CC BY
2
БАКТЕРИОФАГИ / BACTERIOPHAGES
УДК 579.61:578.7
https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-1-103-116 Научная статья | Scientific article
Ц) Check for updates
(«d:
BY 4.0
Выделение новых бактериофагов Actinomyces oris и Aggregatibacter actinomycetemcomitans и исследование их биологических характеристик in vitro
Т.А. Кочетова н, В.В. Юскевич, Ф.М. Зурабов, Г.Т. Садикова, П.В. Медведев, В.М.Попова
ООО НПЦ «Микромир», Кисельный Нижний пер., д. 5/23, стр. 1, Москва, 107031, Российская Федерация
Кочетова Татьяна Андреевна; kochetova@micromir. bio
РЕЗЮМЕ АКТУАЛЬНОСТЬ. В связи с увеличением числа случаев возникновения инфекций паро-
донта, вызванных устойчивыми к антибиотикам штаммами бактерий Actinomyces oris и Aggregatibacter actinomycetemcomitans, способными формировать биопленки в полости рта, и недостаточной эффективностью противомикробных препаратов в борьбе с биопленками, актуальной задачей представляется выделение бактериофагов, активных в отношении данных бактерий.
ЦЕЛЬ. Выделение бактериофагов, активных в отношении Aggregatibacter actinomycetemcomitans и Actinomyces oris, изучение их биологических свойств и подбор оптимальных параметров культивирования системы «фаг-клетка» для получения чистых линий бактериофагов с высокими титрами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Бактериофаги выделяли из биообразцов слюны, зубного налета и содержимого пародонтального кармана и определяли их характеристики: оптимальные значения множественности инфекции, время культивирования системы «фаг-клетка», устойчивость к различным температурам и рН, стабильность при хранении. Морфологию фагов изучали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Морфологию негативных колоний, литическую активность, спектр хозяев и специфичность оценивали, используя спот-тестирование и метод Грациа. В работе использовали бактерии из коллекции штаммов НПЦ «Микромир».
РЕЗУЛЬТАТЫ. Выделены и изучены биологические свойства трех новых изолятов бактериофагов, активных в отношении A. oris (vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, vB_AorP_3/Bl-35), и бактериофага, активного в отношении Ag. actinomycetemcomitans (vB_AacS_1/Dc-1). Фаги бактерий A. oris отнесены к подовирусам, а бактериофаг vB_AacS_1/Dc-1 - к сифовирусам. Фаги образуют полностью прозрачные бляшки округлой формы без ореола, диаметром от 0,8±0,1 до 4,0±0,2 мм. Установлено, что для получения чистых линий фагов с максимальными значениями титра оптимальными являются следующие параметры: значение множественности инфекции - 0,1-10, время культивирования системы «фаг-клетка» - 8-12 ч. Выявлена способность бактериофагов A. oris лизировать штаммы Actinomyces naeslundii. Из 15 исследуемых штаммов A. оris, бактериофаги vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, vB_AorP_3/Bl-35 лизировали 10, 8 и 12 бактериальных штаммов соответственно, а изолят фага vB_AacS_1/Dc-1 проявлял литическую активность в отношении обоих тестируемых штаммов Ag. actinomycetemcomitans. Исследуемые фаги продемонстрировали стабильность при абиотическом стрессе и длительном хранении.
ВЫВОДЫ. Выделены три новых бактериофага, активных в отношении A. oris, и один бактериофаг, активный в отношении Ag. actinomycetemcomitans, а также изучены их биологические свойства. Выделенные бактериофаги являются перспективными для дальнейших
© Т.А. Кочетова, В.В. Юскевич, Ф.М. Зурабов, Г.Т. Садикова, П.В. Медведев, В.М. Попова, 2024
научных исследований на клинических штаммах, а также для проведения полногеномного секвенирования.
Ключевые слова: бактериофаги; Actinomyces oris; Aggregatibacter actinomycetemcomitans; заболевания пародонта; пародонтальные инфекции; биопленка; фаготерапия; фагопрофилактика; множественность инфекции; MOI; литическая активность
Для цитирования: Кочетова Т.А., Юскевич В.В., Зурабов Ф.М., Садикова Г.Т., Медведев П.В., Попова В.М. Выделение новых бактериофагов Actinomyces oris и Aggregatibacter actinomycetemcomitans и исследование их биологических характеристик in vitro. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2024;24(1):103-116. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-1-103-116
Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.
