CC BY
32
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 3 - P. 137-141
УДК: 611.8 DOI: 10.24411/1609-2163-2018-16125
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НЕЙРОНОВ ОРЕКСИНЕРГИЧЕСКОГО И ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОГО ЯДЕР СТВОЛА МОЗГА В МЕХАНИЗМЕ АЛКОГОЛЬНОЙ ЗАВИСИМОСТИ, ФОРМИРУЕМОЙ В ПЕРИНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ
А.В. ДРОБЛЕНКОВ*,**, А.В. ФЕДОРОВ*, Р.Н. МАГРАДЗЕ*, П.Д. ШАБАНОВ*", Л.Г. ПРОШИНА**
*ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», ул. Академика Павлова, д. 12, Санкт-Петербург, 197376, Россия **ГОУ ВО «Новгородский государственный университет им. Ярослава Мудрого», Большая Санкт-Петербургская ул., д. 41, Великий Новгород, Новгородская обл., 173003, Россия,
e-mail: droblenkov_a@mail.ru
Аннотация. Известно, что устойчивый дефицит дофамина, вырабатываемого в дофаминергиче-ских ядрах среднего мозга и гиперпродукция олигопептидов семейства орексинов в дорсальной пе-рифорникальной области каудального гипоталамуса, происходящий в результате морфо-функционального взаимодействия нейронов соответствующих ядер ствола мозга, предрасполагают к развитию алкогольной зависимости. Целью данной работы явилось выявление малоизученных реактивных изменений нейронов перифорникального орексинергического и паранигральнгого дофами-нергического ядер ствола мозга, а также изменения уровня секреции орексина А (основной тип орек-сина) при алкогольной зависимости, формируемой в перинатальном периоде. Алкогольную зависимость самцов крыс в возрасте 61 сут формировали методом полупринудительной алкоголизации самок, начиная с 1-го дня беременности до 17-го дня постнатального развития. Использованы методики световой микроскопии, количественной морфометрии (подсчет числа неизменен-ных/малоизмененных и теневидных нейронов в 0,01мм2 площади этих ядер, вычисление площади тел малоизмененных нейронов) в гистологических срезах, стандартной статистической обработки полученных данных. Установление уровня выработки орексина А производилось на основании визуальной оценки числа гранул протеина в цитоплазме нейронов после их иммуноцитохимического окрашивания в перифорникальном орексинергическом гипоталамическом ядре. В результате работы получены новые морфологические данные, уточняющие патогенетический механизм развития алкогольной зависимости, формируемой в перинатальном периоде. Уменьшение размеров и гибель значительной части нейронов перифорникального орексинергического ядра, индуцированное этанолом, выражены в меньшей степени, чем в паранигральном дофаминергическом ядре, сочетаются с увеличением выработки орексина А. Альтеративные изменения нейронов обоих исследованных ядер сопровождаются компенсаторным влиянием клеток макроголии на жизнеспособные нейроны, возросшим многократно.
Ключевые слова: алкогольная зависимость, дофаминергическое и орексинергическое ядра, нейроны, реактивные изменения.
Актуальность. До недавнего времени считалось, что главной предпосылкой развития зависимостей, в том числе алкогольной, является устойчивый дефицит дофамина, поддерживающего электрохимическую активность многочисленных проекционных центров мезо-кортиколимбической дофаминергической системы (МДС) [4-6,12]. Дофаминергические ядра среднего мозга являются электрохимическим усилителем нейронов медиальной префрон-тальной и передней цингулярной коры, гиппо-кампа, прилежащего ядра - ключевых центров МДС, осуществляющих мотивационно-
мнестические / эмоциогенные функции, а через ее обширные анатомические связи, и нейронов всех остальных мозговых формаций [1]. Сегодня стало очевидным, что алкогольную зависимость индуцируют также и олигопепти-ды, относящиеся к семейству орексинов (орек-сины А и В (OXA и OXB), гипокретины), грели-нов и некоторых других [8]. При этом вопрос, являются ли эти протеины нейротрансмитте-рами, остается открытым, однако доказана их роль в регуляции медиаторной передачи сигналов через синапсы МДС. В частности, установлена связь орексинергических волокон с
дофаминергическими нейронами вентральной покрышки среднего мозга и наличие у последних рецепторов к ОХА, ОХВ [8]. Однако, реактивные изменения нейронов перифорникального орексинергического (ПФ) орексинергического и паранигральнгого дофаминергического (ПН) до-фаминергического ядер ствола мозга, являющиеся главными источниками орексинов и дофамина в МДС при алкогольной интоксикации мало изучены. Получение этих данных способствовало бы наиболее полному представлению механизмов алкогольной зависимости.
