CC BY
53
ВЫЯВЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ I GE АНТИТЕЛ ОКТАПЕПТИДОМ, АНАЛОГОМ FCE РЕЦЕПТОРА
ЯНЧЕНКО В.В.
УО «Витебский государственный медицинскийуниверситет»
Резюме. Предложено новое диагностическое направление - выявления антител с использованием пептидов. структурных аналогов Ig-связывающего сайта активного центра рецептора для иммуноглобулинов. Высокоаффинный рецептор для иммуноглобулина Е (FcsRI) - ключевая высокоспециализированная структура на поверхности ряда клеток системы иммунитета. связывающая иммуноглобулин Е.
Классическими методами пептидной химии синтезирован фрагмент активного центра FcsRIa - октапептид WRNWDVYK. С использованием иммуноферментной тест-системы доказана способность синтезированного октапептида связывать специфические антитела Е класса к аллергену клеща рода Dermatophagoides pteronyssinus. Полученный пептид является потенциальным диагностическим средством.
Ключевые слова: специфические IgE антитела. октапептид.
бронхиальная астма
Abstract. Such new diagnostic direction as antibody detection with the help of peptides which are the analogues of Ig-binding site. located in the active centers of receptors for immunoglobulins is suggested in this article. High affinity receptor for immunoglobulin E (FcsRI) is a key highly specialized structure on the surface of a number of immune cells. Fragment of active FcsRIa center -octapeptide WRNWDVYK has been synthesized by means of classical methods of peptide chemistry. The synthesized octapeptide’s capacity to bind specific IgE to allergen of mite Dermatophagoides pteronyssinus has been proved with the help of immunoenzyme test-system. The obtained peptide may potentially be used for diagnostic purposes.
Key words: peptide. immunoglobulin E. IgE, high affinity receptor for immunoglobulin E. FcsRI. bronchial asthma.
Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь, 210023, г. Витебск, пр. Фрунзе,
27, Витебский государственный
медицинский университет, кафедра клинической иммунолог8ии и аллергологии - Янченко В.В.
Введение. Лабораторные технологии постоянно совершенствуются. Для определения одного показателя могут использоваться несколько методов. Классическим иммунологическим методом выявления антител определённых классов является использование вторичных антител против константного фрагмента тяжёлой цепи иммуноглобулина [1]. Нами предложено новое диагностическое направление - выявления антител с использованием коротких пептидов, входящих в активный центр рецепторов для иммуноглобулинов. Так, высокоаффинный рецептор для иммуноглобулина Е (FcsRI) - ключевая высокоспециализированная структура на поверхности ряда клеток системы иммунитета [2,3], связывающая иммуноглобулин Е. Высокоаффинный Fc-рецептор иммуноглобулина Е состоит из нескольких субъединиц: а, Р, у, образующих комплекс. Когда говорят про специфичные к Fc-фрагменту иммуноглобулина рецепторы, подразумевают именно а-субъединицу. Возможны только 2 варианта активных комплексов FcsRI: а-Р-у-у и а-у-у [4,5].
Альфа-субъединица FcsRI (FcsRIа) выполняет роль стыковочного узла с молекулой иммуноглобулина, основная часть этой молекулы расположена вне клетки. В 1988 году впервые установлена локализация гена FcsRI A и получен его клон в виде комплементарной ДНК [6]. Ген альфа-цепи высокоаффинного рецептора иммуноглобулина Е человека локализован в 1
хромосоме, в локусе 1q23 [7.8].Связывание IgE с FcsRIa является
высокоспецифичным. Период полураспада комплекса FcsRIa-IgE на поверхности клетки составляет 2 недели. Установлено, что кинетика диссоциации комплекса FcsRIa-IgE больше всего зависит от С2 домена IgE. IgE без С2 домена терял связь с FcsRIa в течение нескольких часов [9]. Определение активного центра FcsRIa связывающего IgE в области С2 домена и его синтез позволит создать высокоэффективный нанотехнологический инструмент, выявляющий IgE.
Цели исследования Разработать и апробировать in vitro новое потенциальное диагностическое средство, связывающее и выявляющее IgE. Определить способность WRNWDVYK-октапептида, фрагмента FcsRIa, связывать специфический IgE крови человека.
