Научная статья на тему 'Взаимодействие in vivo остеогенных клеток с наноструктурными кальцийфосфатными покрытиями при электронно-индуцированном изменении их поверхностного электрического потенциала'

Взаимодействие in vivo остеогенных клеток с наноструктурными кальцийфосфатными покрытиями при электронно-индуцированном изменении их поверхностного электрического потенциала Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
262
63
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
КОСТНЫЙ МОЗГ / МЫШИ / ЭКТОПИЧЕСКИЙ ОСТЕОГЕНЕЗ / ИСКУССТВЕННЫЕ ПОВЕРХНОСТИ / МОДИФИКАЦИЯ / BONE MARROW / MICE / HETEROTOPIC OSTEOGENESIS / ARTIFICIAL SURFACES / MODIFICATION

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Карлов Анатолий Викторович, Хлусов Игорь Альбертович, Зайцев Константин Васильевич, Дворниченко Марина Владимировна, Больбасов Евгений Николаевич

Биосовместимость и функциональная активность имплантатов для остеосинтеза во многом зависит от процессов, протекающих на границе раздела кость/имплантат. Целью данного исследования было изучение влияния наноструктурирования кальцийфосфатных (КФ) поверхностей, а также их электронной обработки на способность клеток костного мозга формировать костную ткань in situ. Для этого применяли вариант феномена эктопического костеобразования in situ, когда искусственный образец с нанесенным костным мозгом имплантируется под кожу мышей на 45 суток без инъекции дополнительных ростовых факторов. Электронную обработку КФ поверхностей проводили с помощью электронного источника («Kimball Physics Inc.», США) в вакууме 10-7 тор. Образцы с анодно-искровыми КФ покрытиями, выполненными из наноразмерных частиц гидроксиапатита (ГАП) в растворе электролита, облучались зарядом Q1 = 10 мкКл/см2 (низкий уровень облучения) и Q2 = 300 мкКл/см2 (высокий уровень облучения). Результаты показали, что предложенный способ электронной обработки КФ поверхностей, выполненных из наноразмерного ГАП синтетической либо биологической природы, независимо от технологии их изготовления повышает в среднем на 82,5 % вероятность формирования костной ткани в тесте эктопического подкожного остеогенеза. Выявлены 3 механизма улучшения остеогенных свойств наноструктурных КФ покрытий посредством электронного облучения в оптимальной дозе: 1) изменение поверхностной энергии; 2) усиление гидрофобности поверхностей; 3) модификация их элементного состава.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Карлов Анатолий Викторович, Хлусов Игорь Альбертович, Зайцев Константин Васильевич, Дворниченко Марина Владимировна, Больбасов Евгений Николаевич

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

IN VIVO INTERACRION OF OSTEOGENIC CELLS WITH NANOSTRUCTURED CALCIUM PHOSPHATE COATINGS UNDER ELECTRON INDUCED CHANGE OF THEIR SURFACE ELECTRIC POTENTIAL

Biocompatibility and functional activity of implants for osteosynthesis critically depends on properties of biochemical interface bone/implant. In this research we have applied two different techniques for enhancing bone tissue formation from bone marrow cells: electron-induced surface energy modification and nanostructuring of calcium phosphate (CP) coatings. The nanostructured CP coatings have been deposited on titanium samples by anodic spark technology using hydroxyapatite (HAP) nanopartilces. Electron treatment has been conducted in vacuum 10-7 Torr by the use of electron gun («Kimball Physics Inc.»). The samples have been irradiated by low (Q1 = 10 µС/cm2) and high (Q2 = 300 µС/ст2) electron doses. Studies in situ have been implemented by the method of ectopic bone formation when the fabricated and treated sample with bone marrow have been implanted in mice for 45 days without additional injection of tissue growth factors. The results of the performed ectopic subcutaneous osteogenesis test have shown that the developed electron-induced surface energy modification method strongly increases by 82,5 % probability of formation of the bone tissue on nanostructured CP surface under low electron dose. We have found that mechanism of improved formation of the bone tissue may be ascribed to decreasing of modified original surface energy, tailored moderate hydrophobicity and irradiated-induced variation of CP surface composition.

Текст научной работы на тему «Взаимодействие in vivo остеогенных клеток с наноструктурными кальцийфосфатными покрытиями при электронно-индуцированном изменении их поверхностного электрического потенциала»

РАЗНОЕ

УДК 611-018.4:661.635.41-022.532:544.632.3

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ IN VIVO ОСТЕОГЕННЫХ КЛЕТОК С НАНОСТРУКТУРНЫМИ КАЛЬЦИЙФОСФАТНЫМИ ПОКРЫТИЯМИ ПРИ ЭЛЕКТРОННО-ИНДУЦИРОВАННОМ ИЗМЕНЕНИИ ИХ ПОВЕРХНОСТНОГО ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА

Анатолий Викторович КАРЛОВ1, Игорь Альбертович ХЛУСОВ1, Константин Васильевич ЗАЙЦЕВ1, Марина Владимировна ДВОРНИЧЕНКО1, Евгений Николаевич БОЛЬБАСОВ1,

