CC BY
81
Химия растительного сырья. 2012. №3. С. 89-92.
УДК 615.322:581.19
ВЫДЕЛЕНИЕ СИТОСТЕРОЛИНА И ВИТЕКСИНА ИЗ ШЕЛУХИ ГРЕЧИХИ ПОСЕВНОЙ FAGOPYRUM SAGITTATUM GILIB. (POLYGONACEAE)*
© А.В. Мягчилов1", Л.И. Соколова1, П.С. Дмитренок2
1 Дальневосточный федеральный университет, ул. Октябрьская, 27,
Владивосток, 690950 (Россия), e-mail: [email protected] 2Тихоокеанский институт биоорганической химииДВО РАН, пр. 100 лет Владивостоку, 159, Владивосток, 690022 (Россия)
Из водно-спиртового экстракта шелухи гречихи посевной методом жидкостной колоночной хроматографии выделено соединение класса фитостеролов - Р-ситостерол-3-0-Р-Э-глюкопиранозид (ситостеролин), и флавоноид -апигенин-3-0-Р-Э-глюкопиранозид (витексин). Идентификация выделенных соединений проведена методами УФ-, ИК-, ЯМР-13С и ЯМР-'Н-спектроскопии и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением и электронной ионизацией.
Ключевые слова: шелуха гречихи посевной, Fagopyrum sagittatum Gilib., Polygonaceae, биологически активные вещества, апигенин-3-0-Р-Э-глюкопиранозид (витексин), ситостерол-3-0-Р^-глюкопиранозид (ситостеролин), ИК-спектроскопия, УФ-спектроскопия, ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия.
При выращивании и переработке зерна гречихи, как и других злаковых культур, образуются отходы в виде соломы, плодовых оболочек (шелуха, лузга, полова) и мучки (или отрубей) [1]. В большинстве хозяйств отходы остаются на полях и обычно сжигаются. Очистка зерна от плодовых оболочек производится на предприятиях, выпускающих крупу. Объем шелухи составляет около 20% от массы зерна. Следовательно, ежегодно возобновляются огромные количества ценного растительного сырья, которое до сих пор не находит эффективного использования. С точки зрения использования особое внимание привлекает шелуха гречихи посевной - Fagopyrum sagittatum вШЪ. (Ро^опасеае), которая, по-видимому, может использоваться как источник биологически активных веществ [2], необходимых для лечения и профилактики сердечно-сосудистых и желудочно-кишечных заболеваний.
Цель настоящей работы - выделение и идентификация биологически активных веществ из водноспиртовых экстрактов шелухи гречихи посевной.
Экспериментальная часть
Объектом исследования служила шелуха гречихи посевной - Fagopyrum ^^ШаШт вШЪ. (Ро^опа-сеае), ГШ - 15, сорт «При - 7», собранная в Амурской области, урожай 2008 г.
Навески шелухи (4*30 г) экстрагировали 900 мл 40% этилового спирта на кипящей водяной бане
Введение
МягчтовАлексей Викторович - аспирант, e-mail: [email protected] Соколова Лариса Ивановна - профессор, кандидат химическихнаук, e-mail: [email protected] Дмитренок Павел Сергеевич - заведующий лабораторией, кандидат химических наук, e-mail: [email protected]
с обратным холодильником в течение 1,5 ч. Объединенный спиртовый экстракт упаривали досуха на роторном испарителе.
К сухому остатку добавили 10 мл 96% этанола и смешали с 10 г силикагеля (70-230 меш). Смесь экстракта и силикагеля высушивали на воздухе при ком-
* Данная статья имеет электронный дополнительный материал (приложение), который доступен читателям журнала по адресу: http://www.chem.asu.ru/chemwood/volume16/2012_03/1203-089.pdf.
Автор, с которым следует вести переписку.
натной температуре и внесли на колонку с силикагелем Merk (70-230 меш). В качестве элюента использовали смесь хлороформ : этиловый спирт (содержание спирта изменялось от 0 до 100%). При элюировании смесью растворителей хлороформ - этиловый спирт в соотношении 80 : 20 (об/об) выделили соединение I. При элюировании смесью растворителей в соотношении 40 : 60 (об/об) выделили соединение II.
Очистку выделенных соединений проводили перекристаллизацией из этилового спирта. Выход соединения I составил 33 мг, а соединения II - 4,7 мг.