Материалы и методы Используя компьютерную программу Биоскан 9.0 ОДО «НИКП Ресан», базу данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) - локус NM_002001, базу данных известных структур протеинов и нуклеиновых кислот Великобритании (PDB) - файл 1f6a (авторы:
S.C.Garman, B.A. Wurzburg, S.S.Tarchevskaya, J.P.Kinet, T.S.Jardetzky) был произведен анализ структуры альфа цепи высокоаффинного рецептора иммуноглобулина E (FcsRIa). Выбран, установленный в результате компьютерного анализа, пептидный фрагмент, предположительно принимающий участие в лиганд-рецепторном взаимодействии с С2 доменом IgE. В Институте биоорганической химии НАН Беларуси классическими методами пептидного синтеза был получен фрагмент FcsRIa
- октапептид WRNWDVYK [10].
Для способности визуальной оценки связывания октапептида с IgE был получен конъюгата WRNWDVYK пептида с пероксидазой хрена (Sigma, product № P8375). Синтез конъюгата WRNWDVYK-пероксидаза хрена осуществляли по описанной ранее методике [11].
Концентрацию пероксидазы хрена в конъюгате определяли спектрофотометрически. используя при расчете коэффициенты экстинкции
A280 нм. 1 см. 1 мг/мл °.73. A403 нм. 1 см. 1 мг/мл
2.275. s 403 = 109 000 М-1см-1. Концентрация пероксидазы хрена в конъюгате составила 0.8 мг/мл. концентрация конъюгата - 5.2 мг/мл. Для стабилизации конъюгата применяли стабилизатор для белков (“Диа+”. фирма “Хема-медика”) в объемном соотношении конъюгат:стабилизатор 1:2. Конъюгат хранили до использования при +4°С.
Такая конструкция. пептид-фермент. позволяет оценить связывание синтезированного WRNWDVYK-октапептида с IgE по изменению ферментативной активности пероксидазы хрена после взаимодействия с субстрат-хромогенной смесью.Готовили экспериментальные тест-системы Dermatophagoides pteronyssinus №DP0004. Рабочий раствор (100 PNU/мл) диализованного аллергена из Dermatophagoides pteronyssinus (5000 PNU/мл. ОАО «Биомед им. И.И. Мечникова») на 0.1 М Na-карбонатном буфере вносили по 100 мкл в каждую лунку планшетов (Nunc MaxiSort 468667). Инкубировали закрытые планшеты 18 часов при температуре +4°С. Удаляли после 18 часов инкубации содержимое лунок и промывали немедленно лунки промывочным раствором 3 раза. каждый раз заполняя лунку 300 мкл промывочного раствора на 1 минуту.
Хранили до использования при +4°С.Сравнивали способность конъюгата WRNWDVYK-пероксидаза хрена выявлять специфические антитела Е класса к аллергену Dermatophagoides pteronyssinus с аналогичной способностью Anti-Human IgE (e-chain specific) peroxidase conjugate (Sigma. product № A9667).
Anti-Human IgE (e-chain specific) peroxidase conjugate
(Sigma. product № A9667) 2 мл разводили 1:10 PBS-T. делили на аликвоты по 1 мли замораживали. Хранили до использования при -20°С. Исследовано 24 образца сывороток крови больных бронхиальной астмой лёгкой и средней тяжести с разной степенью сенсибилизации к аллергенам
Dermatophagoides pteronyssinus. Диагноз аллергической бронхиальной астмы был документально подтверждён на основе критериев “Global Intitiative for Asthma. Global Strategy for Asthma Management and Prevention”
[12] и кожных тестов с аллергеном Dermatophagoides pteronyssinus.
Схема опыта №DP0004 WRNWDVYK- и Анти-Е конъюгаты На 1 пробу использовали 2 лунки
• вносили в 2 лунки по 180 мкл фосфатного буферного раствора с твином 20 (PBS-T) и по 20 мкл исследуемой сыворотки. перемешивали;
• инкубировали 60 мин при температуре +37°С;
• промывали 3 раз PBS-T;
• вносили в первую лунку 150 мкл раствора конъюгата WRNWDVYK-октапептида с пероксидазой хрена. разведенного PBS-T 1:200;
• вносили во вторую лунку 150 мкл на лунку раствора конъюгата AntiHuman IgE с пероксидазой хрена. разведенного PBS-T 1:200;
• инкубировали 60 мин при температуре 37°С;
• промывали 3 раза PBS-T;
• вносили по 150 мкл раствора 3.3'5.5'-Tetramethyl-benzidine (ТМБ)
(Sigma. product № T8665);
• инкубировали 60 мин при +18°С в тёмном месте;
• вносили по 100 мкл на лунку стоп-реагента;
• регистрировали результаты реакции фотометрически. с помощью иммуноферментного анализатора АИФ-Ц-01С. производства РУПП «Витязь». Беларусь. при длине волны 450 нм.
