CC BY
9
МИКРОБИОЛОГИЯ
Пробл. особо опасных инф. 2016; 4:75-78. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-4-75-78
УДК 616.932:579.25
н.А.Плеханов, с.П.Заднова
структурно-функциональный анализ генов, кодирующих биосинтез МАннозочувСтвитЕльных гемагглютинирующих пилей адгезии у различных штаммов viBRiO cholerae биовара эль тор
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов, Российская Федерация
цель работы. Провести сравнительный структурный и функциональный анализ генов, кодирующих биосинтез маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей у типичных штаммов и геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор. материалы и методы. В работе использовали типичные и генетически измененные штаммы холерного вибриона биовара Эль Тор, выделенные на территории Российской Федерации в период с 1970 по 2012 год из объектов внешней среды и от больных. Были применены микробиологические и молекулярно-генетические методы, анализ данных полногеномного секвени-рования. результаты и выводы. Методом ПЦР установлено присутствие гена mshA, кодирующего основную субъединицу MSHA пилей, у всех исследуемых штаммов. При сравнительном анализе ну-клеотидной последовательности генов, входящих в msh кластер, у типичных штаммов и геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, установлена идентичность нуклеотидной последовательности гена mshA у всех исследованных штаммов. При этом у штаммов геновариантов, изолированных в период их появления (1988, 1993, 1994 гг.), структура остальных генов msh оперона идентична типичным Эль Тор вибрионам. В то же время, начиная с 1997 г., в штаммах геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор в последовательности генов, участвующих в сборке и секреции MSHA пилей, выявлены SNP, которые не оказывают влияния на биосинтез данных пилей адгезии, но их появление, возможно, явилось следствием адаптации штаммов геновариантов к разным условиям существования.
Ключевые слова: Vibrio cholerae, геноварианты, MSHA, SNP.
Корреспондирующий автор: Никита Александрович Плеханов, e-mail: rusrapi@microbe.ru.
N.A.Plekhanov, S.P.Zadnova
Structural-Functional Analysis of the Genes, Encoding Biosynthesis of Mannose-Sensitive Hemagglutinating Pili of Adhesion in Different Vibrio cholerae El Tor Strains
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation
Objective of the study is to conduct comparative structural and functional analysis of the genes, encoding biosynthesis of man-nose-sensitive hemagglutinating pili in typical V. cholerae El Tor strains and genovariants. Materials and methods. Utilized were typical and genetically altered strains of cholera vibrio, biovar El Tor, isolated in the territory of the Russian Federation between 1970 and 2012 from ambient environment objects and from patients. Applied were microbiological and molecular-genetic methods, as well as analysis of the data on the whole genome sequencing. Results and conclusions. Using PCR assay the presence of mshA gene, encoding basic sub-unit of MSHA pili, has been detected in all of the tested strains. Comparative analysis of the nucleotide sequence of the genes, included into msh cluster, has revealed identity of the nucleotide sequence of mshA gene, both in typical V. cholerae strains and genovariants. Thereat, in strains of genovariants, isolated at the time of their emergence (1988, 1993, 1994), the structure of the other genes in msh operon is identical to typical El Tor vibrios. At the same time, since 1997, in strains of V. cholerae El Tor genovariants, in the sequence of the genes, involved in the assembly and secretion of MSHA pili, identified have been the SNPs, which do not influence biosynthesis of these pili, but their occurrence, probably, was due to adaptation of the genovariant strains to varying living conditions.
Key words: Vibrio cholerae, genovariants, MSHA, SNP.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Nikita A. Plekhanov, e-mail: rusrapi@microbe.ru.
Citation: Plekhanov N.A., Zadnova S.P. Structural-Functional Analysis of the Genes, Encoding Biosynthesis of Mannose-Sensitive Hemagglutinating Pili of Adhesion in Different Vibrio cholerae El Tor Strains. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; 4:75-78. (In Russ.). DOI: 10.21055/0370-1069-2016-4-75-78
В настоящее время причиной заболевания холерой являются токсигенные штаммы геновариантов Vibrio cholerae 01 серогруппы биовара Эль Тор. Данные изоляты, впервые появившиеся в 90-х годах XX столетия, заменили типичные штаммы Эль Тор вибрионов, которые вызвали начало текущей, 7-й пандемии холеры [3, 8]. Геноварианты в настоящее время получили глобальное распространение в мире [9] и с 1993 г. завозятся в Российскую Федерацию, вызывая
вспышки и единичные случаи заболевания [2].
