Выявление внутренних тандемных дупликаций и мутации D835Y в гене flt3 у пациентов с острым миелобластным лейкозом Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

© Коллектив авторов, 2010 г. УДК 616.155.342:575

И. Ю. Сабурова, А. В. Горбунова, К. Ю. Слободнюк, М. В. Горчакова, М. В. Русанова, А. В. Куртова, Е. Е. Зуева, М. И. Зарайский

ВЫЯВЛЕНИЕ ВНУТРЕННИХ ТАНДЕМНЫХ ДУПЛИКАЦИЙ И МУТАЦИИ Ов35У В ГЕНЕ Р1Л3 У ПАЦИЕНТОВ С ОСТРЫМ МИЕЛОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ

Кафедра клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова

ВВЕДЕНИЕ

Острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) является кло-нальным злокачественным заболеванием клеток-предшественников миелоидного ряда и характеризуется накоплением трансформированных бластных клеток в костном мозге и/или периферической крови [9]. Заболеваемость ОМЛ составляет примерно 2,3 случая на 100 000 населения в год. Около 15 % больных погибают в первые 3 месяца после постановки диагноза, в последующем летальность достигает до 15 % в год [1].

В настоящее время «золотым стандартом» для верификации диагноза ОМЛ является многоцветная проточная цитофлуориметрия с использованием панели специфических моноклональных антител. Одновременная оценка экспрессии нескольких маркеров миелоид-ного направления дифференцировки позволяет выявлять трансформированные клетки на этапе первичной диагностики [8].

С 1976 г. прошлого столетия для диагностики острых лейкозов широко используется Франко-американо-британская (ФАБ) классификация. В ее основу была положена морфологическая и цитохимическая характеристика лейкозных бластных клеток. В 1999 г. была введена классификация Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Основной новацией данной классификации являлось введение в характеристику форм острых лейкозов различных генетических аберраций. Современная классификация ВОЗ 2008 г. еще больше

Таблица 1 Последовательности используемых праймеров

Название Сиквенс

Праймеры для определения ВТД гена FLT3

Flt3-ITD-F 5'-TCTGCAGAACTGCCTATTCCT-3'

Flt3-ITD-R 5'-CTTTCAGCATTTTGACGGCAA-3'

Праймеры для определения мутации FLT3 (D835Y)

D835Y-F 5' CCGCCAGGAACGTGCTTG 3'

D835Y-R 5' GCAGCCTCACATTGCCCC 3'

усиливает тезис о клинической значимости неслучайно встречающихся генетических аномалий в диагностике острых лейкозов. Так, для оценки генетических характеристик клеток ОМЛ используется проведение цитогенетических исследований с выявлением основных патогномоничных транслокаций - t(15;17), inv(16), t(8;21), t(8;21), t(9;11), t(6;9), inv(3) и т. д. Определение типов ОМЛ, ассоциированных с различными цитоге-нетическими нарушениями, позволяет оценивать степень риска развития рецидива [6]. Однако серьезной проблемой прогнозирования течения ОМЛ является тот факт, что данные нарушения выявляются только у 4060 % взрослых пациентов и у четверти больных детей [7]. Таким образом, формируется достаточно большая группа пациентов с нормальным кариотипом и так называемым средним (intermediate) риском развития рецидива заболевания.

Это обстоятельство повышает интерес к другим молекулярно-генетическим маркерам - генам, мутационное повреждение которых определяет течение заболевания и имеет прогностическое значение. Одним из таких маркеров является рецепторная тирозинкина-за FLT3 [10]. В литературе описаны два основных типа повреждения этого гена: это внутренне тандемные дупликации (ВТД) - мутация, выявляемая у 20-30 % пациентов с нормальным кариотипом, и точечная мутация D835Y в гене FLT3, выявляемая в 6-12 % пациентов с нормальным кариотипом [5]. Обе генетические аномалии ассоциированы с крайне неблагоприятным прогнозом [3].

