CC BY
005.18.04 - ТЕХНОЛОГИЯ МЯСНЫХ, МОЛОЧНЫХ И РЫБНЫХ ПРОДУКТОВ
И ХОЛОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВ _(ТЕХНИЧЕСКИЕ НА УКИ)_
С.Н. Хазагаева, канд. техн. наук, доц., е-mail: shazagaeva@mail.ru А.В. Щекотова, канд. техн. наук, доц., е-mail: anna-krivonosova@yandex.ru Д.Н. Хамханова, д-р техн. наук, доц., е-mail: metrolog@esstu.ru Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления, г. Улан-Удэ
УДК 637.045:636.046:665.93
ВЫЖИВАЕМОСТЬ ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДАХ КОНСЕРВИРОВАНИЯ
В статье приведены результаты исследований по изучению жизнеспособности пробиотических бактерий при замораживании и сублимационном высушивании. Консорциум пробиотических бактерий культивировали на питательной среде с добавлением селенита натрия в концентрации 0,03 мг/мл для стимулирования синтеза экзополисахаридов. Консервирование микроорганизмов проводили при достижении стационарной фазы развития. Для концентрирования биомассы использовали центрифугирование с частотой вращения 3000 об./мин в течение 25 мин. В качестве защитной среды использовали стерильный 10%-ный раствор сахарозы с добавлением буферных солей. Биомассу бактерий замораживали при температуре минус (18-22) °C в течение двух часов. Опытным путем были подобраны оптимальные режимы лиофилизации: давление -0,01-0,03 атм., температура минус (50,351,2) оС, продолжительность 28 ч. Массовая доля влаги в высушенном препарате составила 4 %. Выживаемость культур при высушивании составила 76-85 % в зависимости от видовой принадлежности.
Ключевые слова: пробиотические бактерии, вакуум-сублимационная сушка, экзополисахариды, консервирование микроорганизмов.
S.N. Khazagaeva, Cand. Sc. Engineering A.V. S^ekotova, Cand. Sc. Engineering D.N. Khamkhanova, Dr. Sc. Engineering, Assoc. Prof.
SURVIVAL OF PROBIOTIC BACTERIA IN DIFFERENT TYPES OF PRESERVATION
The article presents the results of studies on the viability of probiotic bacteria during freezing and freeze-drying. A consortium of probiotic bacteria was cultured on a nutrient medium with the addition of sodium Selenite at a concentration of 0.03 mg / ml to stimulate the synthesis of exopolysaccharides. Preservation of microorganisms was carried out when the stationary phase of development was reached. Centrifugation with a rotational speed of 3000 rpm for 25 minutes was used to concentrate the biomass. As a protective medium, a sterile 10% solution of saharosa with the addition of buffer salts was used. The biomass of bacteria was frozen at a temperature of minus (18-22) oC for two hours. Optimal lyophilization regimes were selected empirically: pressure 0.01-0.03 atm., temperature minus 50.3-51.2 oC, duration 28 hours. The mass fraction of moisture in the dried product is 2%. The survival rate of crops during drying is 76-85 % depending on the species.
Key words: probiotic bacteria, vacuum freeze-drying, exopolysaccharides, preservation of microorganisms.
Сохранение штаммов культур в жизнеспособном состоянии без потери производственно-ценных свойств является одной из важных задач в пищевой биотехнологии. Анабиоз как естественный процесс выживания клетки остается наиболее эффективным способом консервирования бактерий. Длительность хранения бактерий, введенных в ксероанабиоз, достигает 50 лет с сохранением высокой плотности популяций в препарате.
5
В связи с огромным разнообразием существующих микроорганизмов единого протокола сохранения микробных культур, отвечающего всем предъявляемым требованиям, не существует. Методы хранения микробных культур широко варьируют для разных видов микроорганизмов в силу большого разнообразия присущих им биологических свойств. Даже для разных штаммов одного вида не всегда приемлем один и тот же метод [3].
Изучение способности пробиотических микроорганизмов переживать стрессовые условия при замораживании и сублимации вызвано научным интересом в рамках теории адаптации и необходимостью создания продуктов на основе устойчивых пробиотических культур, длительное время сохраняющих способность к размножению, без утраты и изменения нативных свойств.
Объекты и методы исследований
Объектом исследований являлась ассоциация культур бактерий Propionibacterium sher-тапи, Bifidobacterium bifidum и Lactococcus lactis из фонда ВКПМ (г. Москва).
Наращивание биомассы консорциума пробиотических микроорганизмов проводили на сывороточной среде с добавлением буферных солей, структурирующего агента и антиокси-дантов с промежуточной нейтрализацией до наступления стационарной фазы. Для оптимизации среды в целях повышения синтеза экзополисахаридов микроорганизмами закваски использовали стерильный 1%-ный раствор селенита натрия.
Лиофилизацию биомассы бактерий проводили на аппарате сублимационной сушки марки УаеиРго II. Для количественного учета микроорганизмов использовались стандартные бактериологические методы.