Как известно, V. с^1егае является не только патогеном человека, но и естественным обитателем пресных и соленых водоемов. В связи с этим особую важность представляют исследования механизмов выживания возбудителя во внешней среде. Переход из организма человека в водную среду сопровождается различными изменениями в клетках. в том числе снижается продукция факторов вирулентности,
но активно начинают экспрессироваться гены факторов адаптации, способствующие выживанию патогена в данной среде обитания. Показано, что уже на поздней стадии инфекции увеличивается экспрессия генов, кодирующих биосинтез маннозочувствитель-ных гемагглютинирующих пилей адгезии (MSHA) [5, 10, 14]. MSHA пили располагаются на поверхности бактериальной клетки и участвуют в первом этапе формирования биопленки - прикреплении микроорганизма к субстрату. при отсутствии продукции данных пилей биопленка не образуется [12, 13]. В составе биопленки холерные вибрионы защищены от действия различных повреждающих факторов внешней среды и могут длительное время сохраняться в воде открытых водоемов. по данным литературы, генова-рианты так же, как и типичные Эль Тор вибрионы, содержат msh оперон, но сведения о его структуре у штаммов геновариантов, изолированных в разные годы, а также сравнительной продукции ими MSHA пилей отсутствуют. в то же время изучение механизмов адаптации штаммов геновариантов V. cholerae биовара эль тор, способствующих их выживанию во внешней среде, позволят понять причины их селективного преимущества в современный период.
Учитывая важную роль MSHA пилей в выживании холерного вибриона во внешней среде, цель нашего исследования состояла в проведении сравнительного структурного и функционального анализа генов, кодирующих биосинтез маннозочувствитель-ных гемагглютинирующих пилей адгезии у типичных штаммов и геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор.
материалы и методы
Исследования были проведены на 41 штамме V. cholerae, выделенном на территории Российской Федерации от больных и из внешней среды в период с 1970 по 2012 год (табл. 1). Штаммы хранили в лио-филизированном виде в Государственной коллекции патогенных бактерий. Культуру выращивали на агаре и бульоне LB (pH 7,2) в течение 18-24 ч при 37 °С.
Продукцию MSHA-пилей определяли с использованием эритроцитов I группы человека, учитывая максимальное разведение культуры, дающее видимую агглютинацию [4].
Наличие гена mshA выявляли методом ПЦР по описанной ранее методике [1]. Анализ данных полногеномного секвенирования штаммов проводили с помощью пакета программ DNASTAR SeqMan pro.
результаты и обсуждение
согласно данным литературы, биосинтез MSHA пилей кодирует 17 генов, объединенных в два оперо-на (структурный и секреторный) и расположенных на острове персистенции EPI (от англ. environmental persistence island) на большой хромосоме [6]. При этом кроме гена mshA, кодирующего основную субъ-
единицу маннозочувствительных гемагглютинирующих пилей адгезии, в указанный оперон входят гены mshB-Q, ответственные за сборку и транспортирование пилей на поверхность клеток. Так, белок MshE (52,5 kDa) выполняет функцию АТФазы, MshJ относится к белкам системы секреции II типа и совместно с MshN участвует в сборке и секреции MSHA пилей [6, 7].