Isolation of novel Actinomyces oris and Aggregatibacter actinomycetemcomitans bacteriophages and study of their biological characteristics in vitro
Tatiana A. Kochetova Victoria V. Yuskevich, Fedor M. Zurabov, Gulnur T. Sadykova, Pavel V. Medvedev, Valentina M. Popova
Research and Production Centre Micromir, LLC, 5/23 Bldg. 1, Nizhny Kiselny Ln., Moscow 107031, Russian Federation
Tatiana A. Kochetova; kochetova@micromir. bio
ABSTRACT SCIENTIFIC RELEVANCE. The incidence of periodontal infections with antibiotic-resistant strains of Actinomyces oris and Aggregatibacter actinomycetemcomitans capable of forming biofilms in the oral cavity is increasing, and the effectiveness of antimicrobials against biofilms is insufficient. Therefore, the isolation of bacteriophages active against A. oris and Ag. actinomycetemcomitans is an urgent task.
AIM. This study aimed to isolate bacteriophages active against A. oris and Ag. actinomycetemcomitans, study their biological properties, and select optimum culture conditions providing pure lines and high titres of bacteriophages.
MATERIALS AND METHODS. Bacteriophages were isolated from biosamples of saliva, dental plaque, and periodontal pocket contents. The study determined bacteriophage characteristics, including the optimum multiplicity of infection, phage-cell system cultivation time, resistance to various temperatures and pH, and storage stability. Bacteriophage morphology was studied using transmission electron microscopy. Negative colony morphology, lytic activity, host range, and specificity were assessed using spot testing and the Gratia method. Bacterial strains were obtained from the strain collection of the Micromir research and production centre. RESULTS. The authors isolated and studied 3 novel bacteriophages active against A. oris (vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, and vB_AorP_3/Bl-35) and 1 bacteriophage active against Ag. actinomycetemcomitans (vB_AacS_1/Dc-1). The A. oris bacteriophages were classified as podoviruses, and the vB_AacS_1/Dc-1 bacteriophage was classified as a siphovirus. The phages formed completely transparent round plaques without a halo, with a diameter ranging from 0.8±0.1 to 4.0±0.2 mm. The optimum parameters established to obtain pure phages with maximum titres included a multiplicity of infection of 0,1-10 and phage-cell system cultivation time of 8-12 hours. The study demonstrated the ability of A. oris bacteriophages to lyse Actinomyces naeslundii strains. Of the 15 A. oris bacteriophage strains studied, vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, and vB_AorP_3/Bl-35 lysed 10, 8, and 12 bacterial strains, respectively. The vB_AacS_1/Dc-1 phage isolate exhibited lytic activity against both tested strains of Ag. acti-
nomycetemcomitans. The studied phages demonstrated stability under abiotic stress and long-term storage conditions.
CONCLUSIONS. The authors isolated 3 novel bacteriophages active against A. oris and 1 bacteriophage active against Ag. actinomycetemcomitans and studied their biological properties. The isolated bacteriophages are promising as candidates for further research using clinical strains and whole-genome sequencing.
Keywords: bacteriophages; Actinomyces oris; Aggregatibacter actinomycetemcomitans; periodontal diseases;
periodontal infections; biofilm; phage therapy; phage prophylaxis; multiplicity of infection; MOI; lytic activity
For citation: Kochetova T.A., Yuskevich V.V., Zurabov F.M., Sadykova G.T., Medvedev P.V., Popova V.M. Isola-
tion of novel Actinomyces oris and Aggregatibacter actinomycetemcomitans bacteriophages and study of their biological characteristics in vitro. Biological Products. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2024;24(1):103-116. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-1-103-116
Funding. The study was performed without external funding.
Disclosure. The authors declare having no conflict of interest requiring disclosure in this article.
Введение
Микробиом ротовой полости включает от нескольких сотен до нескольких тысяч разнообразных видов микроорганизмов [1-3]. Сообщество микроорганизмов, обитающих в полости рта, характеризуется вариабельностью и уникальностью для разных индивидуумов [3]. Микробная колонизация патогенной и условно-патогенной микрофлорой и связанное с ней образование биопленки представ -ляют серьезную проблему, влияющую на качество жизни и системное здоровье человека, так как способствуют развитию различных воспалительных заболеваний пародонта, вплоть до разрушения коллагеновых волокон, которые поддерживают зуб в альвеолярной кости [36]. Формирование биопленки на искусственных стоматологических поверхностях может привести к воспалению и разрушению мягких и твердых тканей, окружающих зубные им-плантаты, коронки или протезы [3, 6]. В связи с увеличением числа случаев возникновения пародонтальных инфекций, вызванных лекарственно-устойчивыми штаммами, и недостаточной эффективностью противомикробных препаратов в борьбе с биопленками, актуально использование антибактериальных препаратов на основе бактериофагов [4, 6, 7]. Основные преимущества фаготерапии: специфичность бактериофагов к определенному виду бактерий, способность лизировать антибиотико-устойчивые микроорганизмы, безопасность, отсутствие ущерба нормофлоре, а также эффективность в отношении не только бактерий
в планктонном состоянии, но и бактерий в виде биопленки1 [4, 6-8].