Цель исследования - выявить реактивные изменения нейронов орексинергического ПФ и дофаминергического ПН ядер ствола мозга, а также изменения уровня секреции ОХА при алкогольной зависимости, формируемой в перинатальном периоде.
Материалы и методы исследования. У самцов крыс (n=5) в возрасте 61с после формирования алкогольной зависимости в перинатальном периоде [3] и у самцов интактных крыс аналогичного возраста (n=5) гистологически исследовали орексинергическое и дофами-нергическое ядра ствола мозга. Алкогольную диету для половозрелых самок крыс (15%-ный раствор этанола в качестве единственного источника жидкости при свободном доступе к брикетированному сухому корму) применяли, начиная с 1-го дня беременности до 17-го дня постнатального развития (средний возраст окончания грудного вскармливания).
Головной мозг крысят через 3 мин. после декапитации, осуществленной согласно «Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ от 2003 г. № 267), фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в 96% изопропаноле и заливали в парафин. Фронтальные срезы толщиной 3 мкм были выполнены в соответствии со стереотаксическим атласом [9] на уровне bregma - 3,6 для изучения каудальной части орексинергического ПФ ядра (рис. а) - области с наибольшим числом орексинергических нейронов [8] и на уровне bregma - 4,8 для анализа передней части дофаминергического ПН ядра. В последней количество нейронов и их размеры больше, чем других частях ПН ядра [2]. Срезы окрашивали методом Ниссля, выявляли гранулы ОХА (с использованием поликлональ-ных кроличьих антител OXA, Clone-cloude corp., Китай, для крыс в концентрации 200 ug/ml, набора «VECTASTAIN ABC», США и хромогена
DAB). В трех последовательных квадратах площадью 0,01 мм2 у каждого животного подсчитывали число неизмененных (малоизмененных) нейронов, нейронов-«теней», их долю от общего количества клеток, вычисляли площадь малоиз-мененных нейронов, количество клеток-сателлитов и глиоцито-нейрональный индекс (как отношение числа клеток сателлитной формы макроглии к числу малоизмененных нейронов).
Морфометрию проводили с помощью программы Imagescope (Электронный анализ, Россия). Среднее арифметическое, среднее квад-ратическое отклонение и стандартную ошибку среднего определяли с помощью компьютерной программы Excel. О значимости различий судили по величине i-критерия Стьюдента и считали их значимыми при Р<0,05.
Результаты и их обсуждение. Тела большинства неизмененных нейронов исследованных ядер у интактных крыс пубертатного периода жизни были насыщены мелкими глыбками субстанции Ниссля, обладали отчетливыми ровными контурами клеточной и ядерной поверхности. Небольшую долю нейронов составили клет-ки-«тени» (табл. 1 и 2), выявленные также у молодых здоровых крыс-самок и людей [3], содержание которых, по всей вероятности, может быть следствием незавершенности физиологического процесса их программированной гибели после рождения. Фактором, обусловливающим разную степень повреждения нейронов (даже в условиях относительной нормы) может являться влияние избыточного и частого выделения катехолами-нов в синаптическую щель [11]. Через ПН ядро, в отличие от дорсального гипоталамического ПФ ядра, проходит ствол катехоламинергического медиального пучка переднего мозга [2,9], волокна которого могут поддерживать электрохимическое перенапряжение нейронов ПНЯ, высокий градиент в этом ядре клеток-«теней» и компенсационного высокого уровня нейроно-глиальных взаимоотношений, убывающий по мере удаления от катехоламинергических ядер [3]. В телах и основаниях отростков многих нейронов ПФ ядра содержались мелкие гранулы ОХА в количестве, обычно, не более 10-15, что соответствует данным электронно-микроскопического исследования этого ядра [10].