Марина Васильевна чАЙКИНА2, Даниэль АРОНОВ3, Гиль РОЗЕНМАН3

1Томский филиал Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика Г.А. Илизарова Росмедтехнологий 634029, г. Томск, пер. Плеханова, 5

Институт химии твердого тела и механохимии СО РАН 630128, г. Новосибирск, ул. Кутателадзе, 18

3Университет Тель-Авива 69978, Израиль, Рамат-Авив

Биосовместимость и функциональная активность имплантатов для остеосинтеза во многом зависит от процессов, протекающих на границе раздела кость/имплантат. Целью данного исследования было изучение влияния наноструктурирования кальцийфосфатных (КФ) поверхностей, а также их электронной обработки на способность клеток костного мозга формировать костную ткань in situ. Для этого применяли вариант феномена эктопического костеобразования in situ, когда искусственный образец с нанесенным костным мозгом имплантируется под кожу мышей на 45 суток без инъекции дополнительных ростовых факторов. Электронную обработку КФ поверхностей проводили с помощью электронного источника («Kimball Physics Inc.», США) в вакууме 10-7 тор. Образцы с анодно-искровыми КФ покрытиями, выполненными из наноразмерных частиц гидроксиапатита (ГАП) в растворе электролита, облучались зарядом Qj = 10 мкКл/см2 (низкий уровень облучения) и Q2 = 300 мкКл/см2 (высокий уровень облучения). Результаты показали, что предложенный способ электронной обработки КФ поверхностей, выполненных из наноразмерного ГАП синтетической либо биологической природы, независимо от технологии их изготовления повышает в среднем на 82,5 % вероятность формирования костной ткани в тесте эктопического подкожного остеогенеза. Выявлены 3 механизма улучшения остеогенных свойств наноструктурных КФ покрытий посредством электронного облучения в оптимальной дозе: 1) изменение поверхностной энергии; 2) усиление гидрофобности поверхностей; 3) модификация их элементного состава.

Ключевые слова: костный мозг, мыши, эктопический остеогенез, искусственные поверхности, модификация.

Применение метода экзоэлектронной эмиссии, чувствительной к наличию дефектов в тонких поверхностных слоях, позволило установить, что наноструктурированная кальцийфосфатная (КФ) поверхность обладает высокой дефектностью. Более того, оказалось, что часть дефектов, представляющих собой центры электронно-дырочного захвата, несут электрический заряд [1]. Электрическая поляризация гидроксиапатитовой (ГАП) керамики значительно улучшает ее биологические свойства [2, 3], что может иметь значение для

прилипания остеогенных клеток и реализации их потенциала.

Тем не менее, не существует единого механизма адгезии клеток и биомолекул. В качестве потенциальных приложений рассматривают силы Ван-дер-Ваальса, водородные, электростатические, гидрофобно-гидрофильные и рецепторные взаимодействия, факторы адгезии (лектин, фибронек-тин, коллаген и т. д.) [4—6]. Для адаптации биологических подложек разработаны электрические, оптические, электрохимические и другие методы,

Карлов А.В. — директор

Хлусов И.А. — зам. директора по науке; e-mail: khl@comm.tomsknet.ru

Зайцев К.В. — вед.н.с. лаборатории патофизиологии и биомеханики имплантируемых устройств Дворниченко М.В. — ученый секретарь

Больбасов Е.Н. — мл.н.с. лаборатории токсикологии и культуры тканей Чайкина М.В. — вед.н.с. лаборатории интеркаляционных и механохимическихреакций Аронов Д. — аспирант кафедры физической электроники Розенман Г. — проф. кафедры физической электроники

общей чертой которых является модификация исходной поверхностной энергии и связанных с ней свойств подложки (смачиваемость, адсорбция, адгезия и т. д.).

Другой подход к трансформации взаимодействий на межфазной границе клетка (биомоле-кула)/поверхность биоматериала был предложен в наших работах [7—9]. Эта новая концепция базируется на электронно-индуцированной модификации поверхностной энергии с помощью низкоэнергетического электронного облучения. При этом энергия электронов и электронная плотность тока адаптированы к природе материала и его электронной структуре вблизи поверхности так, чтобы не создавать новых дефектов и не менять фазового состояния в поверхностном слое. В разработанном методе бомбардирующие первичные электроны с энергией порядка 100 эВ и генерируемые вторичные электроны и дырки проникают на глубину 10—20 А и захватываются ловушками, расположенными на поверхности и в объемных локальных центрах вблизи поверхности.

Вследствие различной подвижности электронов и дырок эти локализованные заряды образуют двойной электрический слой и меняют потенциал поверхности. Было найдено, что электронно -индуцированое измененение поверхностного электрического потенциала сопровождается сильно выраженной модификацией поверхностной энергии материалов и связанных с ней базовых свойств, таких как адгезия, адсорбция, смачиваемость и другие [9-12].