Результаты и их обсуждение
Длительное хранение бактерий с сохранением ценных свойств основано на ингибирова-нии протекающих обменных процессов в клетке. К таким способам относятся криоанабиоз микроорганизмов и высушивание бактерий из замороженного состояния (лиофилизация). Эффект консервации при сублимации достигается путем снижения активности воды путем удаления свободной влаги в условиях субнулевых температур.
При замораживании для защиты биомассы применяли среду на основе сахарозы и натрия лимоннокислого. В присутствии в среде натрия лимоннокислого происходят обратимые повреждения аминокислотной транспортной системы клетки, сахароза повышает вязкость среды, снижая скорость движения молекул воды и обезвоживания мембран.
Концентрированную биомассу смешивали с защитной средой в равных соотношениях и замораживали при температуре минус (18-22) оС. После реактивации замороженного препарата определяли количество жизнеспособных клеток. Влияние процесса замораживания на сохранность жизнеспособных клеток показано на рисунке 1.
12 -
ё 11,5 -■-
I I I
B. bifldum 83 Ь. cremoris 244 P. shermanii ■ До замораживания ■ После замораживания
Рисунок 1 - Выживаемость культур консорциума при замораживании
Как видно из представленных данных, количество жизнеспособных клеток снижается незначительно, культуры консорциума обладают устойчивостью к повреждающим факторам криоконсервации. Экзополисахариды (ЭПС), вырабатываемые бактериями, обладают гидрофильными свойствами, что способствует дополнительному повышению вязкости среды. ЭПС в бактериальной клетке выполняют защитную функцию, предотвращая высыхание. Замораживание и высушивание высокопродуктивных ЭПС-синтезирующих культур возможны без дополнительных протекторов, однако устойчивость таких препаратов при длительном хранении и реактивации требует дальнейшего изучения.
Чувствительность разных видов микробов к замораживанию-оттаиванию неодинакова. В литературе имеются сведения, что грамотрицательные бактерии более чувствительны к замораживанию, чем грамположительные. Из грамположительных микробов наибольшей устойчивостью обладают кокки. Подобное различие, вероятно, связано с особенностями строения клеточной стенки. Даже в пределах одного вида разные штаммы показывают неодинаковую чувствительность к низким температурам [3].
К достоинствам криогенного хранения относят малое количество технологических операций и контрольных критических точек, повышающих вероятность вторичного обсеменения культур, обеспечение постоянства свойств микроорганизмов и доступность компонентов для подготовки протективной среды.
К недостаткам данного способа относят относительно короткую продолжительность хранения. Максимальный рекомендованный срок составляет 12 мес.
На следующем этапе была изучена жизнеспособность пробиотических культур консорциума в условиях сублимационного высушивания.
Высушивание биоматериалов из замороженного состояния (лиофилизация, сублимационное высушивание, замораживание-высушивание) - широко распространенный способ, при котором вода испаряется в условиях вакуума без оттаивания льда, что позволяет полностью сохранять первичную структуру объекта сушки. При использовании данного способа многие физиологически разнородные виды бактерий и бактериофаги удается сохранять в жизнеспособном состоянии 50 лет и более [2].
Лиофилизацию проводили после концентрирования биомассы бактерий путем центрифугирования в течение 20 мин при частоте п=3000 об./мин. Далее биомассу в асептических условиях смешивали с защитной средой в соотношении 1:1 и замораживали при температуре минус 20°С.
После полного замораживания биомассу высушивали при следующих условиях: р=(0,01-0,03) атм., Т= минус (50,3-51,2) оС, т=28 ч. Количественные показатели по выходу концентрированной биомассы рассмотрены в таблице 1.
Таблица 1
Выход биомассы консорциума пробиотических бактерий
Объект исследования Масса, г Количество жизнеспособных клеток, к.о.е./мл (г)
Биомасса 500±0,4 3*1010
Концентрированная биомасса 200±5,6 4*1011
Биомасса замороженная 400±8,4 6*1010
Биомасса высушенная 48,3±3,5 7*1012
Массовая доля влаги в высушенном препарате составляет (4 ±0,01)%. Выход сухой биомассы составляет 10 % от первоначального количества, эту величину относят к экономическим показателям процесса. При ферментации сырья или наращивании клеток биомасса микроорганизмов является продуктом «реакции», она же будет и «исходным реагентом». Действительно, как бы ни смешивали и что бы ни делали с исходными субстратами, из них никогда не
получится биомасса. В биотехнологии используют метаболические показатели, характеризующие плотность популяций бактерий. Обобщенные результаты представлены в таблице 2 и на рисунке 2.
Таблица 2
Процентное содержание жизнеспособных клеток от исходного количества
Название штамма Выживаемость, %
B. bifidum 83 80
L. cremoris 244 76
Р. shermanii 85
Титр жизнеспособных клеток в высушенном препарате составляет 1012 к.о.е./г. Такое высокое значение определяется концентрированием биомассы в результате удаления влаги и протекторными свойствами компонентов защитной среды.
