рост интенсивности FRET-сигнала обусловлен изгибанием ДНК-дуплекса в комплексе с ТВР, за счет чего происходит сближение остатков флуорофоров СуЗ и Су5. Анализ кинетических кривых ДНК-дуплексов показал, что изгибание дуплекса, содержащего ТАТА-бокс дикого типа, происходит при меньших концентрациях ТВР, чем в случае аллеля G ТАТА-бокса (рис. 2 и 3).
На основании полученных данных нами предложен кинетический механизм связывания ТВР с нормальным ТАТА-боксом гена TPI и с ТАТА-боксом, содержащим SNP, описываемый одностадийной схемой:
ТВР + ТАТА <=> ТВР/ТАТА.
ш О.4О
[TBP], мкМ
:'.О
|.°
'щжтіщтшнітяіт
1О
2О ЗО
Время, с
4О
5О
Рис. 2. Кинетика связывания и изгибания ДНК-дуплекса, идентичного последовательности ТАТА-бокса гена ТР1 дикого типа
[TBP], мкМ
4.О
--------- З.О
--------- 2.О
іЯі.9Ж1 .УШТ ІіЛ' ы/ W% ІІПМЯ ■ I ГГ. w.ra
1.О
О.8
О.6
О.4
1О
2О ЗО
Время, с
4О
5О
Рис. 3. Кинетика связывания и изгибания ДНК-дуплекса, идентичного последовательности содержащего SNP ТАТА-бокса промотора гена ТР1
О
Константы скоростей прямой и обратной реакции представлены в таблице. Видно, что образование комплексов TBP с ТАТА-боксом дикого типа происходит в 5.5 раза быстрее (1.1 х 106 M-1c-1), чем с аллелем G (0.2 х 106 M-1c-1), а диссоциация комплексов ТВР/ТАТА - в 31 раз медленнее (2.8 х 10-3 с-1 у дикого типа и 8.9 х 10-2 с-1 в случае аллеля G). Необходимо отметить, что подобное различие в константах скорости образования и распада комплекса TBP/TATA приводит к отличию значений равновесных констант диссоциации в 150 раз (2.7 х 10-9 М в норме и 0.4 х 10-6 М при наличии мутации). Различие в значениях констант диссоциации (KD) между нормальным и SNP-содержащим ТАТА-боксом говорит о резком снижении аффинности TBP к олигонуклеотидам с измененным ТАТА-боксом.
Полученные данные свидетельствуют о том, что возникшая в ТАТА-боксе G/C-пара делает структуру ДНК более жесткой, что затрудняет связывание ТАТА-бокса с ТВР и образование функционального комплекса, имеющего оптимальную конформацию. Из этого следует, что in vivo ген три-озофосфатизомеразы, содержащий SNP -24T > G в ТАТА-боксе, транскрибируется и экспрессируется менее эффективно. Эти результаты подтверждены клинически [11].
Сравнение полученных нами и опубликованных данных [11, 20] показывает, что уменьшение в 150 раз сродства ТВР к SNP-содержащему ТАТА-боксу промотора TPI приводит к повышению риска развития ряда заболеваний, связанных с недостатком триозофосфатизомеразы. Вероятно, недостаток TPI может компенсироваться другими путями (на-
пример, в пентозофосфатном цикле), что следует из различий в реакции больных на недостаток ТРІ в организме [11, 21]. Несмотря на то что сродство ТВР к SNP-содержащему ТАТА-боксу промотора гена TPI снижено в 150 раз, активность ТРІ в эритроцитах одних пациентов падает до 3-10% от нормы [21], а у некоторых гетерозиготных носителей этого полиморфного аллеля наблюдается умеренное (26-50% от нормы) снижение активности ТРІ [11].
Следует отметить, что впервые путем регистрации в режиме реального времени взаимодействия ТВР человека с флуоресцентно меченными Су3 и Су5 ТАТА-содержащими дуплексами показано,
Кинетика взаимодействия ТВР с ТАТА-боксом TPI
Константа ТАТА-бокс, аллель Т SNP -24Т > G ТАТА-бокс, аллель G SNP -24Т > G
k , M-1c-1 on (1.1 ± 0.1)x106 (0.2 ± 0.1)x 106
Kv c-1 0- i-H X i-4 © ± .8 (2. (8.9 ± 1.2)x 10-2
K , M-1 ass 3.7 x 108 2.3 x 106
KD, M 2.7 x 10-9 = 2.7 нМ 0.4 x 10-6 = 400 нМ
Примечание. kon - константа скорости прямой реакции TBP/TATA; koff - константа скорости обратной реакции TBP/TATA; Kass - равновесная константа ассоциации, полученная из кинетических значений (kon / koff); KD - равновесная константа диссоциации, полученная из кинетических значений (k к ).
