CC BY
12
DOI: 10.21055/0370-1069-2019-2-62-68
УДК 616.932:579.25
с.П. Заднова, А.А. крицкий, н.А. Плеханов, н.П. Гусева, Ю.В. лозовский, н.и. смирнова
выявление механизмов изменения продукции ацетоина у генетически измененных штаммов ViBRiO CHOLERAE о1 Биовара эль тор
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов, Российская Федерация
цель работы - установление механизмов изменения биосинтеза ацетоина в реакции Фогес-Проскауэра у генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор. материалы и методы. Использовали девять генетически измененных штаммов V. cholerae 01 серогруппы Эль Тор биовара, завезенных на территорию Российской Федерации и Украины в 1993-2011 гг., и четыре типичных штамма, изолированных в 1970-1972 гг. В качестве отрицательного контроля при изучении продукции ацетоина штаммами V. cholerae в реакции Фогес-Проскауэра использовали штамм V. cholerae 569В 01 серогруппы классического биовара. Относительную экспрессию генов изучали методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Построение модели белка проводили с использованием автоматизированного сервера SWISS - MODEL. результаты и обсуждение. Показано, что диагностически значимый признак - реакция Фогес-Проскауэра, используемая для дифференциации биоваров V. cholerae O1, изменен у всех изученных генетически измененных штаммов возбудителя холеры, выделенных в разные периоды текущей седьмой пандемии (66,7 % штаммов дают слабоположительную реакцию, 33,3 % - отрицательную). Полученные данные указывают на снижение или отсутствие продукции ацетоина у изученных штаммов. Анализ четырех структурных генов als оперона, а также исследование экспрессии регуляторных генов alsR и ciphA, контролирующих его биосинтез, выявил, что изменение продукции ацетоина у геновариантов является следствием делеции единичного нуклеотида (Т в позиции 315) в структурном гене alsD, кодирующем ацетолактат декарбоксилазу, а также высокого уровня экспрессии негативного регулятора биосинтеза ацетоина - гена aphA. Моделирование пространственной структуры белка AlsD геноварианта М1293 и референс-штамма N16961 показало, что белок AlsD геноварианта действительно сильно редуцирован. Однако в отсутствие ацетолактат декарбоксилазы возможно спонтанное декарбоксилирование, что фенотипически проявляется в наличии слабоположительной реакции Фогес-Проскауэра.
Ключевые слова: Vibrio cholerae 01 серогруппы биовара Эль Тор, реакция Фогес-Проскауэра, биосинтез ацетоина, структура генов als оперона, экспрессия регуляторных генов.
Корреспондирующий автор: Заднова Светлана Петровна, e-mail: rusrapi@microbe.ru.
Для цитирования: Заднова С.П., Крицкий А.А., Плеханов Н.А., Гусева Н.П., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Выявление механизмов изменения продукции ацетоина у генетически измененных штаммов Vibrio cholerae О1 биовара Эль Тор. Проблемы особо опасных инфекций. 2019; 2:62-68. DOI: 10.21055/03701069-2019-2-62-68
S.P. Zadnova, A.A. Kritsky, N.A. Plekhanov, N.P. Guseva, Yu.V. Lozovsky, N.I. Smirnova
Identification of the Mechanisms of Acetoin Production Change in Genetically Altered Vibrio cholerae Strains O1 Biovar El Tor
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe" of the Rospotrebnadzor, Saratov, Russian Federation
Abstract. Objective of the study was to determine the mechanisms of acetoin biosynthesis change in genetically altered El Tor V cholerae strains in Voges-Proskauer test. Materials and methods. We used nine genetically altered V cholerae O1 strains, biovar El Tor, imported in the territory of the Russian Federation and Ukraine between 1993-2011, and four typical strains isolated in 1970-1972. When assessing acetoin production in V cholerae strains in Voges-Proskauer test, the strain V cholerae 569B O1 serogroup, classical biovar served as negative control of the assay. Relative gene expression was studied using real-time RT-PCR. Protein model construction was performed by means of automated server SWISS - MODEL. Results and discussion. It has been demonstrated that diagnostically significant feature - Voges-Proskauer reaction, utilized for V cholerae O1 biovar differentiation, is changed in all investigated genetically altered strains of cholera agent, isolated in different periods of the current seventh pandemic (66.7 % of the strains show weakly positive reaction, 33.3 % - negative one). The data obtained testify to the reduction or absence of acetoin production in the investigated strains. Analysis of four structural genes of als operon, as well as expression of regulatory genes alsR and aphA, responsible for acetoin biosynthesis, has revealed that changes in acetoin production in the genovariants stem from the deletion of a single nucleotide (T in the position 315) in the structural gene alsD, encoding acetolaktat decarboxylase, and also from high levels of negative acetoin biosynthesis regulator expression - аphA gene. Modeling of the spatial (3-D) structure of AlsD protein in the genovariant M1293 and the reference-strain N16961 has shown that AlsD protein of the genovariant is, indeed, considerably reduced. However, spontaneous decarboxylation is possible in the absence of acetolaktat decarboxylase, which phenotypically manifests itself in borderline positive Voges-Proskauer test.