ИК-спектры регистрировали на спектрофотометре Perkin Elmer Spectrum BX в таблетках с KBr, УФ-спектры - на спектрофотометре Shimadzu UV 1240 mini. Масс-спектрометрический анализ проводили на приборе Agilent 6510 Q-TOF LC/MS с ионизацией электрораспылением и на приборе AMD 604S в режиме электронной ионизации при ионизирующем напряжении 70 В. Спектры ЯМР получены на спектрометре Bruker с рабочей частотой 400 МГц в d6-flMCO.
Результаты и их обсуждение
Соединение I. Белый кристаллический порошок с Тпл=251-253 °С. ИК-спектр соединения I имеет полосы поглощения: широкая полоса при 3412 см-1 (гидроксигруппы), 2965-2934 см-1 (колебания алифатических групп), 1166-1024 см-1 (колебания С-0 углеводного фрагмента).
В ЯМР-13С- спектре (см. электронное приложение к статье) исследуемого вещества наблюдаются химические сдвиги резонансных сигналов в сильнопольную (12,4-56,8 м.д.) и слабопольную (141,1, 120,2 м.д.) части спектра, которые сопоставимы с литературными данными для Р-ситостерола [3]. В области 60-80 м.д. присутствуют 4 резонансных сигнала углеводного фрагмента молекулы. Сигнал пятого аномерного атома углерода имеет химический сдвиг 101,4 м.д., что свидетельствует о наличии полуацетальной связи углеводного фрагмента и Р-ситостерола. Совокупность химических сдвигов этих атомов указывает на наличие в молекуле исследуемого соединения глюкопиранозы. Для установления конфигурации гликозидной связи измеряли константу спин-спинового взаимодействия (J), используя данные ЯМР-1Н-спектра (см. электронное приложение к статье). Измеренная константа спин-спинового взаимодействия аномерного протона при 4,19 м.д.(д) составила 8,0 Hz, что подтверждает наличие p-D-глюкопиранозного фрагмента в молекуле Р-ситостерола.
По данным масс-спектрометрического анализа в режиме электронной ионизации при ионизирующем напряжении 70 В молекулярный ион при m/z 576,79 отвечает брутто-формуле C35H60O6. Масса фрагментных ионов в спектре: 414,41 [M - С6НпОз]+ (5%); 396,53 [M - C6H„O6 (глюкоза)]+ (100%); 255,15 [M - ^6^06]+ (15%) соответствует литературным данным для Р-ситостерола-3-0-Р-Э-глюкопиранозида [4].
Сравнивая полученные экспериментальные данные с литературными, установили, что выделенное соединение является р-ситостерол-3-0-Р-Э-глюкопиранозидом (ситостеролином) [3-5]. Ранее это соединение было выделено из ореха медвежьего - Corydus colurna Linn и клевера персидского - Trifolium resupi-natum VAR. Microcephalum [3, 4]. Из шелухи гречихи посевной Fagopyrum sagittatum Gilib. ситостеролин выделен впервые.
Ситостеролин - биологически активное вещество, препятствующее абсорбции холестерина на стенках кровеносных сосудов и обладающее иммуномодулирующим действием [6].
Соединение II. Желтый кристаллический порошок с Тпл=201-203 °С. В УФ-спектре раствора соединения II в этаноле наблюдаются максимумы поглощения при 337, 269, 215 нм, характерные для соединений флавоноидной природы.
В ИК-спектре имеются характерные для флавоноидов полосы поглощения: широкая полоса при 3350 см-1 (фенольные гидроксигруппы), 1657 см-1 (карбонильная группа у-пирона), 1614-1570 см-1 (скелетные колебания ароматических колец), 1179-1042 см-1 (колебания С-0 углеводного фрагмента).
В масс-спектре, полученном при ионизации электрораспылением, присутствует единственный пик [M + Н]+ с массой 433,256, что отвечает брутто-формуле флавоноида C2JH20Oi0.
Методом УФ-спектроскопии исследовано влияние комплексообразующих и ионизирующих добавок на смещение полос в спектрах поглощения, что позволило установить положение гидроксигрупп в молекуле флавоноида. Результаты приведены в таблице.
Батохромный сдвиг первой полосы поглощения на 24 нм при добавлении ацетата натрия к этаноль-ному раствору флавоноида указывает на наличие гидроксигруппы у С-7, а батохромный сдвиг той же полосы на 46 нм в присутствии хлорида алюминия свидетельствует о наличии гидроксигруппы у С-5. Положение гидроксильной группы при С-4' подтверждается батохромным сдвигом первой полосы поглощения на 62 нм при добавлении этилата натрия.