' off ' on7
что ТВР быстро связывает и одновременно изгибает ДНК ТАТА-бокса гена TPI. Этот результат согласуется с данными, полученными ранее с использованием полноразмерного ТВР человека и ТАТА-бокса AdMLP с консенсусной последовательностью 5'-CGCTATAAAAGGGC-3', к 5'-концу которой присоединен флуорофор ТАМИА, а к З'-концу -флуоресцеин [22], которые свидетельствуют об одностадийном механизме процесса связывания и одновременного изгибания ТАТА-бокса белком ТВР.
Следует отметить, что в мире подобные исследования проводились с использованием ТВР разного вида - полной и укороченной форм (С-концевого домена) - и, в основном, только модельного промотора AdML (реже Е4) с консенсусной последовательно-
стью ТАТА-бокса. Полученные результаты улучшили представление о взаимодействии TBP/TATA, ключевом в инициации и регуляции транскрипции и синтеза белков в клетках эукариот. •
Авторы выражают благодарность И.А. Драчковой, Т.В. Аршиновой и А.А. Кузнецовой за помощь в выделении рекомбинантного ТВР и проведении экспериментов.
Работа частично поддержана программой РАН «Молекулярная и клеточная биология» (грант № 6.11), РФФИ (грант № 14-04-00485) и интеграционными проектами 6.8 и 30.29 Президиума РАН.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Juven-Gershon T., Kadonaga J.T. // Dev. Biol. 2010. V. 339.
№ 2. P. 225-229.
2. Aso T., Conaway J.W., Conaway R.C. // J. Biol. Chem. 1994.
V. 269. № 42. P. 26575-26583.
3. Caron C., Rousset R., Beraud C., Moncollin V., Egly J.M., Jalinot P // EMBO J. 1993. V. 12. № 11. P 4269-4278.
4. Faiger H., Ivanchenko M., Cohen I., Haran T.E. // Nucl. Acids Res. 2006. V. 34. № 1. P 104-119.
5. Hoffman A., Sinn E., Yamamoto T., Wang J., Roy A., Horikoshi M., Roeder R.G. // Nature. 1990. V. 346. № 6282. P. 387-390.
6. Hernandez N. // Genes Dev. 1993. V. 7. № 7. P 1291-1308.
7. Wu J., Parkhurst K.M., Powell R.M., Brenowitz M., Parkhurst L.J. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 18. P 14614-14622.
8. Cang Y., Auble D.T., Prelich G. // EMBO J. 1999. V. 18. № 23.
P. 6662-6671.
9. Cавинкова Л.К., Пономаренко М.П., Пономаренко П.М., Драчкова И.А., Лысова М.В., Аршинова Т.В., Колчанов Н.А. // Биохимия. 2009. Т. 74. № 2. С. 117-129.
10. Brown J.R., Daar I.O., Krug J.R., Maquat L.E. // Mol. Cell. Biol. 1985. V. 5. № 7. P 1694-1706.
11. Watanabe M., Zingg B.C., MohrenWeiser H.W. // Am. J. Hum. Genet. 1996. V. 58. № 2. P 308-316.
12. Rosa R., Prehu M.O., Calvin M.C., Badoual J., Alix D., Girod R. // Hum. Genet. 1985. V. 71. № 3. P. 235-240.
13. Wang X., Lu Y., Yang J., Shi Y., Lan M., Liu Z., Zhai H., Fan D. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2008. V. 134. № 9. P. 995-1003.
14. Savinkova L., Drachkova I., Arshinova T., Ponomarenko P., Ponomarenko M., Kolchanov N. // PLoS One. 2013. V. 8. № 2. e54626.
15. Drachkova I.A., Savinkova L.K., Arshinova T.V., Ponomarenko M.P., Peltek S.E., Kolchanov N.A. // Hum. Mut. 2014. V. 35. № 5. P. 601-608.
16. Peterson M.G., Tanese N., Pugh B.F., Tjian R. // Science.
1990. V. 248. № 4963. P. 1625-1630.
17. Pugh B.F. // Methods in molecular biology: in vitro transcription and translation protocols / Ed. Tymms M.J. Totowa: Humana Press Inc., 1995. V. 37. P. 359-367.
18. Bradford M.M. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P 248-254.
19. Kuzmic P. // Anal. Biochem. 1996. V. 237. № 2. P. 260-273.
20. Humphries A., Ationu A., Lalloz M.R., Layton D.M. // Hum. Genet. 1999. V. 104. № 6. P. 486-491.
21. Chang M.L., Artymiuk P.J., Wu X., Hollan S., Lammi A.,
Maquat L.E. // Am. J. Hum. Genet. 1993. V. 52. № 6. P. 1260-1269.
22. Masters K.M., Parkhurst K.M., Daugherty M.A., Parkhurst L.J., Lawrence J. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. № 34. P. 31685-31690.