На первом этапе работы проведен анализ нуклеотидных последовательностей генов, входящих в msh оперон, у штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, полные геномы которых депонированы в базе данных NCBI. Для анализа были взяты типичный штамм V. cholerae М818 биовара Эль Тор (Саратов, 1970, LAHM00000000.1) и штаммы геновариантов, изолированные в разные годы на эндемичной территории и завезенные в Россию и сопредельные государства, - V. chole-rae Р13762 (Узбекистан, 1988, LQYD00000000.1), М1275 (Дагестан, 1993, LRAF00000000.1), М1293 (Дагестан, 1994, JFFW00000000.1), Р17644 (Ачинск, 1997, JRTW00000000.1), М1429 (Башкирия, 2002, LAEM00000000.1), Р18899 (Мурманск, 2006, LAKM00000000.1), L3226 (Москва, 2010, JDVX00000000), секвенированные в лаборатории геномного и протеомного анализа РосНИПЧИ «Микроб». Из базы данных NCBI также были
Таблица 1
Штаммы V. екоЫгае биовара Эль Тор, использованные в работе
Штамм Место выделения Год выделения
Типичные штаммы Эль Тор вибрионов
M712; М713 Московская область 1970
М736, М738 Пермь 1970
М818 Саратов 1970
M886; М887; M890 Астрахань 1970
М1011, М1013 Башкирия 1972
М582 Калмыкия 1974
М642 Астрахань 1975
С402 Ставрополь 1990
M1259; М1261 Пермь 1990
Геноварианты
M1275; M1297 Дагестан 1993
M1264; M1272; М1298; M1299 Краснодар 1993
М1270 Татарстан 1993
М1293; M1295 Дагестан 1994
М1268, М1269 Магнитогорск 1994
M1266 Пермь 1994
P17644; P17647 Ачинск 1997
P17645 Иркутск 1997
М1326 Дагестан 1998
M1344; M1345 Казань 2001
М1429 Башкирия 2004
М1430 Тверь 2005
P18899 Мурманск 2006
L3225; L3226, L4150 Москва 2010
301 Таганрог 2011
M1509 Москва 2012
МИКРОБИОЛОГИЯ
Таблица 2
результаты анализа нуклеотидной последовательности генов msh оперона различных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор
Штамм Место и год выделения Гены
mshA mshE mshH mshJ mshN
M818 Саратов, 1970 - - - - -
P13762 Узбекистан, 1988
M1275 Дагестан, 1993 - - - - -
M1293 Дагестан, 1994 - - - - -
P17644 Ачинск, 1997 - p:1219 G=>A - p:560 A=>G p:249 G=>
CIRS101 Бангладеш, 2002 - p:1219 G=>A - p:560 A=>G -
M1429 Башкирия, 2002 - p:1219 G=>A p:1384=>G p:560 A=>G -
P18899 Мурманск, 2006 - p:1219 G=>A - p:560 A=>G -
H1 Гаити, 2010 - p:1219 G=>A - p:560 A=>G -
L3226 Москва, 2010 - p:1219 G=>A - p:560 A=>G -
Примечание: «—» - последовательность гена идентична последовательности референс-штамма V. cholerae N16961 биовара Эль Тор.
взяты для сравнения полногеномные последовательности штаммов CIRS101 (Бангладеш, 2002, ACVW00000000.1), H1 (Гаити, 2010, AKGH00000000.1).
Предварительно использованные в эксперименте штаммы были протестированы на наличие гена mshA. При ПЦР-анализе было установлено, что в геноме всех исследуемых штаммов присутствует данный ген, что может указывать на биосинтез штаммами MSHA-пилей.
В результате анализа нуклеотидных последовательностей полных геномов изученных нами штаммов установлено, что последовательность гена mshA одинакова у всех исследованных штаммов и идентична референс-штамму V. cholerae N16961 биовара Эль Тор.
У штаммов V. cholerae M818, P13762, M1275 и м1293 структура остальных генов msh оперона также полностью совпадала с референс-штаммом.
В то же время у штамма V. cholerae P17644, изолированного в 1997 г., выявлена делеция одного ну-клеотида в гене mshN в позиции 255 от начала гена, а также обнаружены несинонимичные однонуклео-тидные замены (SNP) в генах mshJ (замена A на G в позиции 560) и mshE (замена G на A в позиции 1307). В штаммах геновариантов, выделенных в более поздние годы и в современный период (P18899, L3226, референс-штамм геновариантов CIRS101), также присутствовали SNP в генах mshJ и mshE (табл. 2). Необходимо отметить, что аналогичные замены были обнаружены зарубежными авторами у штаммов, выделенных во время эпидемии на острове Гаити в 2010 г. [11]. Возможно, выявленные SNP могут служить генетической меткой штаммов гено-вариантов V. cholerae биовара Эль Тор, выделенных после 1997 г.
У штамма М1429, кроме указанных SNP в mshJ и mshE, был обнаружен сдвиг рамки считывания в гене mshH, вызванный вставкой единичного гуани-нового нуклеотида в позиции 1384, приводящий к образованию стоп-кодонов.