По мнению различных исследователей и клиницистов, биосовместимость и функциональная активность погружных конструкций для остеосинтеза во многом зависит от процессов, протекающих на границе раздела кость/имплантат [13]. Ранее нами было показано существенное влияние физико-химических свойств КФ поверхностей на реализацию in vivo остеогенного потенциала муль-типотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга [14-16].

В связи с бурным развитием наноиндустрии представляется актуальным исследование in vivo реакции остеогенных клеток костного мозга на наноструктурные КФ покрытия, модификацию их биологических свойств посредством электронного облучения.

Материал и методы

Наноразмерные порошки синтетического или биологического ГАП (из костей крупного рогатого скота) для изготовления покрытий получали механохимическим методом, как описано нами ранее [17]. Электронная микроскопия («JEM-200CX», Япония) показала, что наряду с частицами диаметром 10-40 нм в порошке присутствуют их агрегаты размером до 100 нм (рис. 1). Идентичность нанопорошков элементному и фазовому составу Са10(РО4)6(ОН)2 подтверждена данными дифракции

Рис. 1. Электронная микроскопия порошка ГАП перед изготовлением покрытий. Увеличение 100 000

рентгеновских лучей, инфракрасной спектроскопии и спектроскопии рентгеновских фотоэлектронов.

Двусторонние КФ покрытия формировали, как описано ранее [18], в модифицированном варианте. Титановые диски марки ВТ-6 обрабатывали анодно-искровым способом в 10%-ном растворе фосфорной кислоты, содержащей СаСО3 и взвесь наночастиц ГАП синтетического или биологического происхождения. Были получены 4 группы модифицированных покрытий: 1) металлокерамическое оксидтитановое покрытие без КФ слоя; 2) ГАП синтетическое при обычном режиме оксидирования; 3) ГАП синтетическое при новом режиме оксидирования; 4) ГАП биологическое при новом режиме оксидирования. Смена режимов была связана с варьированием частоты импульсного тока в диапазоне 1-10 Гц и длительности импульсов от 20 до 200 мс.

Электронную обработку КФ поверхностей осуществляли в вакууме 10-7 тор с помощью источника электронов «ЮтЬаП Physics Inc.» (США). Для того чтобы локализовать область, облученную электронами вблизи КФ поверхностей, энергия электронов была выбрана приблизительно в 100 эВ, что обеспечивает проникновение электронов на глубину до 20 А. Образцы были облучены с зарядом Qj = 10 мкЕл^м2 (низкий уровень облучения) и Q2 = 300 мкКл^м2 (высокий уровень облучения).

Морфологию и структуру поверхности биосов-местимых покрытий выявляли методом растровой электронной микроскопии (РЭМ) (RAITH 150, «Ultra High Resolution E-Веат Тоо1», Германия) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) (МиШтоёе, «Digtol Instruments», США). Дополнительно оценивалось состояние поверхности КФ покрытий по значениям параметров вертикальных неровностей профиля с помощью измерительной системы «Та^ий" 5-120» (разрешающая способность 1 нм). Определялись следующие параметры шероховатости подложек: 1) класс шероховатости согласно

ГОСТу 2789-73; 2) Ra (мкм) - средний результат шероховатости в пределах нескольких длин участков измерений.

Элементный химический состав был определен с помощью рентгенофотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) («5600 Multi-Technique System», США) с использованием монохроматического излучения AlKa (hv = 1486,6 эВ).

Распределение поверхностного потенциала изучалось с помощью электросиловой микроскопии (ЭСМ). Метод основан на измерении контактной разности потенциалов между зондом (нанометро-вый наконечник АСМ) и поверхностью образца, так называемый метод Кельвина [19]. Для исследования распределения потенциала ф на поверхности образцов применялась двухпроходная методика (LiftModeTM). В каждой строке сканирования производится следующая процедура. На первом проходе с помощью пьезовибратора возбуждаются колебания кантилевера на частоте, близкой к резонансной, и0, и снимается АСМ-изображение рельефа в «полуконтактном» режиме (Тарр^ Mode). Затем зонд отводится от поверхности на расстояние z0, между зондом и образцом подается переменное (на частоте и = и0) напряжение, и осуществляется повторное сканирование.

Таким образом, напряжение между зондом и поверхностью образца можно представить в виде: V0 + Vc sin(fflt) + ф. На втором проходе зонд движется над поверхностью по траектории, повторяющей рельеф образца. Поскольку в процессе сканирования локальное расстояние между зондом и поверхностью в каждой точке постоянно, изменения амплитуды колебаний кантилевера на частоте 2и будут связаны с изменением емкости системы «зонд - образец», вследствие изменения поверхностного потенциала ф. При сканировании образца на втором проходе в каждой точке, с помощью перестраиваемого источника постоянного напряжения, подбирается величина V0 таким образом, чтобы амплитуда колебаний кантилевера на частоте и становилась равной нулю. Измерения проводились, используя Si-наконечники с Pt/Ir проводящим покрытием с диаметром ~ 30 нм. ЭСМ показывает распределение электрического потенциала по КФ поверхности.