Key words: Vibrio cholerae O1 serogroup, biovar El Tor; Voges-Proskauer test; acetoin biosynthesis; gene structure of als operon; expression of regulatory genes.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Svetlana P. Zadnova, e-mail: rusrapi@microbe.ru.
Citation: Zadnova S.P., Kritsky A.A., Plekhanov N.A., Guseva N.P., Lozovsky Yu.V., Smirnova N.I. Identification of the Mechanisms of Acetoin Production Change in Genetically Altered Vibrio cholerae Strains O1 Biovar El Tor. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2019; 2:62-68. (In Russian). DOI: 10.21055/0370-1069-2019-2-62-68
Received 08.04.19. Revised 11.04.19. Accepted 17.04.19.
Эпидемическая ситуация по холере - особо опасной кишечной инфекции, вызываемой токси-генными штаммами Vibrio cholerae, остается напряженной. Вспышки и эпидемии данной болезни не прекращаются в ряде стран Азии, Африки, Карибского бассейна. Ежегодно регистрируется в среднем 2,9 млн случаев холеры, из которых почти 95000 заканчиваются летально [1]. Согласно данным ВОЗ, в 2017 г. зарегистрирован 1227391 больной в 34 странах и 5654 умерших [2]. Из эндемичных территорий туристами и путешественниками возбудитель завозится в неэндемичные страны, включая и Российскую Федерацию.
В настоящее время продолжается седьмая пандемия холеры, начавшаяся в 1961 г. и вызванная токсигенными типичными штаммами V. cholerae 01 серогруппы биовара Эль Тор. Возбудителями предыдущих шести пандемий предположительно были штаммы V. cholerae о1 серогруппы классического биовара. Несмотря на то, что данные штаммы относятся к одной о1 серогруппе, они отличаются друг от друга по составу, структуре и экспрессии ряда генов патогенности, пандемичности и адаптации. отличия между ними по некоторым микробиологическим и биохимическим свойствам - чувствительности к полимиксину B, диагностическим холерным фагам, способности агглютинировать куриные эритроциты и образовывать ацетоин из глюкозы в реакции Фогес-Проскауэра - используют для дифференциации биоваров [3]. Холерные вибрионы биовара Эль тор устойчивы к полимиксину В и хорошо растут на средах с добавлением данного антибиотика (50 мкг/ мл), агглютинируют куриные эритроциты, дают положительную реакцию Фогес-Проскауэра (образуют ацетоин при выращивании в среде Кларка), лизируются холерным диагностическим фагом эль-тор. В соответствии с Методическими указаниями МУ 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры» определение биовара выделенного природного штамма V. cholerae о1 серогруппы является обязательным этапом в схеме лабораторного исследования материала на холеру.
В результате эволюционных преобразований возбудителя холеры в 90-х годах прошлого столетия возникли генетически измененные штаммы V. cholerae 01 биовара Эль Тор (геноварианты) с повышенной вирулентностью, содержащие в опе-роне ctxAB, кодирующем биосинтез холерного токсина, ген ctxB классических вибрионов. В короткие сроки геноварианты распространились по миру, вытеснив типичные штаммы, вызвавшие начало текущей пандемии. несмотря на появление новых свойств, значительное количество изученных ге-новариантов имело диагностически значимые признаки, характерные для вибрионов биовара Эль
Тор. В то же время проведенные исследования по определению биовара более 170 клинических генетически измененных штаммов, изолированных в Матлабе (Бангладеш) в 1991-1994 гг., показали, что среди них были изоляты с отрицательной реакцией Фогес-Проскауэра, характерной для классических холерных вибрионов [4, 5]. Это означало, что у изученных штаммов один из диагностически значимых признаков, используемых для дифференциации биоваров, был изменен. Далее было обнаружено, что у геновариантов, сформировавшихся в более поздний период эволюции возбудителя (Бангладеш, 2001-2005 гг.; Гаити, 2010 г.), реакция Фогес-Проскауэра также изменилась. Она оказалась слабоположительной, что указывало на снижение способности ферментировать глюкозу до ацетоина [6, 7]. Несмотря на важность этих данных для диагностики холеры, генетический механизм изменения продукции ацетоина у природных гено-вариантов до сих пор не установлен.
Цель работы - установление механизмов изменения биосинтеза ацетоина в реакции Фогес-Проскауэра у генетически измененных штаммов V. сЫ1егае биовара Эль Тор.
Материалы и методы
Штаммы микроорганизмов. В работе использованы как изолированные из внешней среды штаммы, так и V. с^1егае 569В О1 серогруппы классического биовара и 13 штаммов V. с^1егае О1 серогруппы биовара Эль Тор, вызвавших вспышки и единичные случаи холеры. Штаммы получены из государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб». Культивирование штаммов осуществляли в бульоне и на агаре LB.