У крыс экспериментальной группы малоизмененные нейроны исследованных ядер обнаруживались реже, чем у интактных животных; доля теневидных нейронов, соответстенно, значительно возросла (табл. 1, 2).
Морфометрические параметры нейронов и нейроно-глиальных взаимоотношений в перифорникальном ядре гипоталамуса на площади 0,01 мм2 (X ± ) у крыс на 61 сут.
Воздействие этанола Количество и доля нейронов Площадь тел нейронов, мкм2 (m = 30) Число клеток-сателлитов Глиоцито-нейрональный индекс
жизнеспособных клеток-«теней» всего
Нет (интактные крысы) 11,4±3,1 93,9±1,5% 0,8±0,2 6,1±1,5% 12,3±0,7 100% 422,0±13,1 1,8±0,3 0,15±0,03
Есть 9,8±2,7 70,5±1,4%* 4,1±1,1 29,5±1,4%* 13,9±0,9 265,6±10,6* 5,1±0,4* 0,51±0,02*
Примечание: * - различия с параметрами клеток у интактных крыс значимы (р<0,05); m - количество измерений
Таблица 2
Морфометрические параметры нейронов и нейроно-глиальных взаимоотношений в паранигральном ядре среднего мозга на площади 0,01 мм2 (X ± ) у крыс на 61 сут.
Воздействие этанола Количество и доля нейронов Площадь тел нейронов, мкм2 (m = 30) Число клеток-сателлитов Глиоцито-нейрональный индекс
жизнеспособных клеток-«теней» всего
Нет (интактные крысы) 5,3±0,4 77,8±2,8% 1,5±0,2 22,4±2,8% 6,8±0,5 100% 635,2±25,7 1,7±0,3 0,27±0,04
Есть 4,1±0,3 60,1±2,7%* 2,3±0,2 39,9±2,7%* 6,6±0,4 100% 323,5±19,0* 3,5±0,4* 0,87±0,09*
Примечание: * - различия с параметрами клеток у интактных крыс значимы (р<0,05); m - количество измерений
Рис. Изменения нейронов перифорникального ядра каудального гипоталамуса после воздействия этанола в перинатальном периоде у крыс в возрасте 61 сут на площади 0,03 мкм2 (ограничена). Т - нейроны-«тени», F - свод. Окраска методом Ниссля (а,в) и гранул орексина А. Ув.: *80 (а), *1000 (б,в)
Многие нейроны-«тени» подвергались фагоцитозу клетками макроглии. Почти двукратное уменьшение площади
жизнеспособных дофаминергических нейронов
Таблица 1 ПН ядра и увеличение доли среди нейронов клеток-«теней» может являться причиной значительного снижения
выработки дофамина и обусловить регистрацию
высокого индекса предпочтения этанола в аналогичной модели эксперимента [3]. Уменьшение площади нейронов ПФ ядра в эксперименте, по сравнению с параметром у интактных крыс, было значимым (р<0,05), но менее выраженным, чем в ПН ре. В телах нейронов обнаруживались несколько десятков им-мунопозитивных гранул ОХА, в отдельных небольших участках образующие сгущения (рис. б). Выявленное увеличение
ции ОХА, обусловленное лированием алкогольной
симости, согласуется с данными об увеличении интенсивности экспрессии mRNA к ОХА и числа экспрессирующих его нейронов в супрафорникальной области при алкогольной интоксикации [7]. В обоих исследованных ядрах у крыс экспериментальной группы многократно возросли
параметры нейроно-глиальных взаимоотношений, что является выражением компенсаторного влияния клеток макроголии на поврежденные жизнеспособные нейроны.
Выводы. Морфологическим выражением алкогольной зависимости, формируемой в перинатальном периоде, являются уменьшение размеров и гибель значительной части нейронов дофаминергического и орексинергического ядер. Повреждение нейронов орексинергиче-ского ядра, индуцированное этанолом, выражено в меньшей степени, чем в дофаминерги-ческом ядре, и сочетается с увеличением выработки орексина А. Альтеративные изменения нейронов обоих исследованных ядер, индуцированные этанолом, сопровождается компенсаторным влиянием клеток макроголии на жизнеспособные нейроны, возросшим многократно.