Разработка скрининговой методики для выявления ВТД и точечной мутации D835Y в гене FLT3 у пациентов с ОМЛ и нормальным кариотипом и явилась целью настоящей работы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование были включены 35 пациентов, проходивших обследование на базе Центра лабораторной диагностики СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова с диагнозом «острый миелобластный лейкоз» и 20 здоровых доноров. Согласие Этического комитета на данное исследование получено. Для верификации диагноза были использованы метод многоцветной проточной цитофлюориметрии (Cytomics FC500, Beckman Coulter), а также морфологический, цитохимический методы и клинические данные.

В качестве клинического материала для исследования мутационной активности гена FLT3 использовали костный мозг пациентов. Геномную ДНК выделяли сорбентным методом с использованием набора «Проба-ГС» («ДНК-Технология», Москва).

Амплификацию проводили по стандартной двух-праймерной схеме в конечном объеме 10 мкл на амп-лификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Москва). Реакционная смесь содержала 2 мкл ДНК, 14 рМол каждого праймера, смесь дНТФ в конечной концентрации - 240 мкМол и 2,5 единицы термостабильной

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

Taq ДНК-полимеразы (Helicon, Москва) в стандартном буфере («Амплисенс», Москва) с содержанием Mg2+ 15 мМол. Типовая программа амплификации состояла из начальной денатурации (96 °С, 3 мин), 35 циклов, включавших денатурацию (96 °С, 30 с), отжиг праймеров (60 °С для ВТД и 58 °С для D835Y, 30 с), элонгацию (72 °С, 40 с), и заключительной элонгации (72 °С, 7 мин). Последовательности используемых праймеров представлены в табл. 1 [2].

При исследовании ВТД гена FLT3 продукт амплификации без предварительной обработки наносили на стандартный 8 %-й полиакриламидный гель в камере для вертикального фореза «SE-2» («Хеликон», Москва). Электрофорез проводили в стандартном ТВЕ буфере при напряженности электрического поля 10 В/см в течение 2 часов. После этого гель извлекали из камеры и окрашивали в водном растворе бромистого эти-дия. Визуализацию и фотографирование электро-фореграммы проводили в УФ-свете на трансиллюминаторе (Vilber Lourmat, Франция).

Для определения однонуклеотидной замены D835Y использовали метод рестрикции. К продукту ПЦР без предварительной подготовки добавляли рестриктазу EcoRV (New England Biolabs) в количестве 10 U на пробу. Рестрикцию проводили при температуре 37 °C в течение 16 часов. Затем продукт рестрикции наносили на стандартный 8 %-й полиакриламидный гель.

Оценку аналитических характеристик проводили путем исследования электрофореграммы продуктов амплификации:

1) на наличие ВТД гена FLT3 указывало появление на дорожке дополнительного продукта (или продуктов) большего молекулярного веса, чем исходный нормальный продукт (рис. 1);

2) на наличие мутации D835Y указывало появление на дорожке третьего дополнительного продукта размером 120 нуклеотидных пар. В норме продукт амплификации подвергался полной рестрикции на два меньших по размеру продукта (80 и 40 нуклеотидных пар) (рис. 2).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Все пациенты, включенные в обследование, были протестированы на наличие ВТД и мутации D835Y в гене FLT3. Для верификации диагноза «острый мие-лобластный лейкоз» по классификации FAB был использован морфологический, цитохимический методы и метод многоцветной проточной цитофлюориметрии. Встречаемость ВТД и мутации D835Y в гене FLT3 в зависимости от распределения пациентов по диагнозам по классификации FAB представлена в табл. 2.

Из 35 обследованных пациентов 8 имели ВТД в гене FLT3, что составило 22,9 % от общей группы пациентов с ОМЛ и соответствует литературным данным [5]. При этом ВТД в гене FLT3 были обнаружены у 1 пациента с вариантом ОМЛ, М1; у 1 пациента с вариан-

1 2 3 4

Рис. 1. Электрофореграмма исследования ВТД в гене РЬТ3: 1 - положительный контрольный образец; 2 - отрицательный контрольный образец; 3 - образец без ВТД-мутации; 4 - образец с ВТД-мутацией гена РЬТЗ