Смачиваемость поверхностей выявляли посредством измерения эффективного краевого угла 0 капли деионизированной воды, используя как оптические измерения (микроскоп Olympus MX-50, Япония), так и специально разработанную установку, которая позволяет при помощи двух ортогонально ориентированных видеокамер, подключенных к компьютерной системе, получать информацию об угле смачиваемости с учетом неоднородности поверхности. Исследования выполнялись при температуре 26 ± 1 °С и влажности 45 ± 5 %.

Ранее проведенные работы показали [14-16], что адекватным экспериментальным подходом для определения остеогенных свойств КФ материалов

является вариант феномена эктопического костеобразования in situ, когда искусственный образец с нанесенным костным мозгом имплантируется под кожу без инъекции дополнительных ростовых факторов.

В биологической части экспериментов использовали 26 мышей-самцов линии CBA/CаLаc.

17 животным под эфирным наркозом подкожно вводили по 1 имплантату (диаметр 12 мм, толщина 1 мм) с нанесенным в асептических условиях столбиком сингенного костного мозга, взятого из бедренной кости. В каждой из 4-х групп применяли 3 образца (необработанный диск, облученный низкой или высокой дозой электронов) и 5 дополнительных дисков с необработанными наноструктурными КФ покрытиями.

Для адгезии клеток органную культуру костного мозга на подложке культивировали в течение 45 мин в культуральной среде, содержащей 95 % среды RPMI-1640 и 5 % эмбриональной телячьей сыворотки («ICN», США). Костный мозг служил источником ММСК и ростовых факторов. При раздельном подкожном введении мышам подложек или фрагментов костного мозга образования тканевых пластинок не наблюдалось.

Эксперименты на животных выполнялись с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации.

Через 1,5 мес. имплантаты извлекали, фотографировали в отраженном свете с фиксированными параметрами. Проводили количественную морфометрию цифровых изображений согласно статистике серых уровней посредством программы «Photoshop 6.0», как описано ранее [20]. Для гистологического анализа применяли стандартные методы световой микроскопии тонких срезов. После декальцинации тканевых пластинок, выросших на имплантатах, осуществляли обычную окраску гематоксилином - эозином парафиновых срезов, выполненных перпендикулярно поверхности дисков.

Статистическую обработку данных проводили с применением непараметрического Т-критерия Вилкоксона (PT).

Результаты и обсуждение

Исследование поверхности КФ покрытий, полученных с помощью анодно-искрового оксидирования поверхностей в электролите, содержащем наночастицы ГАП, показало наличие нано-, микро- и макрорельефа. Согласно ЭСМ с зондом Кельвина, рельеф КФ покрытий формируется из частиц с диаметром до 500 нм, образующих глобулы диаметром около 1 мкм и высотой примерно 30 нм. Согласно АСМ, они формируют микро-сферолиты, имеющие диаметр до 3-5 мкм и высоту до 300 нм. В центре микросферолитов и между ними располагаются сквозные поры диаметром менее 1-2 мкм, доходящие до металлической подложки (рис. 2).

Рис. 2. 2Б-топография наноструктурных КФ

покрытий согласно АСМ. Увеличение 10 000 (линейка на рис. соответствует 1 мкм)

РЭМ отчетливо демонстрирует выраженный макрорельеф наноструктурных КФ поверхностей, представленный сферолитами диаметром до 30 мкм с единичными или многочисленными порами 5—20 мкм в диаметре. Шероховатость всех типов КФ поверхностей, выполненных из наночастиц ГАП, соответствовала 4—5 классу ГОСТа со средним Ra = 5,13—6,43 мкм.

Согласно существующей панели корреляционных взаимоотношений физических (пористость, шероховатость) и биологических свойств анодноискровых КФ поверхностей [15], вероятность образования тканевой пластинки на наноструктурных КФ покрытиях должна составлять 80—100 %. Реально был получен 100%-ный выход тканевых пластинок на 8 образцах необлученных наноструктурных КФ покрытий. Площадь пластинок увеличивается на 133—214 % от первоначальной, что свидетельствует в пользу адгезии и продвижения (кондукции) костномозговых клеток по искусственным поверхностям.

Следует отметить тот факт, что на металлокерамических поверхностях без КФ слоя эктопический гистогенез, тем более остеогенез, не протекал в принципе, что соответствует ранее полученным результатам [15]. Таким образом, наличие КФ слоя является важным условием для эктопического гистогенеза в его подкожном варианте.

Однако гистологические исследования 8 тканевых пластинок показали, что на наноструктурных КФ покрытиях грубоволокнистая костная ткань формировалась только в 1 из 8 случаев (12,5 %). В то же время ожидаемая вероятность остеогенеза для наноструктурных КФ покрытий, согласно данным их шероховатости, должна составлять 67—83 % (рис. 3). Зависимость вероятности костеобразования от Ra построена по ранее полученным данным [15] для анодно-искровых

КФ покрытий, полученных из ГАП микронного размера.