Продукция ацетоина. Способность штаммов к продукции ацетоина определяли в реакции Фогес-Проскауэра. Исследуемые штаммы культивировали в глюкозо-фосфатном бульоне Кларка (0,5 % пептона, 0,5 % глюкозы, 0,5 % К2НР04) в течение 48 ч при температуре 37 °С. Затем к 1 мл выросшей культуры добавляли 0,6 мл 5 % раствора а-нафтола и 0,4 мл 40 % раствора гидрооксида калия. Учет реакции проводили через 1 ч инкубации пробирок при температуре 37 °С. В штаммах, не образующих ацетоин, цвет среды не изменился и остался светло-желтым -отрицательная реакция. В штаммах, синтезирующих ацетоин, среда окрашивается в ярко малиновый цвет - положительная реакция. Цвет среды от светло- до темно-розового учитывается как слабоположительная реакция Фогес-Проскауэра [8].
Выделение ДНК и РНК. Получение нуклеиновых кислот из штаммов V. с^1егае для фрагментарного секвенирования, а также для постановки Пцр
проводили согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Применяли коммерческие наборы AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit (Axygen Biosciences, США) и Promega Total RNA Isolation System (Promega, США), работу проводили в соответствии с протоколами производителя.
Качество и количество выделенных нуклеиновых кислот оценивали общепринятым методом с использованием сканирующей спектрофотометрии, измеряя оптическую плотность препаратов на приборе Biowave DNA (Biochrome Ltd, Великобритания) при трех длинах волн - 230 нм, 260 нм, 280 нм [9]. Каждый образец измеряли трехкратно. Концентрацию нуклеиновых кислот определяли при длине волны 260 нм. Очистку от белковых примесей контролировали по значениям соотношения A260/A280 (для чистых нуклеиновых кислот в пределах 1,8-2,2). Оценку чистоты от химических веществ (компонентов рабочих растворов) осуществляли при A260/A230 (>2,0).
Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили в микропробирках объемом 200 мкл на амплифика-торе RotorGene Q (Qiagen, Германия). Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл и включал по 8 пмоль каждого праймера, 4 пмоль зонда, 1,5 ед термостабильной ДНК-полимеразы, 2,5 мкл десятикратного ПЦР-буфера (pH 8,4), 25 ммоль раствора хлорида магния, раствор дезоксинуклеотидтри-фосфатов по 2 ммоль каждого, 2,5 мкл исследуемой ДНК (100 нг/мкл), а также деионизованную воду до конечного объема 25 мкл.
Оценка уровня относительной экспрессии генов. Для определения уровня экспрессии генов холерного вибриона использовали ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией) в реальном времени, в которой экспрессия гена оценивается по количеству кДНК, полученной в результате обратной транскрипции из молекул рнК исследуемого гена, относительно ПЦР-стандартов с установленной концентрацией. Окончательную оценку уровня экспрессии генов осуществляли методом 2-AACt, который учитывает уровень экспрессии гена «домашнего хозяйства», экспрессия которого является постоянной [10]. В качестве референсного штамма, экспрессия генов которого принималась за единицу, произвольно выбран штамм V. cholerae М818 биовара Эль Тор, в качестве гена-нормализатора - ген «домашнего хозяйства» recA. Праймеры и зонды на изучаемые гены рассчитывали при помощи интернет сервисов PrimerQuest и GenScript, с учетом требований, предъявляемых к дизайну олигонуклеотидов в системе TaqMan®: alsR-F - AACCCAGCTTGCGCCATAGT, alsR-R - TCGCGCGATCGTATGCTG, alsR-P - (FAM) CGCCACAGTTAAGAACGGCA(BHQ1); aphA-F -GATGCAACCGGGTACGATATAA, aphA-R - TCTG GTTTGCCTTCCTGTG, aphA-P - (FAM)ACGATAT ACCTGCTGATGGCTGGC(BHQ1); recA-F - ACGG
GTAACCTCAAGCAATC, recA-R - TATCCAAACG AACAGAAGCG, recA-P - (FAM)CCACTGGCGGTA ACGCACTGA(BHQl). Для реакции обратной транскрипции использовали набор реактивов «Реверта» (АмплиСенс, Россия).
Секвенирование. Фрагментное секвенирова-ние гена alsD с праймерами alsD-F CAGTGGTGA AGGCGAGATTT и alsD-R-GGCCGCTGCTGTTTA GGT проводили на приборе ABI Prism® 3500 XL (Applied Biosystems, США). Для биоинформационного анализа нуклеотидных последовательностей использовали пакет программы BioEdit V. 7.0.9.0. (BioEdit, США).