В. bifidum 83 Ь сгетог'^ 244 Р. БЬегтапИ
■ до сушки ■ после сушки
Рисунок 2 - Количество жизнеспособных клеток пробиотических бактерий
до и после высушивания
Углеводы стабилизируют структуру белков путем образования водородных связей. Ди-сахариды снижают температуру фазовых переходов липидов клеточной мембраны, сохраняя ее свойства, как в гидратированной клетке. Целостность клеточной мембраны - необходимое условие выживания клетки. В препаратах с низким процентом выживаемости при регидрата-ции обнаруживают повышенное содержание внутриклеточных ферментов, нуклеиновых кислот.
Считается, что углеводы как вещества, способные «остекловываться» при замораживании и сохранять твердое аморфное состояние при высушивании, наиболее эффективны для сохранения биологических материалов в высушенном состоянии [1].
Главным условием протокола высушивания бактериальных клеток считается исключение оттаивания замороженного материала, конструкция применяемой сушилки обеспечивает соблюдение правила.
Культуры консорциума обладают высокой устойчивостью к воздействию стрессовых технологических факторов. Согласно литературным данным выживаемость ацидофильных молочнокислых культур составляет (35-65) % при использовании L-глутаминовой кислоты в качестве протектора клетки [5].
На следующем этапе была проведена оценка выживаемости культур консорциума при хранении в течение 3 лет при температуре минус (18-20) °С. Результаты представлены на рисунке 3.
Рисунок 3 - Сохранность культур консорциума при хранении
Количество клеток жизнеспособных культур уменьшилось в пределах одного порядка, наибольшей устойчивостью при хранении характеризуется L. cremoris 244 и B. bifidum 83, что согласуется с опубликованными экспериментальными данными других авторов.
Отмирание живых клеток в сухих препаратах при соблюдении условий хранения является закономерным. Основной причиной гибели бактериальных клеток являются реакции окисления, вызывающие изменения молекул РНК и ДНК, белков и липидов [4].
Пропионовокислые бактерии являются продуцентом таких антиокислительных ферментов, как каталаза и супероксиддисмутаза, в результате гибели части клеток ферменты переходят в среду, повышая антиоксидантную устойчивость живых культур.
Выводы
Лиофилизация по-прежнему остается наиболее эффективным способом консервирования микроорганизмов с минимальным изменением нативных свойств.
Высокая выживаемость культур консорциума при консервировании обусловлена свойствами накопительной и защитной среды, продуцированием полисахаридов, стабильным состоянием культур в стационарной фазе развития.
Наличие в питательной среде селенита натрия и аскорбиновой кислоты является дополнительным защитным фактором, тормозящим процессы окисления в клетках при длительном хранении.
Полученные результаты могут быть использованы для создания протокола консервирования производственно-ценных штаммов пробиотических бактерий.
Библиография
1. Грачева И.В., Осин А.В. Механизмы повреждений бактерий при лиофилизации и протектив-ное действие защитных сред // Проблемы особо опасных инфекций. - 2016. - № 3. - С. 5-12.
2. Пойманов В.В., Ященко С.М., Барыкин Р.А. Исследование процесса вакуум-сублимационной сушки бактериальных концентратов для мясной отрасли с использованием криозамораживания // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. - 2016. - № 1. - С. 25-30.
3. Похиленко В.Д., Баранов А.М., Детушев К.В. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2009. - № 4 (12). - С. 99-121.
4. Сидорчук А.А., Краснова А.А. Сохранность культур бактерий различных групп при длительном хранении в лиофилизованном состоянии [Текст] // Российский ветеринарный журнал: с.-х. животные. - 2016. - № 3. - С. 22-25.
5. Тамим А.Й., Робинсон Р.К. Йогурт и другие кисломолочные продукты [Текст] / пер. с англ. под науч. ред. Л.А. Забодаловой. - СПб.: Профессия, 2003. - 661 с.
Bibliography
1. GrachevaI.V., OsinA.V. Mechanisms of bacterial damage during lyophilization and protective effect of protective environments // Problems of especially dangerous infections. - 2016. - N 3. - P. 5-12.
2. Poymanov V.V., Grishanova D.S., Antipov S.T. Investigation of the processes of freezing and freeze-drying of bacterial concentrates for the dairy industry // Voronezh state university of engineering technologies - 2016. - N 1. - P. 25-30.
3. Pokhilenko V.D., Baranov A.M., Detushev K.V. Methods of long-term storage of collection cultures of microorganisms and development trends // Proceedings of higher educational institutions. Volga region. Medical science. - 2009. - N 4 (12). - P. 99-121.
4. Sidorchuk A.A., Krasnova A.A. Preservation of bacterial cultures of various groups during prolonged storage in a lyophilized state // Russian veterinary journal: agricultural animals. - 2016. - N 3. - P. 22-25.
5. Tamim A.Y., Robinson R.K. Yogurt and other dairy products [Text] / translated from English. under the scientific. ed. L.A. Zabodalov. - SPb.: Profession, 2003. - 661 p.