Для определения места связывания WRNWDVYK-октапептида с IgE использовали следующий косвенный подход. Для связывания антигена у лёгких и тяжёлых цепей антител имеются вариабельные фрагменты. Оказалось. что у многих антител вариабельные фрагменты являются копией иммунодоминантного домена антигена. Проанализировав клоны гибридом. продуцирующих антитела против человеческого IgE: клоны E411. XTE4 -против Fc-региона; клоны 8E/5D4. IT. BSW - против Се2 домена; клон
8E/4F4 - против Се3 домена; клон 8E/Le27 - против Се4 домена. мы выбрали клон 8E/5D4. Моноклональные антитела. продуцируемые гибридомой клона 8E/5D4. направлены против термостабильного эпитопа Се2 домена IgE и используются в качестве первичных антител в стандартном
сертифицированном наборе реагентов для иммуноферментного
определения концентрации общего иммуноглобулина класса Е в сыворотке крови производства ЗАО «Вектор-Бест». Россия. каталожный номер А-8660 и сорбированы в каждой лунке планшета.
Схема опыта А-8660 + конъюгаты
• вносили в лунки 1 колонки планшета, раствор для разведения сывороток (РРС) и конъюгат WRNWDVYK-октапептида. разведенного PBS-T 1:100;раствора;
• вносили в лунки 2 колонки планшета, раствор для разведения сывороток (РРС) и конъюгат моноклональных антител клона 8E/4F4. разведенного PBS-T 1:100;раствора;
• вносили в лунки 3 колонки планшета, раствор для разведения сывороток (РРС) и конъюгат контрольного октапептида (цитруллинированного октапептида. фрагмент филлагрина. аминокислотная последовательность которого абсолютно отлична от любого октапептидного фрагмента FcsRIa)
[13]. разведенного PBS-T 1:100;
Соотношение РРС и конъюгатов было следующим:
1 ряд - 180 мкл РРС + 20 мкл конъюгата; 2 ряд - 160 мкл РРС + 40 мкл конъюгата; 3 ряд - 120 мкл РРС + 80 мкл конъюгата; 4 ряд - 100 мкл РРС + 100 мкл конъюгата; 5 ряд - 80 мкл РРС + 120 мкл конъюгата; 6 ряд - 60 мкл РРС + 140 мкл конъюгата; 7 ряд - 40 мкл РРС + 160 мкл конъюгата; 8 ряд -20 мкл РРС + 180 мкл конъюгата
• инкубировали 30 минут при +37°С;
• промывали 3 раз PBS-T;
• вносили по 100 мкл раствора 3.3'5.5'-Tetramethyl-benzidine с перекисью водорода;
• инкубировали 30 минут при +18°С в тёмном месте;
• вносили по 100 мкл на лунку стоп-реагента;
• регистрировали результаты реакции фотометрически, с помощью иммуноферментного анализатора AИФ-Ц-01C, при длине волны 450 нм.
Результаты и обсуждение В результате исследования было выявлено, что внесение только одного WRNWDVYK-oктaпeптидa, меченого пероксидазой хрена, в лунки планшета тест-системы А-8660 с сорбированными первичными моноклональными антителами 8E/5D4 против Cs2 домена IgE приводило к резкому увеличению оптической плотности раствора после добавления субстрат-хромогенной смеси. Оптические плотности растворов в лунках с конъюгатами моноклональных антител клона 8E/4F4 и контрольного пептида (цитруллинированный октапептид, фрагмент филлагрина, аминокислотная последовательность которого абсолютно отлична от любого октапептидного фрагмента FcsRIa) в была одинаковой. Линии, отражающие зависимости оптических плотностей этих растворов от количества конъюгатов были параллельны линий оси X (рис.1).
Количество конъюгата на 1 лунку, мкп
Рис.1 Линии, отражающие зависимости оптических плотностей
Степень соответствия между антигенной детерминантой и антигенсвязывающей областью активного центра антитела определяется химической и пространственной комплементарностью, которая обусловлена, с одной стороны, взаимодействием электронных облаков реагирующих химических групп, с другой - стерическими силами отталкивания.
Если структуры антигена и активного центра антитела не соответствуют друг другу, то их притяжение будет слабым, а отталкивание сильным и антитело не свяжет антиген. Важным моментом в образовании прочных специфических комплексов является наличие множественных контактов, позволяющих, несмотря на слабость отдельных единичных взаимодействий, прочно удерживать антиген в активном центре.