Таким образом, КФ покрытия, выполненные из наноразмерного ГАП различной природы (синтетический либо биологический), независимо от технологии их изготовления, слабо способствуют росту костной ткани. В большинстве случаев из костного мозга формируется васкуляризированная рыхлая, неоформленная соединительная ткань, иногда с примесью мышечной (рис. 4) и жировой тканей.

Одним из объяснений биологической «дефектности» КФ покрытий, выполненных из нанораз-мерных частиц, является, по-видимому, снижение полярности их поверхности. Это препятствует дифференцировке пула стромальных стволовых клеток в остеобласты и в стромальные клетки, способные поддерживать кроветворение.

Детальные исследования физических свойств, таких как фото- и термолюминесценция, термостимулированная экзоэлектронная эмиссия, фо-тоольтаическая спектроскопия, показали, что ГАП керамика представляет собой полупроводник р-типа с большой шириной запрещенной зоны, составляющей примерно 4 эВ [10]. Электронные свойства ГАП нанокерамики могут быть сильно модифицированы вблизи поверхности отдельно от объема в результате использования электронов низкой энергии. Вариация заселенности поверхностных состояний и объемных локальных уровней вблизи ГАП поверхности вторичными электронами и дырками, индуцированными налетающими низкоэнергетическими электронами, приводит к измененению поверхностного электрического потенциала. В связи с тем, что предлагаемая электронная обработка не влияет на биологические свойства металлокерамического (титанооксидного) диэлектрического покрытия, следует предположить, что основной мишенью

Рис. 3. Зависимость образования костной ткани

от шероховатости поверхности КФ покрытий. По оси абсцисс — Яа, мкм; по оси ординат — вероятность остеогенеза, %

Рис. 4. Морфологическая структура тканевых пластинок, выросших на необработанных электронами наноструктурных КФ поверхностях в тесте эктопического остеогенеза.

Определяются участки мышечных волокон (1), соединительной ткани (2).

Окраска гематоксилином — эозином. Увеличение 400

электронов являются наночастицы фосфатов кальция.

Известно, что в случае прикладывания постоянного электрического поля in vitro в пределах

0,1-1 В/мм остеобласты быстро мигрируют к отрицательному, а остеокласты - к позитивному электроду [21]. Различный электрический вектор остеогенных клеток может лежать в основе остеоиндукции на искусственных подложках. Результаты ЭСМ измерений действительно показывают возрастание разности поверхностных потенциалов Дф после электронного облучения, которое дости-

гает 0,6 В между исходной и заряженной КФ поверхностью [8]. Мы нашли, что электронная обработка усиливает биомиметические свойства КФ покрытий. Так, статистически значимо (Рт < 0,05) возрастает площадь тканевых пластинок (рис. 5), гистологическая структура которых полностью соответствует грубоволокнистой костной ткани, содержащей костный мозг (рис. 6).

Известно, что увеличение электропроводности (уменьшение поляризационного сопротивления, Rп) искусственных материалов препятствует адгезии остеобластов, активно взаимодействующих с гидрофобными поверхностями типа оксида циркония ZrO2. При повышении электропроводности (величины обратного сопротивления, 1/Rп) доля прилипших костных клеток уменьшается [22].

Вероятно, с этим связано нарушение гистогенеза при индукции высоких уровней заряда на КФ наноструктурных поверхностях. Согласно Т-критерию Вилкоксона, площадь формирования тканевых пластинок на покрытиях оказалась достоверно ниже (Рт < 0,05) по сравнению с обработкой электронами, несущими заряд 10 мкКл/см2. В 2-х случаях из 3-х тканевые пластинки оказались настолько тонкими, что не удалось приготовить гистологические препараты, несмотря на то, что площадь исходного костного мозга, нанесенного на покрытия, не отличалась от других образцов.

С другой стороны, в результате электронного облучения исследованные поверхности демонстрируют резкие различия в смачиваемости. Исходные (незаряженные) наноструктурные КФ поверхности глубоко гидрофильны с краевым углом 0 = 10°. Гидрофильные поверхности способствуют прилипанию и распространению фибробластов [23], что, по-видимому, является одним из меха-

0

— 10 -*-300

Рис. 5. Зависимость роста тканевых пластинок на различных типах покрытий от дозы электронной обработки.

По оси абсцисс — группы покрытий, расшифровка в тексте; по оси ординат — площадь тканевых пластинок, % от исходной площади костного мозга. 0 — исходные (без заряда) покрытия;

10 и 300 мкКл/см2 — низкий и высокий уровни заряда покрытий

Рис. 6. Морфологическая структура тканевых

пластинок, выросших на наноструктурных КФ поверхностях, предварительно обработанных электронами в низкой дозе.