INTERACTION OF OREXINERGIC AND DOPAMINERGIC BRAIN STEM NUCLEI NEURONS IN THE MECHANISM OF ALCOHOLIC DEPENDENCE, FORMED IN THE PERINATAL PERIOD
A.V. DOBLENKOV"*, A.V. FEDOROV*, R.N. MAGRADZE*, P.D.SHABANOV"*, L.G PROSHINA"
*Federal State Budget Scientific Foundation "Institute of Experimental Medicine",
12, Akademik Pavlov Str., St. Petersburg, 197376, Russia **State Educational Foundation of Higher Education "Novgorod State University named after Yaroslav the Wise", Bolshaya Sankt-Peterburgskaya Str., 41, Veliky Novgorod, Novgorod region,
Russia, 173003, Russia
Abstract. It is known that a stable deficit of dopamine produced in dopaminergic nuclei of the midbrain and hyperproduction of oligopeptides of the orexin family in the dorsal perifornal region of the caudal hypothalamus, resulting from the morpho-functional interaction of the neurons of the corresponding nuclei of the brainstem, predispose to the development of alcohol dependence. The purpose of this work was to to reveal poorly studied reactive changes in the neurons of the perifornical oroxynergic and paranigral dopa-minergic nuclei of the brainstem, as well as changes in the level of orexin A secretion (the main type of orexin) with alcohol dependence formed in the perinatal period. The alcohol dependence of male rats at the age of 61 days was formed by the method of semi-forced alcoholization of females, starting from the 1st day of pregnancy to the 17th day of postnatal development. The methods of light microscopy, quantitative morphometry (counting the number of unchanged / low-modified and shadow neurons in 0.01 mm2 of the area of these nuclei, calculating the area of bodies of small-modified neurons) were used in histological sections, standard statistical processing of the obtained data. The determination of the level of orexin A production was based on a visual assessment of the number of protein granules in the cytoplasm of neurons after their immunocytochemical staining in the perixonal oroxynergic hypothalamic nucleus. As a result of the work, new morphological data were obtained, which clarify the pathogenetic mechanism of the development of alcohol dependence, formed in the perinatal period. The decrease in size and death of a significant part of the peri-ornaxial-nucleus-induced neurons induced by ethanol is less pronounced than in the paranigral dopaminergic nucleus, combined with an increase in the production of orexin A. The alterative changes in the neurons of both nuclei are accompanied by a compensatory effect of macrogol cells on viable neurons that have increased manyfold.
Key words: alcohol dependence, dopaminergic and oroxynergic nuclei, neurons, reactive changes.
Литература
References
1. Голдберг Э. Управляющий мозг. Пер. с англ. Д. Булдакова. М.: Смысл, 2003. 335 с.
1. Goldberg EH. Upravlyayushchij mozg [Managing the brain]. Per. s angl. D. Buldakova. Moscow: Smysl; 2003. Russian.
2. Дробленков А.В., Федоров А.В., Шабанов П.Д. Структурные особенности дофаминергических ядер вентральной покрышки среднего мозга // Наркология. 2018. Т. 17, №3. С. 41-46.
2. Droblenkov AV, Fedorov AV, SHabanov PD. Strukturnye osobennosti dofaminergicheskih yader ventral'noj pokryshki srednego mozga [Structural features of dopaminergic nuclei of the ventral tyre of the middle brain]. Narkologiya. 2018;17(3):41-6. Russian.
3. Дробленков А.В., Шабанов П.Д. Дофаминерги-ческие механизмы алкогольной зависимости.
3. Droblenkov AV, SHabanov PD. Dofaminergi-cheskie mekhanizmy alkogol'noj zavisimosti [Dopaminergic mechanisms of alcohol dependence]. SPb.: Art-Xpress; 2014. Russian.
СПб.: Art-Xpress, 2014.