Пространственное моделирование структуры белка а-ацетолактат декарбоксилазы. Для моделирования белка AlsD использовали автоматизированный сервер SWISS - MODEL (swissmodel. expasy.org). Первичную аминокислотную последовательность белка а-ацетолактат декарбоксилазы определяли при помощи программы BioEdit Sequence Alignment Editor V. 7.0.9.0. по нуклеотидной матрице гена alsD с использованием нуклеотидной последовательности полного генома. Аминокислотную последовательность белка AlsD геновариантов выравнивали по целевому шаблону белка а-ацетолактат декарбоксилазы типичного штамма V. cholerae N16961 биовара Эль Тор при помощи алгоритма ProMod 3 V. 1.1.0. Оценку качества производили с использованием функции QMEAN (Qualitative Model Energy Analysis) [11, 12].
Статистическая обработка. Для статистической обработки экспериментальных данных применяли программы Microsoft Excel (Microsoft, США) и Statistica 6.0 (StatSoft, Россия), вычисляя среднюю арифметическую, стандартную ошибку средней арифметической и доверительный интервал.
Результаты и обсуждение
В работе использовались генетически измененные штаммы V. cholerae биовара эль тор, завезенные на территорию Российской Федерации и Украины с 1993 по 2011 год (табл. 1). Необходимо отметить, что геноварианты изолировали в разные периоды текущей пандемии холеры и отличались по структуре генов патогенности, пандемичности, адаптации, что ранее установили другие исследователи [13, 14, 15, 16, 17].
При постановке реакции Фогес-Проскауэра, используемой для дифференциации биоваров холерных вибрионов о1 серогруппы, выявлено, что данная реакция изменена у всех изученных штаммов (рис. 1). У большинства исследованных геновариан-тов (6 из 9 штаммов, что составило 66,7 %) она была слабоположительной, у остальных (33,3 %) - отрицательной. Полученные данные указали на снижение либо отсутствие способности геновариантов образовывать ацетоин из глюкозы. При этом все взятые в качестве контроля типичные штаммы V. cholerae о1 биовара эль тор дали положительную реакцию
Таблица 1/ Table 1
реакция фогес-Проскауэра и экспрессия регуляторных генов, контролирующих биосинтез ацетоина,
в штаммах V. cholerae биовара Эль Тор
Voges-Proskauer test and expression of regulatory genes, encoding acetoin biosynthesis in V. cholerae strains, biovar El Tor
Штамм / Strain Год, место и источник выделения / Year, site and source of isolation Результаты реакции Фогес-Проскауэра / Относительная экспрессия генов* / Relative gene expression*
Voges-Proskauer test results ■ alsR aphA
Геноварианты биовара Эль Тор / Genovariants of El Tor biovar
М1270 1993, Татарстан, человек / Tatarstan, patient Слабоположительная / Weakly positive 0,85±0,04 1,52±0,07
М1299 1993, Краснодар, человек / Krasnodar, patient Отрицательная / Negative 1,13±0,05 1,74±0,07
М1266 1994, Пермь, вн. ср. / Perm, ambient environment Слабоположительная / Weakly positive 1,08±0,05 2,46±0,11
M1293 1994, Дагестан, человек / Dagestan, patient Отрицательная / Negative н/и / not studied н/и / not studied
Р17644 1997, Ачинск, человек / Achinsk, patient Слабоположительная / Weakly positive 2,60±0,12 2,06±0,10
М1345 2001, Казань, человек / Kazan, patient Слабоположительная / Weakly positive 3,05±0,15 2,31±0,11
147 2010, Ялта, вн.ср. / Yalta, ambient environment Отрицательная / Negative 1,13±0,05 5,09±0,24
301 2011, Таганрог, вн. ср. / Taganrog, ambient environment Слабоположительная / Weakly positive 1,93±0,09 2,28±0,11
39 2011, Мариуполь, вн. ср. / Mariupol, ambient environment Слабоположительная / Weakly positive 2,77±0,13 3,92±0,19
Типичные штаммы биовара Эль Тор / Typical strains of El Tor biovar
М818** 1970, Балаково, человек / Balakovo, patient Положительная / Positive 1 1
М1062 1970, Астрахань, человек / Astrakhan, patient Положительная / Positive 1,53±0,06 0,93±0,04
М893 1970, Астрахань, человек / Astrakhan, patient Положительная / Positive 2,14±0,10 1,32±0,06
М1011 1972, Башкирия, человек / Bashkortostan, patient Положительная / Positive 1,79±0,07 0,90±0,04
Примечания: н/и - не изучали; *среднее значение относительного уровня экспрессии рассчитано по результатам трех измерений (р<0,05); **экспрессия генов данного штамма взята за 1.
Note: *average value of relative expression level is computed based on the results of three measurements (р<0,05); **gene expression of this strain is assumed as 1.
Фогес-Проскауэра (малиновое окрашивание среды) (табл. 1). У штамма V. cholerae 569В классического биовара данная реакция была отрицательная (светло-желтая окраска среды).