Максимумы поглощения соединения II в УФ-области при добавлении диагностических реагентов (X, нм)
Полоса поглощения С2Н50Н СН3С00Ыа А1С13 С2Н50Ка
I 337 361 383 399
II 269 276 302 279
III 215 229 223 222
На основании данных УФ-спектроскопии можно предположить, что флавоноид имеет гидрокси-группы у С-7, С-5 и С-4'.
В ЯМР 13С-спектре флавоноида (см. электронное приложение к статье) наблюдается 20 сигналов. Наиболее слабопольный сигнал 182,8 м.д. принадлежит атому С-4 карбонильной группы. Сравнение химических сдвигов остальных сигналов слабопольной части спектра с литературными данными позволяет утверждать, что в качестве агликона в флавоноиде выступает апигенин [7]. В сильнопольной части спектра (60-83 м.д.) присутствуют 6 сигналов, принадлежащих к резонансу ядер атомов углеводного фрагмента молекулы. Число резонансных сигналов и их химические сдвиги подтверждают наличие в молекуле исследуемого соединения глюкопиранозы. Отсутствие в спектре характерного для флавоноидов сигнала при 94 м.д. свидетельствует о замещении атома водорода в положении С-8. В то же время химический сдвиг атома С-1" углеводного фрагмента молекулы при 74,0 м.д. указывает на отсутствие полуацетальной связи между атомами С-8 флавоноидного фрагмента и С-1" углеводного фрагмента и наличие между ними С-С связи. Для установления конфигурации гликозидной связи измеряли константу спин-спинового взаимодействия (Х), используя данные ЯМР 1Н-спектра (см. электронное приложение к статье). Измеренная константа спин-спинового взаимодействия аномерного протона при 4,66 м.д.(д), составила 8,0 И^, что подтверждает наличие р-Б-глюкопиранозного фрагмента в молекуле флавоноида.
Данные УФ-, ИК-, ЯМР-спектров и сравнение физико-химических констант с описанными в литературе позволили установить, что выделенное соединение является апигенин-8-С-Р-Б-глюкопиранозидом (ви-тексином) [8, 9]. Витексин - биологически активное вещество, обладающее сосудорасширяющим действием, а также способствующее усилению ферментативного метаболизма в сердечной мышце [10].
НО
Соединение I (ситостеролин) Соединение II (витексин)
Выводы
1. Методами спиртовой экстракции и жидкостной колоночной хроматографии из экстракта шелухи гречихи посевной Fagopyrum sagittatum вШЪ. (Ро^опасеае) выделены два биологически активных соединения: фитостерол - Р-ситостерол-3-0-Р-Б-глюкопиранозид (ситостеролин) и флавоноид - апигенин-8-С-Р-Б-глюкопиранозид (витексин).
2. Выделенные вещества идентифицированы на основании данных ИК-, УФ-, ЯМР- и масс-спектров с использованием различных источников ионизации.
Электронный дополнительный материал
В качестве приложения к статье в электронном дополнительном материале приведены ЯМР 1Н- и 13С-спектры исследованных соединений, обсуждаемых в статье.
Список литературы
1. Сергиенко В.И., Земнухова Л.А. Возобновляемые отходы химического сырья: комплексная переработка отходов производства риса и гречихи // Журнал Российского химического общества имени Менделеева. 2004. Т. 48, №3. С. 116-124.
2. Минеджэн Г.З. Сборник по медицине и нетрадиционным способам лечения. М., 1997. 268 с.
3. Isik E., Sabudak T., Oksuz S. Flavonoids from Trifolium resupinatum VAR. microcephalum // Chemistry of Natural
Compounds. 2007. Vol. 43, N5. Pp. 614-615.
4. Akhtar P., Ali M., Sharma M.P., Faroqi H., Khan H.N. Phytochemical investigation of fruits of Corydus colurna Linn // Journal of Phytology. 2010. Vol. 2. Pp. 89-100.
5. Wang Y., Lai D., Zhang Y., Kang A., Cao Y., Sun W. Study of steroidal saponins in Dioscorea Zingberensis // Jour-
nal of Natural Products. 2009. Vol. 2. Pp. 123-132.
6. Pegel K.H. The importance of sitosterol and sitosterolin in human and animal nutrition // South African Journal of Science. 1997. Vol. 93. Pp. 263-268.
7. Fathiazad F., Aelazar A., Amiri R., Sarker S.D. Extraction of flavonoids and quantification of rutin from waste Tobacco leaves // Iranian Journal of Pharmaceutical Research. 2006. Vol. 3. Pp. 222-227.