1 2 3 4

Рис. 2. Электрофореграмма исследования мутации Б835У в гене РЬТЗ: 1 -положительный контрольный образец; 2 - отрицательный контрольный образец; 3 - образец без Б835У-му-тации; 4 - образец с Б835У-мутаци-ей (гетрозигота)

том ОМЛ, М0-М1; у 3 пациентов с вариантом ОМЛ, М2; у 1 пациента с вариантом ОМЛ, М3; у 2 пациентов с вариантом ОМЛ, М4. Исходя из полученных данных, можно предположить, что исследуемые генетические поломки чаще встречаются в формах острого миелобластного лейкоза с выраженными признаками дифференцировки. Различное распределение количества пациентов, несущих мутацию по вариантам ОМЛ, по РАВ-классификации может быть обусловлено биологическими особенностями течения различных вариантов лейкоза.

Из 35 обследованных пациентов 3 имели мутацию Б835У в гене РЬТ3, что составило 87,6 % от общей группы пациентов с ОМЛ и соответствует литературным данным. При этом мутация была обнаружена

Таблица 2

Встречаемость ITD и мутации D835Y в гене FLT3 в зависимости от распределения пациентов по диагнозам по классификации FAB

Диагноз Количество пациентов ITD-FLT3, количество пациентов (полож./отр.) D835Y FLT3, количество пациентов (полож./отр.)

ОМЛ, M0 2 1/1 0/2

ОМЛ, М0-М1 1 1/0 0/1

ОМЛ, М1 2 0/2 0/2

ОМЛ, М1-М2 3 0/3 0/3

ОМЛ, М2 13 3/10 1/12

ОМЛ, М3 4 1/3 1/3

ОМЛ, М4 9 2/7 1/8

Итого 35 8/27 3/32

Всего (%) 100 22,9 8,6

Доноры 20 0/20 /20

у 1 пациента с вариантом ОМЛ, М2; у 1 пациента с вариантом ОМЛ, М3; у 1 пациента с вариантом ОМЛ, М4. Различное распределение количества пациентов, несущих мутацию по вариантам ОМЛ, по FAB классификации может быть обусловлено биологическими особенностями течения различных вариантов лейкоза. Таким образом, полученные нами данные позволяют обсуждать патогенез острого миелобластного лейкоза.

FLT3 относится к семейству рецепторных тирозин-киназ и осуществляет передачу сигнала от различных гормонов и факторов роста внутрь клетки, регулируя таким образом процессы пролиферации, диф-ференцировки и выживаемости клеток. Появление ВТД в гене FLT3, так же как и одиночная замена D835Y, приводит к конституитивной активации рецептора и неконтролируемой пролиферации клеток [4]. Пациенты с ВТД- и D835Y-мутациями характеризуются не только более агрессивным течением заболевания и более высоким риском рецидива, но и значительно сниженным ответом на стандартную терапию [3].

Таким образом, внедренные нами методики моле-кулярно-генетического выявления ВТД и D835Y в гене FLT3 у пациентов с ОМЛ являются чрезвычайно актуальными, так как дают клинически важную информацию о прогнозе течения заболевания примерно у половины пациентов с ОМЛ и нормальным кариоти-пом и влияют на выбор терапии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Bienz, M. Risk assessment in patients with acute myeloid leukemia and a normal karyotype / M. Bienz [et al] // Clin. Cancer Res. - 2005. - № 11 (15). - Р. 1416-1424.

2. Chang, T. L. Simplified capillary electrophoresis detection of the Flt-3 internal tandem duplications and D835 point mutations in acute myeloid leukemia / T. L. Chang [et al] // Haematologica. -2007. - № 88 (2). - P. e21-e22.

3. Derek, L. Size of FLT3 internal tandem duplication has prognostic significance in patients with acute myeloid leukemia / L. Derek [et al] // Blood. - 2006. - № 107 (9). - Р. 3724-3726.