Бактерии Aggregatibacter actinomycetemcomitans и Actinomyces oris, способные формировать биопленку, являются одними из многих этиологических факторов заболеваний пародонта [1, 6, 9-13]. A. oris — грамположительный факультативно-анаэробный микроорганизм, ранний колонизатор в развитии биопленок полости рта, был идентифицирован при инфекциях корневых каналов, актиномикозах и периимпланти-те [1, 2, 9-11, 14, 15]. Основной патоген пародонта — Ag. actinomycetemcomitans — является поздним колонизирующим микроорганизмом, который выделялся при запущенных формах заболеваний пародонта, таких как локализованный агрессивный периодонтит, а также в полости рта здоровых людей [1, 4, 5, 12, 16-18]. Ag. actinomycetemcomitans - грамотрицательный факультативно-анаэробный патобионт полости рта, для жизнедеятельности которому требуется от 5 до 10% диоксида углерода [12, 13, 18]. Установлена роль Ag. actinomycetemcomitans и A. oris в развитии воспалительных заболеваний полости рта [4, 5], в связи с чем приоритетной задачей является выделение бактериофагов против данных микроорганизмов.
Цель работы — выделение бактериофагов, активных в отношении Ag. actinomycetemcomitans и A. oris, изучение их биологических свойств и подбор оптимальных параметров культивирования системы «фаг-клетка» для получения чистых линий бактериофагов с высокими значениями титра.
1 Зайцев АВ, Зурабов АЮ, Говоров АВ, Васильев АО, Арефьева ОА, Зурабов ФМ и др. Бактериофаги в урологии: методические рекомендации. М.: АБВ-пресс; 2022.
Материалы и методы
Материалы
Штаммы бактерий и условия роста. Клинические изоляты A. oris G-12, A. oris Ch-28, A. oris BL-35, Ag. actinomycetemcomitans Dc-1, использованные в данном исследовании, были получены из рабочей коллекции штаммов НПЦ «Микромир» (Россия). Подтверждение видовой (штаммовой) принадлежности изолятов проводили с использованием микроскопического, бактериологического, биохимического и масс-спектрометрического методов идентификации микроорганизмов.
Штаммы бактерий проверяли на наличие про-фагов индукцией ультрафиолетовым излучением [19], а также без воздействия индуцирующего фактора по методике, предложенной С. Лурией и Д. Дарнеллом [20]. Штаммы, проявляющие ли-зогенные свойства, выбраковывали.
Штаммы A. oris культивировали в течение 1822 ч на BHI агаре (HiMedia Laboratories, Индия) или в BHI бульоне (HiMedia Laboratories, Индия) при температуре 37 °С в термостате (Binder, Германия).
Штаммы Ag. actinomycetemcomitans культивировали в течение 18-22 ч на BHI агаре или в BHI бульоне в атмосфере 10% углекислого газа в инкубаторе МСО-175 (SANYO, Япония) при температуре 37 °С.
Бактериофаги. Для выделения бактериофагов и проведения экспериментов использовали штаммы: A. oris G-12, A. oris Ch-28, A. oris BL-35, Ag. actinomycetemcomitans Dc-1. Эти штаммы представляются наиболее удобными для производства бактериофагов и обладают наибольшей чувствительностью. Для каждого бактериофага использовали отдельный штамм: A. oris G-12 для vB_AorP_1/G-12, A. oris Ch-28 для vB_AorP_2/Ch-28, A. oris BL-35 для vB_AorP_3/BL-35 и Ag. actinomycetemcomitans Dc-1 для vB_AacS_1/Dc-1. Выделенные фаги были названы в соответствии с предложенной A.M. Kropinski с соавт. [21] системой наименований.
Методы
Выделение бактериофагов. Выделение бактериофагов и изучение их биологических свойств проводили методами, предложенными М. Адамсом [22] и Д.М. Гольдфарбом [23]. Образцы биоматериала из ротовой полости (слюна, зубной налет и содержимое пародонтального кармана) использовались в качестве источника для выделения фагов, специфичных к изолированным штаммам A. oris и Ag. actinomycetemcomitans.
Образцы биоматериала центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге Avanti J-E (Beckman Coulter, США) для удаления бактериальных клеток и крупных частиц [23]. Супернатант отделяли от осадка и фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор - 1,2; 0,45; 0,22 мкм (Sartorius, Германия).