8. Kim J.H., Lee B.C., Kim, J.H., Sim G.S. The isolation antioxidative effects of vitexin from Acer palmatum // Arch Pharm Res. 2005. Vol. 28, N2. Pp. 195-202.
9. Ameddah S., Dendougui H., Menad A., Mekkiou R., Meraiki Z., Benayache S., Benayache F. Flavonoids from Chry-sahthemum fuscatum // Chemistry of Natural Compounds. 2007. Vol. 43, N2. Pp. 210-211.
10. Препарат «Бояршник GN Экстракт» [Электронный ресурс]. URL: http://www.ortho.ru/CVS/gn_hawthorn.html.
Поступило в редакцию 28 октября 2011 г.
После переработки 30 мая 2012 г.
Myagchilov A.V.1*, Cokolova L.I.1, Dmitrenok P.S.2 SITOSTEROLIN AND VITEXIN EXTRACTION FROM BUCKWHEAT HUSKS - FAGOPYRUM SAGITTATUM GILIB. (POLYGONACEAE)
1Far Eastern Federal University, Octyabrskaya street, 27, Vladivostok, 690950 (Russia), e-mail:[email protected] 2Pacific Institute of Bioorganic Chemistry FEB RAS, pr. 100-letiya Vladivostoka, 159, Vladivostok, 690022 (Russia)
In the growing and processing of buckwheat, as well as other cereals, produce waste in the form of straw, husks and husk. In most farms these waste remain in the field to be burned later. As a result huge amount of vegetable raw materials grow up yearly, but it still hasn’t find any effective use. Buckwheat husks is pretty interesting for practical usage. Apparently it is a source of biological-active compounds, that are used for cardiovascular and gastro-intestinal diseases treatment. The goal of current work is extraction and identification of biological-active substances from hydro-alcoholic extracts of buckwheat husks.
From aqueous-alcoholic extract of buckwheat husks by liquid column chromatography, isolated such compounds as P-sitocterol-3-O-P-D-glucopyranoside (sitosterolin, phytosterol class compound) and apigenin-3-O-P-D-glucopyranoside (vitexin, flavonoid class compound). Identification of extracted compounds was made by UV, IR, NMR-13C and NMR-'H spectral methods and also with EI and AP-ESI mass-spectral methods.
Keywords: seed buckwheat husk, Fagopyrum sagittatum Gilib., Polygonaceae, biological-active compounds, apigenin-3-O-P-D-glucopyranoside (vitexin), P-sitocterol-3-O-P-D-glucopyranoside (sitosterolin), IR-spectroscopy, UV-spectroscopy, NMR-spectroscopy, mass-spectroscopy.
References
1. Sergienko V.I., Zemnukhova L.A. Zhurnal Rossiiskogo khimicheskogo obshchestva imeniMendeleeva, 2004, vol. 48,
no. 3, pp. 116-124. (in Russ.)
2. Minedzhen G.Z. Sbornik po meditsine i netraditsionnym sposobam lecheniia [Collection of medical and non-
traditional methods of treatment]. Moscow, 1997. 268 p. (in Russ.)
3. Isik E., Sabudak T., Oksuz S. Chemistry of Natural Compounds, 2007, vol. 43, no. 5, pp. 614-615.
4. Akhtar P., Ali M., Sharma M.P., Faroqi H., Khan H.N. Journal of Phytology, 2010, vol. 2, pp. 89-100.
5. Wang Y., Lai D., Zhang Y., Kang A., Cao Y., Sun W. Journal of Natural Products, 2009, vol. 2, pp. 123-132.
6. Pegel K.H. South African Journal of Science, 1997, vol. 93, pp. 263-268.
7. Fathiazad F., Aelazar A., Amiri R., Sarker S.D. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 2006, vol. 3, pp. 222-227.
8. Kim J.H., Lee B.C., Kim, J.H., Sim G.S. Arch Pharm Res, 2005, vol. 28, no. 2, pp. 195-202.
9. Ameddah S., Dendougui H., Menad A., Mekkiou R., Meraiki Z., Benayache S., Benayache F. Chemistry of Natural
Compounds, 2007, vol. 43, no. 2, pp. 210-211.
10. Preparat «Boiarshnik GN Ekstrakt» [The drug «Boyarshnik GN extract»]. URL: http://www.ortho.ru/CVS/
gn_hawthorn.html. (In Russ.)
Received October 28, 2011 Revised May 30, 2012
* Corresponding autor.