Таким образом, установлено, что диагностически значимый признак, реакция Фогес-Проскауэра, изменен у всех изученных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, завезенных в разные периоды седьмой пандемии.
Для выявления механизмов измененной продукции ацетоина у геновариантов проведен анализ структурных генов als оперона, а также изучена экспрессия регуляторных генов alsR и aphA, контролирующих его биосинтез, у типичных штаммов и гено-вариантов.
VVVV
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 1. Образование ацетоина штаммами V. cholerae в реакции Фогес-Проскауэра:
1 - штамм классического биовара 569B (отрицательный контроль); 2 -типичный штамм V. cholerae M818 биовара Эль Тор (положительный контроль); 3-7 - геноварианты V. cholerae М1299, 147, М1345, Р17644, м1266 биовара эль тор
Fig. 1. Acetoin production by V. cholerae strains in Voges-Proskauer test:
1 - strain of classical biovar 569B (negative control); 2 - typical V. cholerae strain M818, biovar El Tor (positive control); 3-7 - V. cholerae genovariants M1299, 147, M1345, P17644, M1266, biovar El Tor
Согласно данным литературы, als оперон включает шесть генов - alsR, alsD, alsS, alsO, acgA и acgB. При этом гены acgA и acgB не участвуют в биосинтезе ацетоина, так как кодируют соответственно белки с фосфодиэстеразным (EAL) и дигуанилат циклаз-ным (GGDEF) доменами, которые контролируют содержание сигнальной молекулы - циклического дигуанилата. Остальные четыре гена необходимы для продукции ацетоина. При этом alsR кодирует транскрипционный регулятор, позитивно контролирующий экспрессию генов alsD, alsS и alsO, ответственных соответственно за продукцию ферментов -ацетолактат декарбоксилазы, ацетолактат синтазы, ацетолактат оксидоредуктазы. Между генами alsR и alsD расположен сайт связывания с регуляторным белком AphA, положительно контролирующим биосинтез факторов вирулентности, но подавляющим продукцию ацетоина [8].
При анализе нуклеотидной последовательности генов alsR, alsD, alsS, alsO типичных штаммов установлена их идентичность таковым референс-штамма V. cholerae N16961 биовара Эль Тор. Исключение составил штамм М893, у которого в гене alsS в позиции 644 от начала гена выявлена несинонимичная замена С на Т. Однако наличие указанной SNP не влияет на образование ацетоина данным штаммом.
Исследование структуры als оперона генетически измененных штаммов показало, что они содержат интактный ген alsR, структура генов alsO и alsS также была идентична таковым референс-штамма. Однако у всех изученных геновариантов в после-
довательности гена alsD, кодирующего ацетолактат декарбоксилазу, выявлено отсутствие тиминового нуклеотида в позиции 315 от начала гена. Наличие делеции подтвердилось при последующем проведении фрагментарного секвенирования гена alsD у взятых в анализ штаммов. Необходимо отметить, что указанная делеция в гене alsD выявлена нами ранее при анализе шести клинических генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор [18], что указывает на закономерность, присущую всем изученным генетически измененным штаммам. Кроме того, при анализе последовательности гена alsD генетически измененного штамма V. cholerae ВАА-2163 биовара Эль Тор (Гаити, 2010), нуклео-тидная последовательность полного генома которого депонирована в GenBank (2010Е1 - 1786, код доступа AELH00000000.1) и который, согласно данным литературы, дает слабоположительную реакцию Фогес-Проскауэра [6, 7], также выявлена данная делеция. Таким образом, снижение (или отсутствие) продукции ацетоина у геновариантов коррелирует с изменением структуры гена alsD.
делеция тиминового нуклеотида в позиции 315 в гене alsD приводит к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона. Последующий анализ предполагаемой аминокис-
лотной последовательности белка AlsD у взятого в качестве модельного штамма V. cholerae М1293 в сравнении с таковой референс-штамма N16961 биовара Эль Тор действительно выявил различия в количестве аминокислот. Так, у геноварианта было на 145 аминокислотных остатков меньше, чем у референс-штамма. При этом процентное содержание некоторых аминокислот возрастало в результате уменьшения их общего количества (табл. 2).
Далее проведено моделирование пространственной структуры белка AlsD геноварианта М1293 и референс-штамма N16961 (рис. 2). Score (Z) QMEAN моделей белка AlsD составил - 1,13, что указывало на их высокое качество (модели с показателем Z ниже - 4,0 считаются низкокачественными). В результате наглядно показано, что белок AlsD геновариантов действительно сильно редуцирован. Таким образом, выявленные структурные изменения гена alsD геновариантов приводят к биосинтезу дефектного фермента ацетолактат декарбоксилазы, не способной участвовать в процессе декарбоксилиро-вания а-ацетолактата в ацетоин.