Определяются кристаллы КФ покрытия (1), на котором располагается костная пластинка (2) с лакунами, заполненными красным костным мозгом (3). Окраска гематоксилином — эозином. Увеличение 200

низмов преимущественного роста соединительном ткани на исходных (необработанных электронами) наноструктурных КФ покрытиях.

Образцы КФ поверхностей, дополнительно обработанные электронами, характеризуются увеличением краевого угла 0. Так, облученный зарядом Q1=10 мкКл/см2 (низкий уровень облучения) ГАП демонстрирует краевой угол 0 = 30°. Рост заряда до уровня Q2 = 300 мкКл/см2 (высокий уровень облучения) приводит к увеличению краевого угла до 0 = 100°, и такие образцы ГАП могут быть однозначно отнесены к сильно гидрофобным. При этом образцы, обработанные низкой дозой электронов, улучшают результаты эктопического остеогенеза в сравнении с необлученными или получившими более высокую дозу поверхностями (рис. 5).

Таким образом, для успеха теста эктопического костеобразования, моделирующего поведение имплантатов в процессе остеосинтеза, имеет значение, наряду с другими физическими характеристиками, оптимальная величина поверхностной энергии КФ покрытий, влияющая на их смачиваемость. Следует отметить, что в случае низкоэнергетической электронной обработки поверхностей результаты остеоиндукции достаточно стабильны и практически не зависят от вида наночастиц ГАП и способов формирования покрытий.

Прилипание и продвижение стромальных клеток (в том числе остеогенных) детерминированы физическими свойствами поверхности имплантата, их дифференцировка в костную ткань обусловливается достаточным наличием кальция и соотношением Са/Р [15]. На стволовых клетках костного мозга экспрессируются Са2+-чувствительные рецепторы [24], регулирующие их хоминг и диф-ференцировочные потенции. РФЭС измерения элементного состава нативных (необработанных) наноструктурных КФ поверхностей показали мо-

лярное соотношение Ca/P=0,27 (табл.), недостаточное для остеоиндукции [15].

Облучение электронами вызывало прогрессивный захват углерода в структуру покрытий с вытеснением других элементов (табл.), что увеличивает гидрофобность поверхности. Известно, что карбонатное замещение (СОз) гидроксильной группы в структуре ГАП повышает его биологическую активность [25]. Так, S.A. Redey и соавт. [26] показали зависимость адгезии остеокластов in vitro от поверхностной энергии, а их распространение — от химии поверхности ГАП. В то же время высокий уровень заряда поверхности, посредством практически двукратного снижения концентрации кальция, фосфора и кислорода в покрытиях (табл.), мог негативно влиять на воспроизводимость теста эктопического костеобразования.

Описано несколько тонких физико-химических процессов (шероховатость, смачиваемость, поляризация, поверхностная энергия, химический состав), регулирующих поведение различных типов клеток (фибробластов, остеобластов, остеокластов) на искусственных поверхностях in vitro [22, 27]. В наших экспериментах с многоклеточной системой костного мозга in situ подобная модификация физико-химических параметров КФ покрытий способствует, вероятно, селекции и дифференцировке потомков ММСК в одном из вероятных направлений формирования тканей мезенхимального происхождения.

Заключение

Для успешного теста эктопического остеогенеза на металлических подложках необходимо формирование КФ слоя. При этом покрытия, выполненные из наноразмерных частиц ГАП, теряют способность влиять на дифференцировку ММСК в остеогенном направлении. Предложенный способ электронной обработки наноструктурных КФ поверхностей стимулирует в среднем на 82,5 %

Таблица

Элементный состав наноструктурных КФ покрытий согласно данным рентгенофотоэлектронной спектроскопии, Х

Элемент в покрытии Поверхности до обработки электронами, моль Поверхности после низкоэнергетической обработки, % от исходного уровня Поверхности после высокоэнергетической обработки, % от исходного уровня

Углерод 20,29 154 283

&слород 56,04 86 54

Kальций 3,97 83 51

Фосфор 14,71 89 53

Азот 1,97 59 27

Титан 3,02 66 37

Примечание: представлены средние значения трех измерений. 110

вероятность формирования костной ткани в тесте подкожного остеогенеза. Технологичным является облучение электронным пучком, несущим заряд 10 мкКл/см2. Изменение поверхностной энергии наноструктурных КФ покрытий посредством электронного облучения усиливает захват углерода и гидрофобность поверхностей, что, по-видимому, в оптимальном интервале воздействия лежит в основе улучшения роста костной ткани.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ р_офи (№ 08-04-99012 и № 09-04-99105).

Список литературы

1. Aronov D., Rosenman G. Traps states spectroscopy studies and wettability modification of hydroxy-apatite nano-bio-ceramics // J. Appl. Phys. 2007. 101. 034701.

2. Yamashita K., Kitagaki K., Umegaki T. Thermal instability and proton conductivity of ceramic hydroxyapatite at high temperatures // J. Am. Ceram. Soc. 1995. 78. 1191-1197.

3. Nakamura S., Takeda H., Yamashita K. Proton transport polarization and depolarization of hydroxyapatite ceramics // J. Appl. Phys. 2001. 89. 5386-5392.