Бактериофаги выделяли, используя метод обогащения «с подсевом»2. К 10 мл разлитого по пробиркам BHI бульона добавляли 1 мл культур A. oris и Ag. actinomycetemcomitans (108 КОЕ/мл), взятых в экспоненциальной фазе роста. Одновременно в пробирки вносили 10 мл ранее приготовленного фильтрата и инкубировали при 37 °C в течение 24 ч для получения обогащенного фагового лизата [23]. В общей сложности для процедуры обогащения использовали 12 штаммов (10 штаммов A. oris и 2 штамма Ag. actinomycetemcomitans). После периода обогащения смеси центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге Avanti J-E (Beckman Coulter, США). Супернатант отделяли от осадка и центрифугировали на ультрацентрифуге Optima L-90K (Beckman Coulter, США) при 27000 об/мин в течение 120 мин. Осадок ресуспендировали в 0,05 М трис-HCL буфере (pH 7,0-7,2) и фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор - 1,2; 0,45; 0,22 мкм (Sartorius, Германия). Подтверждение наличия фагов в обогащенном лизате проводили путем точечного нанесения фильтрата фагов на бактериальный газон исследуемых культур (спот-тест) [24]. При обнаружении лизиса культуры в месте нанесения капли фильтрата бактериофагов или появлении в этом участке мелких стерильных пятен фаговые ли-заты продолжали исследовать, используя метод агаровых слоев по Грациа [22, 23].
Получение чистых линий бактериофагов. Для получения чистых линий бактериофагов отбирали единичную хорошо изолированную бляшку с помощью стерильного наконечника микропипетки. Бляшку помещали в 5 мл BHI бульона одновременно с чувствительной культурой в экспоненциальной фазе роста и обогащали в течение 24 ч [23]. Данную процедуру повторяли три раза для получения морфологически однородных негативных колоний с последующей стерилизующей фильтрацией. Чистые линии бактериофагов помещали в стерильные пробирки и хранили для дальнейших исследований при 4 °C.
Оценка морфологии негативных колоний бактериофага. Метод агаровых слоев по Грациа
2 Лабинская АС, Блинкова ЛП, Ещина АС, ред. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических иссле-
дований: учебное пособие. М.: Медицина; 2004.
использовали для исследования морфологии бляшек фагов, активных в отношении A. oris и Ag. actinomycetemcomitans [22, 23]. В пробирки с BHI агаром (0,4%) добавляли по 1,0 мл разведений титруемого бактериофага и по 0,1 мл бактери -альной суспензии, затем высевали на предварительно подготовленные чашки с BHI агаром (1,5%). Морфологию бляшек изучали после инкубирования в течение 18-22 ч в условиях роста микроорганизмов, описанных ранее.
Электронная микроскопия. Морфологию ви-рионов исследовали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Каплю очищенных фагов с титром 109 бляшкообразующих единиц в 1 мл фаголизата (БОЕ/мл) наносили на медную подложку с последующим отрицательным окрашиванием 2% водным раствором уранилацетата (рН 3,0) и исследовали с использованием просвечивающего электронного микроскопа JEM-1011 (JEOL, Япония). Электронные микрофотографии были сделаны с помощью установленной на микроскоп камеры ErLangshen ES500W (Gatan, США). Оценку морфологических параметров бактериофагов проводили с использованием программы ImageJ3.
Определение оптимального значения множественности инфекции. Оптимальное значение множественности инфекции (multiplicity of infection, MOI) [25] для бактериофагов vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28 и vB_AorP_3/BL-35 устанавливали с использованием термостата (Binder, Германия) при температуре 37 °С и в условиях анаэробной станции WhitLey A35 (Don WhitLey Scientific, Великобритания), предусматривающих замещение воздуха специальной бескислородной газовой смесью (N2 - 80%, CO2 - 10%, H2 - 10%) при 37 °С. Показатель MOI фага vB_AacS_1/Dc-1 определя -ли в атмосфере 10% углекислого газа в CO2 инкубаторе МСО-175 (SANYO, Япония) при 31 °С. Штаммы-хозяева A. oris G-12, A. oris Ch-28, A. oris BL-35 и Ag. actinomycetemcomitans Dc-1 культиви-ровали в BHI бульоне до ранней фазы экспоненциального роста - 108 КОЕ/мл. Шесть различных концентраций бактериофагов были добавлены в жидкую питательную среду к штаммам-хозяевам для формирования множественности инфекции - 0,0001; 0,001; 0,01; 0,1; 1; 10 БОЕ/КОЕ [25]. После просветления пробирок образцы отбирали, а титр фагов определяли, используя метод Грациа [22, 23]. Анализ проводили в трех отдельных испытаниях и рассчитывали средние значения титров фагов, полученные на каждом этапе эксперимента.