Однако в отсутствии ацетолактат декарбокси-лазы возможно спонтанное (неферментативное) декарбоксилирование, что фенотипически проявляется в наличии слабоположительной реакции Фогес-
Таблица 2 / Table 2
сравнительный анализ аминокислотного состава белка AlsD референс-штамма V. cholerae N16961 биовара Эль Тор и геноварианта м1293 с использованием программы BioEdit Sequence Alignment Editor
Comparative analysis of amino-acid composition of AlsD protein in V. cholerae reference-strain N16961, biovar El Tor and genovariant M1293, using BioEdit software tools, Sequence Alignment Editor
Аминокислота / Amino acid Референс-штамм N16961 / Reference-strain N16961 Геновариант M1293 / Genovariant M1293
количество аминокислот / number of amino acids содержание, в % / content, % количество аминокислот / number of aminoacids содержание, в % / content, %
Алании / Alanine 19 7,28 13 11,21
Цистеин / Cysteine 3 1,15 3 2,59
Аспарагиновая кислота / Asparagine acid 11 4,21 4 3,45
Глутаминовая кислота / Glutamine acid 16 6,13 8 6,90
Фенилаланин / Phenylalanine 17 6,51 8 6,90
Глицин / Glycine 19 7,28 9 7,76
Гистидин / Histidine 10 3,83 5 4,31
Изолейцин / Isoleucine 20 7,66 7 6,03
Лизин / Lysine 4 1,53 1 0,86
Лейцин / Leucine 19 7,28 13 11,21
Метионин / Methionine 4 1,53 2 1,72
Аспарагин / Asparagine 7 2,68 2 1,72
Пролин / Proline 15 5,75 6 5,17
Глутамин / Glutamine 26 9,96 11 9,48
Аргинин / Arginine 17 6,51 3 2,59
Серин / Serine 13 4,98 9 7,76
Треонин / Threonine 18 6,90 6 5,17
Валин / Valine 16 6,13 3 2,59
Триптофан / Tryptophan 0 0,00 0 0,00
Тирозин / Tyrosine 7 2,68 3 2,59
Всего аминокислот / Total number of amino acids 261 100,00 116 100,00
А В
Рис. 2. Моделирование пространственной структуры белка AlsD у референс-штамма V. cholerae N16961 биовара Эль Тор (A) и генетически измененного штамма М1293 (B) с использованием алгоритма ProMod 3 V. 1.1.0
Fig. 2. Modeling of spatial (3-D) structure of AlsD protein in V. cholerae reference-strain N16961, biovar El Tor (A) and genetically altered strain M1293 (B), using ProMod V. 1.1.0. algorithm
Проскауэра [8]. Возможно, у анализируемых нами генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор также происходит процесс спонтанного декарбоксилирования. При этом у каждого штамма данный процесс, возможно, происходит с неодинаковой интенсивностью и образуется разное количество ацетоина, поэтому мы наблюдаем слабоположительную реакцию Фогес-Проскауэра с разной окраской среды (от светлорозового до темнорозового).
Учитывая важную роль в образовании ацетоина регуляторных белков AlsR и AphA [8], далее изучена экспрессия генов aphA и alsR методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. В качестве референс-штамма, экспрессия генов которого взята за единицу, произвольно выбран типичный штамм V. cholerae М818. В результате установлено, что у геновариантов уровень экспрессии alsR сопоставим с экспрессией данного гена в типичных штаммах (табл. 1). В то же время уровень экспрессии aphA превышает этот показатель типичных штаммов в среднем в 2,5 раза.
Увеличенная продукция белка AphA, являющегося одним из центральных регуляторов экспрессии генов вирулентности, у генетически измененных штаммов вполне объяснима. Как известно, указанные штаммы отличаются повышенной продукцией данных факторов вирулентности [4, 13, 19, 20]. Возможно, повышение уровня экспрессии гена aphA, являющегося негативным регулятором биосинтеза ацетоина, также может обуславливать понижение или отсутствие его продукции у генетически измененных штаммов V. cholerae О1 биовара Эль Тор.
Таким образом, диагностически значимый признак - реакция Фогес-Проскауэра, используемая для дифференциации биоваров V. cholerae O1, изменен у всех изученных генетически измененных штаммов возбудителя холеры, завезенных в разные периоды седьмой пандемии холеры (1993-2011 гг.). Показано, что, в отличие от типичных изолятов, у 66,7 % исследованных геновариантов реакция Фогес-Проскауэра является слабоположительной, у 33,3 % - отрицательной, что указывает на снижение либо отсутствие
их способности образовывать ацетоин из глюкозы. Измененная способность к образованию ацетоина у геновариантов возбудителя холеры Эль Тор, возможно, является следствием делеции единичного ну-клеотида (Т в позиции 315) в структурном гене alsD, кодирующем ацетолактат декарбоксилазу, а также высокого уровня экспрессии гена aphA, негативного регулятора биосинтеза ацетоина. Однако мы не исключаем у геновариантов возможного присутствия еще не известных механизмов, также оказывающих влияние на биосинтез ацетоина данными штаммами.
конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
список литературы
1. Ali M., Nelson A. R., Lopez A.L., Sack D. A. Updated global burden of cholera in endemic countries. PLoS. Negl. Trop. Dis. 2015; 9(6):e0003832. DOI: 10.1371/journal.pntd.0003832
2. World Health Organization. Cholera, 2017. Wkly. Epidemiol. Rec. 2018; 93(38):489-500.
3. Kaper J.B., Morris J., Levin M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8(1):48-89.
4. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9):3296-99. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3296-3299.2002.
5. Safa A., Bhuyian N.A., Nusrin S., Ansaruzzaman M., Alam M., Hamabata T., Takeda Y., Sack D.A., Nair G.B. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 2006; 55(11):1563-69. DOI: 10.1099/jmm.().46689-0.
6. Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G., Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbilol. 2011; 49(11):3739-49. DOI: 10.1128/JCM.01286-11.
7. Brumfield K.D., Carignan B.M., Son M.S. Genotypic and phenotypic assays to distinguish Vibrio cholerae biotype. In: Sikora A., editor. Vibrio cholerae. Methods in Molecular Biology. Humana Press, New York, NY; 2018. Vol. 1839. P. 11-28. DOI: 10.1007/9781-4939-8685-9 2.
8. Kovacikova G., Lin W., Skorupski K. Dual regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive LysR-type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 2005; 57: 420-433.DOI: 10.1111/j.1365-2958.2005.04700.x.
9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984. 480 с.
10. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ЛЛО method. Methods. 2001; 25:402-8. DOI: 10.1006/meth.2001.1262.
11. Benkert P., Biasini M., Schwede T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models. Bioinformatics. 2011; 27:343-50. DOI: 10.1093/bioinformatics/ btq662.
12. Bertoni M., Kiefer F., Biasini M., Bordoli L., Schwede T. Modeling protein quaternary structure of homo- and hetero-oligom-ers beyond binary interactions by homology. Sci. Rep. 2017; 7:10480. DOI: 10.1038/s41598-017-09654-8.
13. Смирнова Н.И., Горяев A.A., Заднова С.П., Краснов Я.М., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Генетическая характеристика клинических штаммов Vibrio cholerae, завезенных на территорию Российской Федерации в современный период. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2011; 3:3-10.
14. Савельев В.Н., Савельева И.В., Бабенышев Б.В., Куличенко А.Н. Эволюция возбудителя и клинико-эпидемиологические особенности современной холеры Эль-Тор. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2012; 5:31-5.
15. Плеханов H.A., Заднова С.П. Структурно-функциональный анализ генов, кодирующих биосинтез маннозочув-ствительных гемагглютинирующих пилей адгезии у различных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; 4:75-8. DOI: 10.21055/0370-1069-20164-75-78.
16. Монахова Е.В., Писанов Р.В., Титова С.В. Особенности структуры генома возбудителей холеры, циркулирующих на территориях России и сопредельных стран. В кн.: Покровский
В.И., редактор. Сборник трудов IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика». Тамбов: ООО фирма «Юлис», 2017. Т. 1. С. 325-7.
17. Kuleshov K.V., Kostikova A., Pisarenko S.V., Kovalev D.A., Tikhonov S.N., Savelievа I.V., Saveliev V.N., Vasilieva O.V., Zinich L.S., Pidchenko N.N., Kulichenko A.N., Shipulin G.A. Comparative genomic analysis of two isolates of Vibrio cholerae O1 Ogawa El Tor isolated during outbreak in Mariupol in 2011. Infect. Genet. Evol. 2016; 44:471-8. DOI: 10.1016/j.meegid.2016.07.039.
18. Заднова С.П., Челдышова Н.Б., Крицкий A.A., Адамов А.К., Девдариани З.Л., Кутырев В.В. Сравнительный анализ метаболизма глюкозы в штаммах Vibrio cholerae биовара Эль Тор. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017; 35(2):64-9. DOI: 10.18821/0208-0613-2017-35-2-64-69.
19. Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11):4283-6. DOI: 10.1128/JCM.00799-10.
20. Ghosh P., Sinha R., Samanta P., Saha D.R., Koley H., Dutta S., Okamoto K., Ghosh A., Ramamurthy T., Mukhopadhyay A.K. Haitian variant Vibrio cholerae O1 strains manifest higher virulence in animal models. Front. Microbiol. 2019; 10:111. DOI: 10.3389/ fmicb.2019.00111.
References
1. Ali M., Nelson A. R., Lopez A.L., Sack D. A. Updated global burden of cholera in endemic countries. PLoS. Negl. Trop. Dis. 2015; 9(6):e0003832. DOI: 10.1371/journal.pntd.0003832
2. World Health Organization. Cholera, 2017. Wkly. Epidemiol. Rec. 2018; 93(38):489-500.
3. Kaper J.B., Morris J., Levin M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8(1):48-89.
4. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9):3296-99. DOI: 10.1128/JCM:40.9.3296-3299.2002.