4. Шахов В.П., Хлусов И.А., Дамбаев Г.Ц. и др. Введение в методы культуры клеток, биоинженерии органов и тканей / Под ред. В.В. Новицкого, В.П. Шахова, И.А. Хлусова, Г.Ц. Дамбаева. Томск, 2004. 386 с.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Shakhov V.P., Khlusov I.A., Dambaev G.Ts. et al. Introduction to methods of cell culture, bioengineering of organs and tisues / Ed. V.V. Novitsky, V.P. Shakhov, I.A. Khlusov, G.Ts. Dambaev. Tomsk,

2004. 386 p.

5. Lahann J., Langer R. Smart materials with dynamically controllable surfaces // MRS Bull. 2005. 30. 185-188.

6. McCaig D., Zhao M. Physiological electrical fields modify cell behaviour // BioEssays. 1997. 19. 819-826.

7. Rosenman G., Aronov D., Dekhtyar Yu. Method and device for wettability modification of materials // Pending to PCT Application. 2006. 60. 730021.

8. Aronov D., Rosenman G., Karlov A., Shashkin A. Wettability patterning of hydroxyapatite nanobioceramics induced by surface potential modification // Appl. Phys. Lett. 2006. 88. 163902-163903.

9. Aronov D., Rosenman G. Traps States spectroscopy studies and wettability modification of hydroxyapatite nano-bio-ceramics // J. Appl. Phys. 2007. 101. 034701.

10. Rosenman G, Aronov D. Wettability engineering and bioactivation of hydroxyapatite nanoceramics // Intern. Tech. Proc. Nanotech. Conf. Boston, 2006. 2. 91-94.

11. Rosenman G., Aronov D., Oster L. et al. Photoluminescence and surface photovoltage spectroscopy

studies of hydroxyapatite nano-bio-ceramics // J. Luminescence. 2006. 122-123. 936-938.

12. Aronov D., Rosen R., Ron E.Z., Rosenman G. Tunable hydroxyapatite wettability effect on adhesion of biological molecules // Proc. Biochem. 2006. 41. 2367-2372.

13. Nepola J.V. Rockwood and Green’s fractures in Adults. Four Edition. Philadelphia, 1996. 1. 229-304.

14. Карлов А.В., Хлусов И.А. Зависимость процессов репаративного остеогенеза от поверхностных свойств имплантатов для остеосинтеза // Гений ортопедии. 2003. 3. 46-51.

Karlov A.V., Khlusov I.A. Dependence of processes reparation osteogenesis from superficial properties of implants for an osteosynthesis // Genij ortho-pedii. 2003. 3. 46-51.

15. Хлусов И.А., Карлов А.В., Шаркеев Ю.П. и др. Остеогенный потенциал мезенхимальных стволовых клеток костного мозга in situ: роль физикохимических свойств искусственных поверхностей // Клеточные технологии в биологии и медицине.

2005. 3. 164-173.

Khlusov I.A., Karlov A.V., Sharkeev Yu.P. et al. Osteogene potential of bone marrow stem cell in situ: a role of physical and chemical properties of artificial surfaces // Cellular technologies in biology and medicine. 2005. 3. 164-173.

16. Хлусов И.А., Карлов А.В., Поженько Н.С. и др. Зависимость остеогенных свойств клеток костного мозга от рельефа и растворимости кальцийфос-фатных покрытий // Бюл. эксперим. биол. и мед.

2006. 141. (1). 107-112.

Khlusov I.A., Karlov A.V., Pogen’ko N.S. et al. Dependence of osteogene properties of bone marrow stem cell on a relief and solubility calcium phosphate coverings // Byul. eksperim. biol. i med. 2006. 141. (1). 107-112.

17. Чайкина М.В., Хлусов И.А., Карлов А.В., Пай-чадзе К.С. Механохимический синтез нестехиометрических и замещенных апатитов с наноразмер-ными частицами для использования в качестве биосовместимых материалов // Химия в интересах устойчивого развития. 2004. 12. 389-399.

Chaikina M.V., Khlusov I.A., Karlov A.V., Pay-chadze K.C. Mechanochemical synthesis nonstechio-metric and the replaced apatites with nanometrics particles for use as biocompatible materials // Chemistry in interests of a sustainable development. 2004. 12. 389-399.

18. Карлов А.В., Верещагин В.И., Шахов В.П. и др. Остеоиндуктивные, остеокондуктивные и электрохимические свойства кальцийфосфатных покрытий на титановых имплантатах и влияние их на минеральный обмен при переломах трубчатых костей в эксперименте // Гений ортопедии. 1999.

4. 28-33.

Karlov A. V., Vereschagin V.I., Shakhov V.P. et al. Osteoinductive, osteoconductive and electrochemical properties of calcium phosphate coverings on titanic implants and their influence on a mineral metabolism

at crises of tubular bones in experiment // Genij orthopedii. 1999. 4. 28-33.