3 https://imagej.net/ij/
Определение оптимального времени культивирования. Оптимальное время культивирования [25] фагов vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28 на соответствующих тест-штаммах A. oris G-12 и A. oris Ch-28 устанавливали при значении MOI, равном 1, в условиях анаэробной станции WhitLey A35 при температуре 31 °С. Для фага vB_AorP_3/BL-35 оптимальное время культивирования определяли на тест-штамме A. oris BL-35 при значении MOI, равном 10, в условиях анаэробной станции WhitLey A35 при 31 °С, а для фага vB_AacS_1/Dc-1 - на тест-штамме Ag. actinomycetemcomitans Dc-1 при MOI 0,1 в атмосфере 10% углекислого газа в CO2 инкубаторе при 31 °С. Опытным путем находили оптимальное соотношение между временем культивирования и активностью фагов [25]. Для этого каждые 2 ч отбирали образец для определения титра фага по методу Грациа [22, 23]. Изучаемый диапазон составил 12 ч. Анализ проводили в трех повторностях.
Определение спектра литической активности фагов. Литический спектр бактериофагов исследовали на 15 тест-культурах A. oris и 2 тест-культурах Ag. actinomycetemcomitans методом спот-тестирования [24].
Определение специфичности бактериофагов. Специфичность бактериофагов, активных в отношении A. oris, изучали методом спот-те-стирования культур родственных видов [24]: A. naeslundii, A. canis, A. georgiae, A. graevenitzii, A. israelii, A. neuii, A. odontolyticus, A. meyeri, A. weissii. Штаммы получены из коллекции микроорганизмов НПЦ «Микромир» (Россия).
Чувствительность фагов к температуре и рН. Температурную устойчивость выделенных бактериофагов определяли по изменению количества жизнеспособных фаговых частиц после инкубации в твердотельном термостате «Термит» («ДНК-Технология», Россия) при различных температурах (4, 25, 31, 50, 60, 10, 80 и 90 °С) в течение 1 ч [26]. Контрольные пробирки не прогревали. Количество оставшихся фаговых частиц определяли, используя метод Грациа [22, 23]. Исследование проводили в трех повторностях.
В ходе экспериментов по изучению чувствительности фагов к различным значениям рН среды фаговые фильтраты инкубировали в буферных растворах с различными значениями рН (2, 4, 1 и 11) при 25 °С в течение 1 ч [24]. Количество оставшихся фаговых частиц определяли, используя метод Грациа [22, 23].
Стабильность фаголизатов при длительном хранении. Стабильность фаголизатов,
хранящихся при температуре 4 °С, изучали путем отслеживания изменения титра фагов после 6 мес. хранения [27] с применением метода титрования по Грациа.
Статистическая обработка данных. Полученные результаты обрабатывали с использованием стандартного пакета программ Microsoft Office Excel, рассчитывая среднее арифметическое и стандартную ошибку.
Результаты и обсуждение
Проведено выделение новых бактериофагов, активных в отношении A. oris и Ag. actinomycetemcomitans, из образцов слюны, зубного налета и содержимого пародонтальных карманов (рис. 1). Использование данных образцов биоматериала для выделения фагов в настоящей работе обусловлено тем, что они могут являться средой обитания микроорганизмов A. oris и Ag. actinomycetemcomitans. Анализ литературных источников показал, что явление лизогении широко распространено среди штаммов Ag. actinomycetemcomitans, а выделенные бактериофаги в основном представляют собой умеренные миовирусы, полученные после различных индуцирующих воздействий на бактерию [6, 16, 28, 29]. В настоящем
Фотография выполнена авторами / The photograph is taken by the authors
исследовании новый бактериофаг, специфичный к Ag. actinomycetemcomitans, был выделен из объектов внешней среды без индуцирующего воздействия.
Согласно данным трансмиссионной электронной микроскопии, изоляты фагов vB_AorP_1/G-12 (рис. 1B), vB_AorP_2/Ch-28 (рис. 1C), vB_AorP_3/Bl-35 (рис. 1D) имели икосаэдрический капсид и короткий несокращающийся хвостовой отросток. Бактериофаг vB_AacS_1/Dc-1 (рис. 1A) имел изометрическую головку и длинный несокращающийся хвостовой отросток. В соответствии с классификацией Международного комитета по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)4 фаги бактерий A. oris были отнесены к подовирусам, а бактериофаг vB_AacS_1/Dc-1 - к сифовирусам. Оценка морфологии негативных колоний показала, что фаги vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, vB_AorP_3/Bl-35 и vB_ AacS_1/Dc-1 образуют полностью прозрачные бляшки округлой формы без ореола. Морфологические особенности ви-рионов фагов и морфология бляшек бактериофагов представлены в таблице 1.
Для получения чистых линий бактериофагов с высокими титрами важно определить следующие параметры: оптимальное значение MOI,
Рис. 1. Электронные микрофотографии фаговых частиц: A - vB_AacS_1/Dc-1; B - vB_AorP_1/G-12; С - vB_AorP_2/Ch-28; D - vB_AorP_3/BL-35. Контрастирование 2% раствором уранилацетата, увеличение *250 000.