Таким образом, в результате анализа структуры генов msh кластера был обнаружен ряд SNP в генах mshE и mshJ, общих для всех исследованных штаммов геновариантов, выделенных в период с 1997 по 2010 год Структура msh оперона у ранее выделенных штаммов геновариантов идентична типичным штаммам V. cholerae биовара Эль Тор.
На следующем этапе работы была изучена экспрессия данных пилей у типичных штаммов и штаммов геновариантов. В результате установлено, что все изученные штаммы продуцировали MSHA пили. При этом значительных отличий по их продукции между типичными штаммами V. cholerae биовара Эль Тор, изолированными в начале текущей пандемии холеры (1970-1990 гг.), и штаммами геновариантов, завезенными в разные годы (1993-2010), не выявлено.
в результате проведенных исследований установлено, что геноварианты V. cholerae биовара Эль Тор так же, как и типичные Эль Тор вибрионы, продуцируют MSHA пили, поэтому способны формировать биопленку и длительное время сохраняться во внешней среде. Анализ нуклеотидной последовательности msh оперона у исследованных штаммов, показал стабильное сохранение структуры гена mshA во всех исследованных штаммах V. cholerae биовара Эль Тор, что говорит о ее важной роли в работе всей msh-системы. При этом структура msh оперона в штаммах геновариантов, изолированных в период их появления (1988, 1993, 1994 гг.), идентична типичным Эль Тор вибрионам. В то же время, начиная с 1997 г., в штаммах геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор в последовательности генов, участвующих в сборке и секреции MSHA пилей, выявлены SNP, которые не оказывают влияние на биосинтез данных пилей адгезии, но их появление, возможно, явилось следствием адаптации штаммов геновари-антов к разным условиям существования.
конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Осин А.В., Нефедов К.С., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ геномов холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры. Генетика. 2005; 41:53-62.
2. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Заднова С.П., Краснов Я.М., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Генетическая характеристика клинических штаммов Vibrio cholerae, завезенных на территорию Российской Федерации в разные периоды 7-й пандемии холеры. Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2011; 3:3-10.
3. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Горяев А.А., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Эволюция генома Vibrio cholerae: пути формирования атипичных штаммов. Пробл. особо опасных инф. 2008; 3(97):5-11.
4. Hanne L.F., Finkelstein R.A. Characterization and distribution of the hemagglutinins produced by Vibrio cholerae. J. Infect. Immun. 1982; 36(Т):209-14.
5. Lutz C., Erken M., Noorian P., Sun S., McDougald D. Environmental reservoirs and mechanism of persistence of Vibrio cholerae. Frontiers Microbiol. 2013; 4(00375):1-15. DOI: 10.3389/ fmicb.2013.00375.
6. Marsh J.W., Taylor R.K. Genetic and transcriptional analyses of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin type 4 pilus gene locus. J. Bacteriol. 1999; 181(4):1110-7.
7. Marsh J.W., Sun D., Taylor R.K. Physical linkage of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin secretory and structural subunit gene loci: identification of the mshG coding sequence. J. Infect. Immun. 1996; 64(2):460-5.
8. Nair G.B., Faruque L.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9):3296-9. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3296-3299.2002.
9. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1):46-54. DOI: 10.1016/j.tim.2009.10.003.
10. Schild S., Tamayo R., Nelson E.J., Qadri F., Calderwood S.B., Camilli A. Genes induced late in infection increase fitness of Vibrio cholerae after release into the environment. Cell. Host. Microbe. 2007; 2(4):64-77. DOI: 10.1016/j.chom.2007.09.004
11. Sealfon R., Gire S., Ellis C., Caladerwood S., Qadri F., Hensley L., Kellis M., Ryan E.T., LaRocque R.C., Harris J.B., Sabeti P.C. High depth, whole-genome sequencing of cholera isolates from Haiti and Dominican Republic. BMC Genomics. 2012; 13:468. DOI: 10.1186/1471-2164-13-468.