4. Donald Small. FLT3 Mutations / Donald Small // Biology and Treatment Hematology. - 2006. - Р. 178-184.

5. Kathleen, M. Murphy. Detection of FLT3 Internal Tandem Duplication and D835 Mutations by a Multiplex Polymerase Chain Reaction and Capillary Electrophoresis Assay / M. Murphy Kathleen [et al] // Journ. of Molecular Diagnostics. - 2003. - Vol. 5. -№ 2. - Р. 96-102

6. Marcucci, G. Molecular heterogeneity and prognostic biomarkers in adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics / G. Marcucci, K. Mrozek, C. D. Bloomfield // Curr. Opin. Hematol. - 2005. - № 12. -Р. 68-75.

7. Mryzek, K. Cytogenetics in acute leukemia / K. M^zek, N. A. Heerema, C. D. Bloomfield // Blood Rev. - 2004. - № 18. -Р. 115-136.

8. Raspadori, D. CD56 antigenic expression in acute myeloid leukemia identifies patients with poor clinical prognosis / D. Raspadori [et al] // Leukemia. - 2001. - № 15. -Р. 1161-1164.

9. Richard, F. Mutations and Treatment Outcome in Cytogenetically Normal Acute Myeloid Leukemia / F. Richard [et al] // New Engl. Jour. Med. - 2008. - № 18. - P. 358.

10. Yamamoto, Y. Activating mutation of D835 within the activation loop of FLT3 in human hematologicmalignan-cies / Y. Yamamoto [et al] // Blood. - 2001. - № 97. - P. 2434-2439.

РЕЗЮМЕ

И. Ю. Сабурова, А. В. Горбунова, К. Ю. Слобод-нюк, М. В. Горчакова, М. В. Русанова, А. В. Кур-това, Е. Е. Зуева, М. И. Зарайский

Выявление внутренних тандемных дупликаций и мутации D835Y в гене FLT3 у пациентов с острым миелобластным лейкозом

Исследованы 35 пациентов с диагнозом «острый миелоб-ластный лейкоз» и 20 здоровых доноров. Для верификации диагноза ОМЛ использовали метод многоцветной проточной цитофлуориметрии (Cytomics FC500, Beckman Coulter), а также данные морфологических, цитохимических и клинических исследований. Для молекулярно-генетических исследований ВТД и мутации D835Y применяли метод стандартного ПЦР-анализа по двухпраймерной схеме с детекцией результатов в полиакриламидном геле. Молекулярно-генетические нарушения были детектированы у 11 пациентов (33 %), причем 8 из них имели ВТД в гене FLT3, что составило 22,9 % от общей группы пациентов с ОМЛ, и 3 имели мутацию D835Y в гене FLT3, что составило 8,6 % от общей группы пациентов с ОМЛ и соответствует литературным данным. Таким образом, исследование ВТД и D835Y мутации в гене FLT3 может быть рекомендовано для включения в диагностику острого мие-лобластного лейкоза.

Ключевые слова: острый миелобластный лейкоз, ВТД и мутация D835Y в гене FLT3, проточная цитометрия, прогноз.

SUMMARY

I. Y. Saburova, A. V. Gorbunova, K. Y. Slobodnyuk, M. V. Gorchakova, M. V. Rusanova, A. V. Kurtova, A. V. Zuyeva, M. I. Zaraisky

Detection of FLT3 internal tandem duplications (ITD) and D835Y mutations in patients with acute myeloid leukemia (AML)

The aim of the work was to develop a method for detection of internal tandem duplications (ITD) and D835Y mutations in FLT3 gene in patients with verified diagnosis of AML. Thirty-five AML

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

patients and 20 healthy donors participated in the study. To verify the diagnosis of AML the method of multicolor cytometry (Cytomics FC500, Beckman Coulter) and the findings of morphological, cytochemical, and clinical studies were used. For molecular genetic assay of FLT3-ITD and D835Y mutations we used the standard method of PCR with double primer scheme for detection of the results in the polyacrilamide gel. Cytogenetic abnormalities were

identified in 11 AML patients (33 %) and eight of them (22.9 %) demonstrated FLT3-ITD mutation and 3 patients (8.6 %) had D835Y mutation. Investigation of FLT3-ITD and D835Y mutations may be recommended as a part of standard diagnostics in acute myeloid leukemia.