Fig. 1. ELectron micrographs of bacteriophages: vB_AacS_1/Dc-1 (A), vB_AorP_1/G-12 (B), vB_AorP_2 /Ch-28 (C), and vB_AorP_3/BL-35 (D). Contrasting with 2% uranyL acetate soLution, *250 000.
4 https://ictv.global/taxonomy
Таблица 1. Морфологические особенности вирионов и морфология бляшек бактериофагов, активных в отношении Actinomyces oris и Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Table 1. Morphological characteristics of virions and plaques of bacteriophages active against Actinomyces oris and Aggregatibacter
actinomycetemcomitans
Морфология Morphology Бактериофаг Bacteriophage
vB_AorP_l/G-12 vB_AorP_2/Ch-28 vB_AorP_3/Bl-35 vB_AacS_1/Dc-1
Морфология капсида Capsid morphology Икосаэдрический Icosahedral Икосаэдрический Icosahedral Икосаэдрический Icosahedral Изометрический Isometric
Морфология хвостового отростка Tail morphology Короткий, несокращающийся Short, non-contractile Короткий, несокращающийся Short, non-contractile Короткий, несокращающийся Short, non-contractile Длинный, несокращающийся Long, non-contractile
Средний диаметр головки, нм Average head diameter, nm 44,00±2,82 46,00±2,49 42,00±2,31 59,00±3,31
Длина хвостового отростка, нм Tail length, nm - - - 101,00±3,16
Размер прозрачной бляшки, мм Clear plaque size, mm 0,8±0,1 1,0±0,2 4,0±0,2 1,2±0,2
Ореол бляшки Plaque halo Отсутствует Absent Отсутствует Absent Отсутствует Absent Отсутствует Absent
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
представляющее собой среднее количество вирусных частиц на одну клетку, которое рассчитывается путем деления общего количества трансдуцирующих единиц на количество высеянных клеток; время культивирования системы «фаг-клетка»; стабильность фагов при абиотическом стрессе и при длительном хранении.
Проводили исследование MOI для бактериофагов vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, vB_AorP_3/Bl-35 и vB_AacS_1/Dc-1 в диапазоне от 0,0001 до 10, чтобы определить оптимальные значения для получения максимальных титров каждого бактериофага. Условия для установления оптимальных значений MOI подобраны на основании культуральных свойств бактерий-хозяев. Результаты, представленные на рисунке 2, свидетельствуют о том, что для бактериофагов vB_AorP_1/G-12 и vB_AorP_2/Ch-28 оптимальное значение MOI равно 1, а самые высокие значения титра фагов получены в условиях анаэробной станции при 37 °C и составили (4,1±0,6)*109 и (1,2±0,3)*109 БОЕ/мл соответственно. Фаг vB_AorP_3/Bl-35 показал высокие значения титра и в условиях термостата, и анаэробной станции при MOI 10, однако наивысший титр достигнут в условиях анаэробной станции и составил (2,0±0,4)*109 БОЕ/мл. Для бактериофага vB_AacS_1/Dc-1 оптимальное значение MOI в условиях CO2 инкубатора было 0,1, титр составил (4,5±0,5)х109 БОЕ/мл (рис. 3). Эти значения MOI и условия культивирования использовали для дальнейших экспериментов, а также в технологии производства чистых линий бактериофагов.
Было установлено, что оптимальное время культивирования при температуре 37 °С для фагов vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28 и vB_AorP_3/Bl-35 составило 8-12 ч (рис. 4А-С). За это время происходил лизис тест-культуры (просветление среды по сравнению с контролем), значения титра фагов при этом были равны (3,4±1,1)*109, (2,2±0,5)*109, (1,8±0,6)*109 БОЕ/мл соответственно. Для фага vB_AacS_1/Dc-1 оп-тимальное время культивирования при температуре 37 °С составило 10-12 ч, титр был равен (3,1±0,7)*109 БОЕ/мл (рис. 4D). Полученные результаты зависимости значений титра фагов от времени культивирования были оптимальны для работы и использованы в дальнейших исследованиях, а также в технологии производства чистых линий бактериофагов.
При исследовании литического спектра фагов обнаружено, что из 15 исследуемых штаммов A. oris бактериофаги vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, vB_AorP_3/Bl-35 лизировали 10, 8 и 12 бактериальных штаммов соответственно. Изолят фага vB_AacS_1/Dc-1 проявлял литиче-скую активность в отношении обоих тестируемых штаммов Ag. actinomycetemcomitans. Результаты исследования представлены в таблице 2.