19. Nonnenmacher M., O’Boyle M.P., Wikrama-singhe H.K. Kelvin probe force microscopy // Appl. Phys. Lett. 1991. 58. 2921-2923.

20. Карлов А.В., Хлусов И.А., Хохлов А.В. Биомеханическое поведение в кости титановых имплантатов с модифицированной поверхностью // Гений ортопедии. 2001. 3. 57-63.

Karlov A.V., Khlusov I.A. Khokhlov A.V Biomechanical behaviour of titanic implants with the modified surface in bone // Genij Orthopedii. 2001. 3. 57-63.

21. Ferrier J., Ross S.M., Kanehisa J., Aubin J.E. Osteoclasts and osteoblasts migrate in opposite directions in response to a constant electrical field // J. Cell. Physiol. 1986. 129. (3). 283-288.

22. Kovacs P., Davidson G.A. Medical applications of titanium and its alloys: the material and biological issues. ASTM STP 1272 // Eds. S.A. Brown, J.E. Lemons. Am. Soc. for Nesting an Materials, 1996. 163-178.

23. Webb K., Hlady V., Tresco P.A. Relative importance of surface wettabillity and charged functional groups on NIH 3T3 fibroblasts attachment, spreading, and cytosqueletal organization // J. Biomed. Mater. Res. 1998. 241. 422-430.

24. Adams G.B., Chabner K.T., Alley I.R. et al. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor // Nature. 2006. 439. 599-603

25. Daculsi G. New technology for calcium phosphate bioactive ceramics in bone repair // Proc. EMBEC’99. Vienna, 1999. 37 (II). 1598-1599.

26. Redey S.A., Razzouk S., Rey C. et al. Osteoclasts adhesion and activity on synthetic hydroxyapatite, carbonated hydroxyapatite, and natural calcium carbonate: relationship to surface energies // J. Biomed. Mater. Res. 1999. 45. 140-147.

27. Ponsonnet L., Reybier K., Jaffrezic N. et al. Relationship between surface properties (roughness, wettability) of titanium and titanium alloys and cell behaviour // Mat. Sci. Eng. 2003. 23. 551-560.

IN VIVO INTERACRION OF OSTEOGENIC CELLS WITH NANOSTRUCTURED CALCIUM PHOSPHATE COATINGS UNDER ELECTRON INDUCED CHANGE OF THEIR SURFACE ELECTRIC POTENTIAL

Anatoly Viktorovich KARLOV1, Igor Albertovich KHLUSOV1, Konstsntin Vasilyevich ZAITSEV1,

Marina Vladimirovna DVORNICHENKO1, Evgeny Nikolaevich BOL’BASOV1,

Marina Vasilyevna CHAIKINA2, Daniel ARONOV3, Gil ROSENMAN3

Russian Scientific Center «Restorative Traumatology and Orthopedics» named after G.A. Ilizarov Rosmedtechnologii 634029, Tomsk, Plekhanov st., 5

2Institute of Solid State Chemistry and Mechanochemistry SB RAS 630128, Novosibirsk, Kutateladze st. 18

3Tel’-Aviv University 69978, Israel, Ramat-Aviv

Biocompatibility and functional activity of implants for osteosynthesis critically depends on properties of biochemical interface bone/implant. In this research we have applied two different techniques for enhancing bone tissue formation from bone marrow cells: electron-induced surface energy modification and nanostructuring of calcium phosphate (CP) coatings. The nanostructured CP coatings have been deposited on titanium samples by anodic spark technology using hydroxyapatite (HAP) nanopartilces. Electron treatment has been conducted in vacuum 10-7 Torr by the use of electron gun («Kimball Physics Inc.»). The samples have been irradiated by low (Qj = 10 ^C/cm2) and high (Q2 = 300 ^C/cm2) electron doses. Studies in situ have been implemented by the method of ectopic bone formation when the fabricated and treated sample with bone marrow have been implanted in mice for 45 days without additional injection of tissue growth factors. The results of the performed ectopic subcutaneous osteogenesis test have shown that the developed electron-induced surface energy modification method strongly increases by 82,5 % probability of formation of the bone tissue on nanostructured CP surface under low electron dose. We have found that mechanism of improved formation of the bone tissue may be ascribed to decreasing of modified original surface energy, tailored moderate hydrophobicity and irradiated-induced variation of CP surface composition.

Key words: bone marrow, mice, heterotopic osteogenesis, artificial surfaces, modification. Karlov A.V. — director

Khlusov I.A. — deputy director on science; e-mail: khl@comm.tomsknet.ru

Zaitsev K.V. — leading researcher of laboratory of pathophysiology and implants biomechanics

Dvornichenko M.V. — academic secretary

Bol’basov E.N. — junior researcher of laboratory of toxicology and tissues culture Chaikina M.V. — leading researcher of laboratory of intercalative and mechanochemical reactions Aronov D. — post-graduate of department of electrical engineering physical electronics Rosenman G. — professor of department of electrical engineering physical electronics

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.