С количественной стороны специфичность взаимодействия антиген-антитело характеризуется аффинностью антител или равновесной константой образования иммунного комплекса.
Дозозависимое изменение оптической плотности раствора в лунках с WRNWDVYK-кoнъюгaтoм объясняется высокой специфичностью (аффинностью) связи пептидов с активными центрами вариабельных фрагментов моноклональных антител 8E/5D4.
Обычно антитела распознают и связывают пептидные фрагменты антигенов длиной до 15-20 аминокислот, а в нашем конкретном случае пептид состоит только из 8 аминокислот.
При высокой специфичности такой длины уже достаточно, чтобы крепко связать и удерживать комплекс WRNWDVYK-пepoкcидaзa хрена. Оптические плотности растворов, после связывания WRNWDVYK-, цитруллинированных пептидов и антител клона 8Е/№4 моноклональными антителами против человеческого Се2 домена ^Е (клон 8E/5D4) представлены в табл.1.
Таблица 1
Связывание специфических ^Е к аллергену Dermatophagoides р1етвпу88тш WRNWDVYR-oктaпeптидoм и антителами против ^Е из раствора сывороток больных
аллергической бронхиальной астмой
ОП в лунках с WRNWDVYK-конъюгатом ОП в лунках с Анти-Е конъюгатом % ОП WRNWDVY K от Анти-Е ОП в лунках с WRNWDVY K- конъюгатом ОП в лунках с Анти-Е конъюгатом % ОП WRNWDV YK от Анти-Е
0.516 0.829 62.2 0.887 1.386 64.0
0.641 0.806 79.5 0.938 1.260 74.5
0.624 0.864 72.2 1.552 1.323 117.3
0.902 0.446 201.9 1.050 1.155 90.9
0.816 0.848 96.3 1.571 1.532 102.5
1.061 0.965 110.0 1.012 1.077 94.0
0.732 0.760 96.3 1.216 1.285 94.7
0.916 1.031 88.8 1.832 2.012 91.1
1.288 1.229 104.8 1.405 1.719 81.7
1.871 1.745 107.2 0.711 1.177 60.4
1.344 1.391 96.7 1.396 1.495 93.4
0.657 1.435 45.8 1.616 1.675 96.4
примечание. ОП оптическая плотность.
Вариабельные фрагменты моноклональных антител клона 8E/5D4 являются копией Се2 домена ^Е человека. Три исследованных конъюгата имели одинаковую пероксидазу хрена, но высокая оптическая плотность в лунках с WRNWDVYK-кoнъюгaтoм доказывает, что только WRNWDVYK-октапептид оказался способным высокоспецифично связываться с Се2 доменом ^Е.
Таблица 2
Связывание пептидов и антител клона 8E/4F4 моноклональными антителами против человеческого Ce2 домена IgE (клон 8E/5D4)
Количество компонентов, вносимое в лунки тест-системы А-8660 с первичными моноклональными антителами против IgE ОП в лунках с WRNWDVYK-конъюгатом ОП в лунках с Анти-Е (клон 8E/4F4) -конъюгатом ОП в лунках с контрольным пептидным конъюгатом
180 мкл РРС + 20 мкл конъюгата 0.375 0.069 0.062
160 мкл РРС + 40 мкл конъюгата 0.523 0.064 0.058
120 мкл РРС + 80 мкл конъюгата 0.904 0.081 0.060
100 мкл РРС + 100 мкл конъюгата 1.191 0.064 0.083
80 мкл РРС + 120 мкл конъюгата 1.161 0.093 0.073
60 мкл РРС + 140 мкл конъюгата 1.200 0.101 0.098
40 мкл РРС + 160 мкл конъюгата 1.728 0.207 0.228
20 мкл РРС + 180 мкл конъюгата 1.691 0.092 0.228
Примечание. ОП - оптическая плотность.
Результаты оптической плотности в параллельных лунках. отражающих связывание специфических IgE к аллергену Dermatophagoides pteronyssinus WRNWDVYK-октапептидом и антителами против IgE из раствора сывороток больных аллергической бронхиальной астмой. представлены в табл.2. из которой видно. что WRNWDVYK-октапептид эффективно связывал специфические IgE. Связывание специфических IgE к аллергену Dermatophagoides pteronyssinus WRNWDVYK-октапептидом и антителами против IgE имели высокую прямую корреляцию (г = 0.783. n=24) и высокие значения оптических плотностей растворов.