5. Safa A., Bhuyian N.A., Nusrin S., Ansaruzzaman M., Alam M., Hamabata T., Takeda Y., Sack D.A., Nair G.B. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 2006; 55(11):1563-69. DOI: 10.1099/jmm.0.46689-0.
6. Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G., Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbilol. 2011; 49(11):3739-49. DOI: 10.1128/JCM.01286-11.
7. Brumfield K.D., Carignan B.M., Son M.S. Genotypic and phenotypic assays to distinguish Vibrio cholerae biotype. In: Sikora A., editor. Vibrio cholerae. Methods in Molecular Biology. Humana Press, New York, NY; 2018. Vol. 1839. P. 11-28. DOI: 10.1007/9781-4939-8685-9 2.
8. Kovacikova G., Lin W., Skorupski K. Dual regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive LysR-type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 2005; 57: 420-433. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2005.04700.x.
9. Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Molecular cloning. M.: "Mir"; 1984. 480 p.
10. Livak KJ., Schmittgen T.D. Analy sis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-AACt method. Methods. 2001; 25:402-8. DOI: 10.1006/meth.2001.1262.
11. Benkert P., Biasini M., Schwede T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models. Bio-
informatics. 2011; 27:343-50. DOI: 10.1093/bioinformatics/btq662.
12. Bertoni M., Kiefer F., Biasini M., Bordoli L., Schwede T. Modeling protein quaternary structure of homo- and hetero-oligom-ers beyond binary interactions by homology. Sci. Rep. 2017; 7:10480. DOI: 10.1038/s41598-017-09654-8.
13. Smirnova N.I., Goryaev A.A., Zadnova S.P., Krasnov Ya.M., Lozovsky Yu.V., Kutyrev V.V. Genetic characteristics of clinical Vibrio cholerae strains, imported in the territory of the Russian Federation in the modern period. Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii i Immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology, and Immunobiology]. 2011; 3:3-10.
14. Savel' ev eva IV., Babenyshev B.V., Kulichenko A.N. Evolution of the agent and clinical-epidemiological peculiarities of modern-day cholera El Tor. Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni [Epidemiology and Infectious Diseases]. 2012; 5:31-5.
15. Plekhanov N.A., Zadnova S.P. Structural-Functional Analysis of the Genes, Encoding Biosynthesis of Mannose-Sensitive Hemagglutinating Pili of Adhesion in Different Vibrio cholerae El Tor Strains. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; 4:75-8. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-4-75-78.
16. Monakhova E.V., Pisanov R.V., Titova S.V. [Peculiarities of genome structure in cholera agents, circulating in the territories of Russia and other neighboring countries]. In.: Pokrovsky V.I., editor. [Proceedings of the IX All-Russian Scientific-and-Practical Conference with International Participation "Molecular Diagnostics"]. Tambov: «Ulyss» Ltd.; 2017. Vol. 1. P. 325-7.
17. Kuleshov K.V., Kostikova A., Pisarenko S.V., Kovalev D.A., Tikhonov S.N., Savelieva I.V., Saveliev V.N., Vasilieva O.V., Zinich L.S., Pidchenko N.N., Kulichenko A.N., Shipulin G.A. Comparative genomic analysis of two isolates of Vibrio cholerae O1 Ogawa El Tor isolated during outbreak in Mariupol in 2011. Infect. Genet. Evol. 2016; 44:471-8. DOI: 10.1016/j.meegid.2016.07.039.
18. Zadnova S.P., Cheldyshova N.B., Kritsky A.A., Adamov A.K., Devdariani Z.L., Kutyrev V.V. Comparative analysis of
flucose metabolism in Vibrio cholerae strains, biovar El Tor. iolekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya, Virusologiya [Molecular
fenetics, Microbiology, and Virology]. 2017; 35(2):64-9. DOI: 0.18821/0208-0613-2017-35-2-64-69.
19. Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11):4283-6. DOI: 10.1128/JCM.00799-10.
20. Ghosh P., Sinha R., Samanta P., Saha D.R., Koley H., Dutta S., Okamoto K., Ghosh A., Ramamurthy T., Mukhopadhyay A.K. Haitian variant Vibrio cholerae O1 strains manifest higher virulence in animal models. Front. Microbiol. 2019; 10:111. DOI: 10.3389/ fmicb.2019.00111.
Authors:
Zadnova S.P., Kritsky A.A., Plekhanov N.A., Guseva N.P., Lozovsky Yu.V., Smirnova N.I. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: rusrapi@ microbe.ru.
об авторах:
Заднова С.П., Крицкий А.А., ПлехановН.А., ГусеваН.П., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru.
Поступила 08.04.19. Отправлена на доработку 11.04.19.
Принята к публ. 17.04.19.