4. Хадарцев А.А., Морозов В.Н., Волков В.Г., Ха-дарцева К.А., Карасева Ю.В., Хромушин В.А., Гра-натович Н.Н., Гусак Ю.К., Чуксеева Ю.В., Паньши-на М.В. Медико-биологические аспекты реабили-тационно-восстановительных технологий в акушерстве: монография / Под ред. Хадарцевой К. А.
4. KHadarcev AA, Morozov VN, Volkov VG, KHadarceva KA, Karaseva YUV, KHromushin VA, Granatovich NN, Gusak YUK, CHukseeva YUV, Pan'shina MV. Mediko-biologicheskie aspekty reabili-tacionno-vosstanovitel'nykh tekhnologij v aku-sherstve: monografiya [Medical and biological as-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 3 - P. 137-141
Тула: ООО «Тульский полиграфист», 2013. 222 с.
5. Шабанов П.Д., Лебедев А.А., Мещеров Ш.К. Дофамин и подкрепляющие системы мозга. СПб.: Лань, 2002.
6. George S.R., Fan T., Nig G.Y. Low endogenous dopamine function in brain predisposes to high alcohol preference and consumption: reversal by increasing synaptic dopamine // J. Pharmacol. Exp. Therapy. 1995. Vol. 273. P. 373-379.
7. Lawrence A.J., Cowen M.S., Yang H.-J. The orexin system regulates alcohol-seeking in rats // Brit. J. Pharmacol. 2006. Vol. 148. P. 752-759.
8. Luis de Lecea J. Gregor Sutcliffe. Hypocretins. Integrators of physiological functions. New York: Springer Science and Business Media, 2005.
9. Paxinos G., Watson C. The rat brain atlas in ste-reotaxic coordinates. Fourth Edition. San Diego: Elsevier Acad. Press, 1998.
pects of rehabilitation and rehabilitation technologies in obstetrics: monograph]. Pod red. KHadarcevoj K.A. Tula: OOO «Tul'skij poligrafist»; 2013. Russian.
5. SHabanov PD, Lebedev AA, Meshcherov SHK. Dofamin i podkreplyayushchie sistemy mozga [Do-pamine and the reinforcing systems of the brain]. SPb.: Lan'; 2002. Russian.
6. George SR, Fan T, Nig GY. Low endogenous do-pamine function in brain predisposes to high alcohol preference and consumption: reversal by increasing synaptic dopamine. J. Pharmacol. Exp. Therapy. 1995;273:373-9.
7. Lawrence AJ, Cowen MS, Yang H-J. The orexin system regulates alcohol-seeking in rats. Brit. J. Pharmacol. 2006;148:752-9.
8. Luis de Lecea J. Gregor Sutcliffe. Hypocretins. Integrators of physiological functions. New York: Springer Science and Business Media; 2005.
9. Paxinos G, Watson C. The rat brain atlas in ste-reotaxic coordinates. Fourth Edition. San Diego: Elsevier Acad. Press; 1998.
10. Peyron C, Tighe D.K., van den Pol A.N. Neurons Containing Hypocretin (Orexin) Project to Multiple Neuronal Systems // J. Neurosci. 1998. Vol. 18, № 23. P. 9996-10015.
10. Peyron Q Tighe DK, van den Pol AN. Neurons Containing Hypocretin (Orexin) Project to Multiple Neuronal Systems. J. Neurosci. 1998; 18(23):9996-10015.
11. Richards J.G. Ultrastructural effects of 6-hydroxydopamine on catecholamine-containing neurons in the rat brain. Amsterdam: north-Holland Publ, 1971. P. 151-161.
12. Tissen I.Y., Bychkov E.R., Khokhlov P.P. Interaction between D2 dopamine and OX1R orexin receptors in predator-induced stress // Europ. Neuropharm. 2017. Vol. 27, №12. Р. 1012.
11. Richards JG. Ultrastructural effects of 6-hydroxydopamine on catecholamine-containing neurons in the rat brain. Amsterdam: north-Holland Publ; 1971.
12. Tissen IY, Bychkov ER, Khokhlov PP. Interaction between D2 dopamine and OX1R orexin receptors in predator-induced stress. Europ. Neuropharm. 2017;27(12):1012.