При сравнении результатов кожных тестов с аллергеном Dermatophagoides pteronyssinus и результатов оптической плотности. отражающих связывание специфических IgE к аллергену Dermatophagoides pteronyssinus антителами против IgE Anti-Human IgE и WRNWDVYK-октапептидом. наблюдалась крайне слабая обратная корреляционная связь (г = -0.093 для Anti-Human IgE и г = -0.168 для WRNWDVYK-октапептида). Анализируя результаты проведенных исследований с использованием иммуноферментных тест-систем можно считать доказанным факт связывания WRNWDVYK-октапептидом специфических антител E класса.
Заключение
Впервые для определения иммуноглобулинов использован короткий активный фрагмент рецептора иммуноглобулина. Впервые доказана способность WRNWDVYK-октапептида. фрагмента высокоаффинного рецептора для иммуноглобулина Е. связывать специфические антитела Е класса к аллергену Dermatophagoides pteronyssinus из раствора сывороток больных аллергической бронхиальной астмой. Установлена высокая прямая корреляционная связь (г = 0.783. n=24) между WRNWDVYK-октапептидом и Anti-Human IgE антителами в способности связывать специфические антитела Е класса к аллергену Dermatophagoides pteronyssinus из раствора сывороток больных аллергической бронхиальной астмой.
Использование более доступных и дешёвых синтетических пептидных соединений представляется перспективным направлением создания диагностических средств. Октапептид WRNWDVYK обладает биологическим действием. связывается с иммуноглобулинами Е класса. и может быть использован в качестве перспективного диагностических средства для выявления специфических антител Е класса у больных.
Литература
1. Теория и практика иммуноферментного анализа / А. М. Егоров [и др.].
- М.: Высш. шк., 1991.- 288 с.
2. Epidermal Langerhans cells from normal human skin bind monomeric IgE via Fc epsilon RI / B. Wang [et al.] // J. Exp. Med. - 1992. - Vol. 175, N 5. - P. 1353-1365.
3. Новиков, Д. К. Клеточная Fc-рецепторная сеть для антител и механизмы аллергии / Д. К. Новиков, Н. Д. Титова, В. В. Янченко // Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 207.
4. Гущин, И. С. Аллергическое воспаление и его фармакологический контроль / И. С. Гущин. - М.: Фармарус принт, 1998. - 252 с.
5. Kawakami, T. Regulation of mast-cell and basophil function and survival by IgE. / T. Kawakami, S. J. Galli // Nat. Rev. Immunol. - 2002. - Vol. 2, N 10. - P. 773-786.
6. Human and rat mast cell high-affinity immunoglobulin E receptors: characterization of putative alpha-chain gene products / A. Shimizu [et al.] // Proc. Nat. Acad. Sci. - 1988. - Vol. 85. - P. 1907-1911.
7. The gene for the human mast cell high-affinity IgE receptor alpha chain: chromosomal localization to 1q21-q23 and RFLP analysis / I. Tepler [et al.] // Am. J. Hum. Genet. - 1989. - Vol. 45. - P. 761-765.
8. Le Coniat, M. The human genes for the alpha and gamma subunits of the mast cell receptor for immunoglobulin E are located on human chromosome band 1q23 / M. Le Coniat, J. P. Kinet, R. Berger // Immunogenetics. - 1990. - Vol. 32, N 3. - P. 183-186.
9. The structure of the IgE Cs2 domain and its role in stabilizing the complex with its high-affinity receptor FcsRIa. / J. M. McDonnell [et al.] // Nature structural biology. - 2001. - Vol. 8. N 5. - P. 437-441.
10. A study of immunobiological activity of the WRNWDYYK octapeptide / V. P. Martinovich [et al.] // 30th European Peptide Symposium (30EPS). Helsinki. Finlandia Hall. 30 Aug.-5 Sept.. 2008. - P. 112.
11. Wilson. M. B. Recent developments of the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies / M. B. Wilson. P. K. Nakane // Immunofluorescence and Related Staining Techniques; ed. by W. Knapp. K. Holubar. G. Wick. - Elsevier/North Holland Biomedical Press. Amsterdam. 1978. - P. 215-224.
12. Global Intitiative for Asthma. Global Strategy for Asthma Management and Prevention. NYLB / WHO Worksop Peport. 1993.
13.Синтез цитруллинсодержащих пептидов и исследование возможности их использования для диагностики ревматоидного артрита / В. П. Голубович [и др.] // Молекулрая медицина и биохимическая фармакология: мат. Респ. науч. конф.. Гродно. 28-29 июня 2007 г. - С. 259261.