12. Teschler J.K., Zamorano-Sanchez D., Utada A.S., Warner C.J., Wong G.C., Wong R.G., Linington R.G., Yildiz F.H. Living in the matrix. Assembly and control of Vibrio cholerae biofilms. J. Nat. Rev. Microbiol. 2015; 13(5):255-68. DOI: 10.1038/nrmicro3433.
13. Watnick P.L., Fullner K.J., Kolter R. A role for the man-nose-sensitive hemagglutinin in biofilm formation by Vibrio cholerae El Tor. J. Bacteriol. 1999; 181(11): 606-9.
14. Yildiz F.H., Visick K.L. Vibrio biofilms: so much the same yet so different. J. Trends Microbiol. 2009; 17(3):109-18. DOI: 10.1016/j.tim.2008.12.004.
References
1. Osin A.V., Nefedov K.S., Eroshenko G.A., Smirnova N.I. [Comparative analysis of El Tor cholera vibrios, isolated before and in different periods of the seventh cholera pandemic]. Genetika. 2005; 41:53-62.
2. Smirnova N.I., Goryaev A.A., Zadnova S.P., Krasnov Ya.M., Lozovsky Yu.V., Kutyrev V.V. [Genetic characteristics of clinical Vibrio cholerae strains, imported into the territory of the Russian Federation in different periods of the 7th cholera pandemic]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2011; 3:3-10.
3. Smirnova N.I., Cheldyshova N.B., Goryaev A.A., Lozovsky Yu.V., Kutyrev V.V. [Vibrio cholerae genome evolution: ways of atypical strains formation]. Probl. Osobo Opasn.Infek. 2008; 3(97):5-11.
4. Hanne L.F., Finkelstein R.A. Characterization and distribution of the hemagglutinins produced by Vibrio cholerae. J. Infect. Immun. 1982; 36(1):209-14.
5. Lutz C., Erken M., Noorian P., Sun S., McDougald D. Environmental reservoirs and mechanism of persistence of Vibrio cholerae. Frontiers Microbiol. 2013; 4(00375V1-15. DOI: 10.3389/fmicb.2013.00375.
6. Marsh J.W., Tayl lor R.K. Genetic and transcriptional analyses of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin type 4 pilus gene locus. J. Bacteriol. 1999; 181(4):1110-7.
7. Marsh J.W., Sun D., Taylor R.K. Physical linkage of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin secretory and structural subunit gene loci: identification of the mshG coding sequence. J. Infect. Immun. 1996; 64(2):460-5.
8. Nair G.B., Faruque L.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40(9):3296-9. DOI: 10.1128/ JCM.40.9.3296-3299.2002.
9. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1):46-54. DOI: 10.1016/j. tim.2009.10.003.
10. Schild S., Tamayo R., Nelson E.J., Qadri F., Calderwood S.B., Camilli A. Genes induced late in infection increase fitness of Vibrio cholerae after release into the environment. Cell. Host. Microbe. 2007; 2(4):64-77. DOI: 10.1016/j.chom.2007.09.004
11. Sealfon R., Gire S., Ellis C., Caladerwood S., Qadri F., Hensley L., Kellis M., Ryan E.T., LaRocque R.C., Harris J.B., Sabeti P.C. High depth, whole-genome sequencing of cholera isolates from Haiti and Dominican Republic. BMC Genomics. 2012; 13:468. DOI: 10.1186/1471-2164-13-468.
12. Teschler J.K., Zamorano-Sanchez D., Utada A.S., Warner C.J., Wong G.C., Wong R.G., Linington R.G., Yildiz F.H. Living in the matrix. Assembly and control of Vibrio cholerae biofilms. J. Nat. Rev. Microbiol. 2015; 13(5):255-68. DOI: 10.1038/nrmicro3433.
13. Watnick P.L., Fullner K.J., Kolter R. A role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formation by Vibrio cholerae El Tor. J. Bacteriol. 1999; 181(11): 606-9.
14. Yildiz F.H., Visick K.L. Vibrio biofilms: so much the same yet so different. J. Trends Microbiol. 2009; 17(3):109-18. DOI: 10.1016/j. tim.2008.12.004.
Authors:
Plekhanov N.A., Zadnova S.P. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: rusrapi@microbe.ru.
об авторах:
ПлехановН.А.,ЗадноваС.П. Российскийнаучно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru.
Поступила 06.10.16.