Результаты исследования специфичности трех выделенных изолятов бактериофагов vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28 и vB_AorP_3/Bl-35 свидетельствуют о том, что фаги проявляют свою активность и в отношении бактерии A. naeslundii, играющей важную роль в инициации и прогрессировании образования зубного налета (табл. 3) [30, 31].
| 1,00E+09 -■ _
§ 1,00E+08- _
S* да)7- 1 -
ft1 1
Si 1,00E+05 -
* | 1,00E+04 -
U 1,00E+03 -
1,00E+02 -
| 1,00E+01 -
£ 1,00E+00 -I-1-1-1-1-1-1
Ё 8
vB_AorP_1/G-12
vB_AorP_2/Ch-28
vB_AorP_3/Bl-35
A
£
1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00
10
0,1 0,01 0,001 0,0001 MOI
vB_AorP_1/G-12
vB_AorP_2/Ch-28
vB_AorP_3/Bl-35
0,001
0,0001
MOI
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 2. Результаты определения значения множественности инфекции для бактериофагов vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28 и vB_AorP_3/BL-35 после 8 ч инкубации в условиях термостата (А) и анаэробной станции (В) при 37 °C. Ось X - значения множественности инфекции (MOI). Ось Y - значения титра бактериофагов vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28 и vB_AorP_3/BL-35 в экспоненциальном виде, БОЕ/мл. Результаты основаны на трех повторностях экспериментов. Вертикальные маркеры погрешностей указывают отклонение от среднего значения.
Fig. 2. Results of determining the multiplicity of infection for vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, and vB_AorP_3/BL-35 after 8 hours of incubation in a thermostat (A) and an anaerobic station (B) at 37 °C. X-axis: muLtipLicity of infection (MOI). Y-axis: titres of vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, and vB_AorP_3/BL-35 in exponentiaL form, PFU/mL. ResuLts are based on tripLicate experiments. VerticaL error bars indicate the deviation from the mean.
1
B
Четыре исследуемых фага продемонстрировали хороший потенциал сохранения ли-тической активности в условиях абиотического стресса. Изоляты фагов vB_AorP_1/G-12 и vB_AacS_1/Dc-1 показали самую высокую термо -стойкость (60 мин при 80 °С) по сравнению с другими фагами ^В_АогР_2/С1>28 и vB_AorP_3/Bl-35),
которые были полностью инактивированы через 60 мин при 80 °C (рис. 5).
При анализе устойчивости бактериофагов к различным значениям pH (табл. 4) среды было установлено, что при значении pH 2,0 выявлено инактивирующее воздействие на все фаги, активные в отношении A. oris. Изоляты фагов
Таблица 2. Исследование чувствительности тест-штаммов Actinomyces oris и Aggregatibacter actinomycetemcomitans к бактериофагам in vitro
Table 2. In vitro study of Actinomyces oris and Aggregatibacter actinomycetemcomitans test strain sensitivity to bacteriophages
Бактериофаг Bacteriophage Тест-штамм Test culture Число исследованных штаммов, N Number of tested strains, N Число чувствительных штаммов, n (%) Number of sensitive strains, n (%)
vB_AorP_1/G-12 A. oris 15 10 (66,7%)
vB_AorP_2/Ch-28 A. oris 15 8 (53,3%)
vB_AorP_3/BL-35 A. oris 15 12 (80%)
vB_AacS_1/Dc-1 Ag. actinomycetemcomitans 2 2 (100%)
Таблица составлена авторами по собственным данным / The tabLe is prepared by the authors using their own data
| 1,00E+10 g 1,00E+09 1,00E+08
15 -j
4£ 1,00E+07 1,00E+06 Ё к" 1,00E+05
CO
® ^ 1,00E+04
■E | 1,00E+03 i- c^
^ 1,00E+02
x 1,00E+01
CD
<i 1,00E+00
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 3. Результаты определения значения множественности инфекции для бактериофага vB_AacS_1/Dc-1 после 10 ч инкубации в условиях CO2 инкубатора при 37 °C. Ось X — значения множественности инфекции (MOI). Ось Y — значения титра бактериофага vB_AacS_1/Dc-1 в экспоненциальном виде, БОЕ/мл. Результаты основаны на трех повторностях экспериментов. Вертикальные маркеры погрешностей указывают отклонение от среднего значения.
Fig. 3. Results of determining the multiplicity of infection for vB_AacS_1/Dc-1 after 10 hours of incubation in a CO2 incubator at 37 °C. X-axis: multiplicity of infection (MOI). Y-axis: titre of vB_AacS_1/Dc-1 in exponential form, PFU/mL. Results are based on triplicate experiments. Vertical error bars indicate the deviation from the mean.