Key words: Acute myeloid leukemia, FLT3-ITD, D835Y, mutation, flow cytometry, prognosis.

© В. А. Одинцов, Л. В. Кочорова, 2010 г. УДК 616.441:615.837.3

В. А. Одинцов, Л. В. Кочорова

РОЛЬ УЛЬТРАЗВУКОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В СКРИНИНГЕ ПАЦИЕНТОВ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Северный государственный медицинский университет, г. Архангельск; Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Ультразвуковой метод (УЗ), впервые примененный для визуализации щитовидной железы (ЩЖ) в конце 60-х гг. XX в., в настоящее время занимает ведущие позиции в диагностике тиреоидной патологии. УЗИ ЩЖ является важным этапом диагностического процесса. Именно появление УЗ-аппаратов, дающих возможность изучения внутренней структуры ЩЖ в режиме реального времени, обусловило настоящий прорыв в диагностике узловых образований. В настоящее время УЗ-ап-параты есть практически во всех ЛПУ РФ, поэтому никаких препятствий к их широкому использованию нет.

В городском эндокринологическом центре (ГЭЦ) г. Архангельска в период с 1997 по 2009 гг. диагностика заболеваний ЩЖ осуществлялась на УЗ-скане-ре «Sigma Iris 210» фирмы Kontron, а с 2009 г. в эксплуатацию введен новый цифровой цветной УЗ-сканер «NEMIO XG SSA-580A» фирмы Toshiba.

С целью сопоставления диагностических возможностей различных моделей УЗ-сканеров нами было проведено маркетинговое исследования по следующим аппаратам:

- состоящие на балансе ГЭЦ 2 УЗ-сканеры «Sigma Iris 210» фирмы Kontron и «NEMIO XG SSA-580A» фирмы Toshiba, предназначенные для диагностики заболеваний ЩЖ;

- состоящий на балансе онкодис-пансера (АОКОД) УЗ-сканер «Sono-line Elegra» фирмы Siemens, с помощью которого осуществляется диагностика злокачественных заболеваний ЩЖ.

На первом этапе на основе экспертной оценки был сформирован перечень характеристик, отражающих диагностические и технико-экономические возможности УЗ-аппарата. Затем были определены границы доверительных интервалов выбранных характеристик, где минимальное значение характеристики соответствует наихудшему, а максимальное - наилучшему результату оказания медицинской услуги, которая обеспечивается данным аппаратом. Весь диапазон изменения характеристик был разделен на интервалы с присвоением ранга от 0 до 4. Для каждой характеристики УЗ-аппарата были введены весовые коэффициенты Wj, определяющие ее значимость. Значения рангов параметров аппаратов и присвоенных им весовых коэффициентов приведены в табл. 1.

Сформированную матрицу можно рассматривать как модель результата медицинской услуги с применением различных УЗ-аппаратов. На основании присвоенных рангов и весовых коэффициентов были вычислены значения целевой функции для каждого аппарата (табл. 2).

Целевая функция является показателем научно-технического уровня медицинских изделий, ее значения возрастают при улучшении параметров медицинской техники и снижаются при их ухудшении. Исходя из данных, приведенных в табл. 2, можно заключить, что наилучшими характеристиками обладает УЗ-сканер «NEMIO XG SSA-580A» Toshiba (ГЭЦ) со значением целевой функции F=70.

Система «Sonoline Elegra» Siemens, эксплуатируемая в онкологическом диспансере, соответствует идеальной модели УЗ-сканера на 75 %, что подтверждается значением ее целевой функции F=57. Поскольку

Таблица 1

Матрица ранговых оценок параметров УЗ-сканеров

Характеристика W j "Sigma Iris 210" Kontron "NEMIO XG SSA-580A" Toshiba "Sonoline Elegra" Siemens

Размер монитора 4 2 3 4

Количество одновременно 3 2 4 3

подключенных датчиков

Наличие спектрального 4 4 4 3

допплера

Наличие РБ/СБМ 3 0 4 4

Наличие 3Б/4Э-опций 3 0 4 2

сканирования

Массогабаритные 2 4 3 1

характеристики