Таблица 3. Исследование специфичности бактериофагов, активных в отношении Actinomyces oris, на культурах родственных видов in vitro
Table 3. In vitro study of the specificity of bacteriophages active against Actinomyces oris in cultures of related species
Бактериофаг Bacteriophage Тест-штамм Test culture Число исследованных штаммов, N Number of tested strains, N Число чувствительных штаммов, n (%) Number of sensitive strains, n (%)
vB_AorP_l/G-12 A. naeslundii 9 9 (100%)
A. odontolyticus 22 0 (0%)
A. neuii 2 0 (0%)
A. graevenitzii 3 0 (0%)
A. canis 1 0 (0%)
A. georgiae 1 0 (0%)
A. israelii 1 0 (0%)
A. meyeri 1 0 (0%)
A. weissii 1 0 (0%)
vB_AorP_2/Ch-28 A. naeslundii 9 6 (66,7%)
A. odontolyticus 22 0 (0%)
A. neuii 2 0 (0%)
A. graevenitzii 3 0 (0%)
A. canis 1 0 (0%)
A. georgiae 1 0 (0%)
A. israelii 1 0 (0%)
A. meyeri 1 0 (0%)
A. weissii 1 0 (0%)
vB_AorP_3/Bl-35 A. naeslundii 9 5 (55,6%)
A. odontolyticus 22 0 (0%)
Продолжение таблицы 3 Table 3 (continued)
Бактериофаг Bacteriophage Тест-штамм Test culture Число исследованных штаммов, N Number of tested strains, N Число чувствительных штаммов, n (%) Number of sensitive strains, n (%)
vB_AorP_3/Bl-35 A. neuii 2 0 (0%)
A. graevenitzii 3 0 (0%)
A. canis 1 0 (0%)
A. georgiae 1 0 (0%)
A. israelii 1 0 (0%)
A. meyeri 1 0 (0%)
A. weissii 1 0 (0%)
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
А
1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00
4 6 8 10 Время культивирования, ч Incubation time, h
12
4 6 8 10 Время культивирования, ч Incubation time, h
12
1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00
4 6 8 10 Время культивирования, ч Incubation time, h
12
4 6 8 10 Время культивирования, ч Incubation time, h
12
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 4. Соотношение между временем культивирования и активностью фагов при значении множественности инфекции (MOI), равном 1 (A — vB_AorP_1/G-12, B — vB_AorP_2/Ch-28), при значении MOI 10 (C — vB_AorP_3/Bl-35) и при значении MOI 0,1 (D — vB_AacS_1/Dc-1). Результаты основаны на трех повторностях экспериментов. Вертикальные маркеры погрешностей указывают отклонение от среднего значения.
Fig. 4. Phage activity as a function of incubation time at a multiplicity of infection of 1 (vB_AorP_1/G-12 (A) and vB_AorP_2/Ch-28 (B)), 10 (vB_AorP_3/Bl-35 (C)), and 0.1 (vB_AacS_1/Dc-1 (D)). Results are based on triplicate experiments. Vertical error bars indicate the deviation from the mean.
B
2
2
C
D
2
2
CD
-e-g
S Li Q-CL
1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06
S g 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00
А
25 37 50 60 70 80 90 Температура, °C Temperature, °C
-e-jS
S Li Q-CC
(2 £
о ^
1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00
4 25 37 50 60 70 Температура, °C Temperature, °C
80 90
ro с -в--!?
S Li Q-CL
(2 ¡U
1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E+00
C
25 37 50 60 70 80 Температура, °C Temperature, °C
90
1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07
là
^ 1,00E+06
1,00E+05
ш ^ (2 ¡u
CD
cd ш 1,00E+04
Q. ^ >- 2
Pi
1,00E+03 1,00E+02
1,00E+01 1,00E+00
25 37 50 60 70 80 90 Температура, °C Temperature, °C
Рисунок подготовлен авторами по собственным данным / The figure is prepared by the authors using their own data
Рис. 5. Устойчивость к тепловому воздействию бактериофагов: A - vB_AorP_1/G-12, B - vB_AorP_2/Ch-28, C - vB_AorP_3/BL-35, D - vB_AacS_1/Dc-1. Результаты основаны на трех повторностях экспериментов. Вертикальные маркеры погрешностей указывают отклонение от среднего значения.
Fig. 5. ThermaL resistance of bacteriophages: vB_AorP_1/G-12 (A), vB_AorP_2/Ch-28 (B), vB_AorP_3/BL-35 (C), and vB_AacS_1/Dc-1 (D). ResuLts are based on tripLicate experiments. VerticaL error bars indicate the deviation from the mean.
B
4
D
4
4
vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28 при значении рН 11,0 были полностью инактивированы, в то время как изолят фага vB_AorP_3/Bl-35 при этом же значении рН сохранял свою активность ((1,2±0,1)х101 БОЕ/мл). Бактериофаг
vB_AacS_1/Dc-1 сохранял активность при всех изучаемых значениях рН.
Активность фаговых лизатов, хранившихся при температуре 4 °С, исследовали по истечении 6 мес. Результаты показали, что значения
Таблица 4. Исследование стабильности выделенных изолятов бактериофагов при различных значениях pH Table 4. StabiLity study of the isoLated bacteriophages at different pH vaLues
pH Значение титра бактериофага, БОЕ/мл Phage titre, PFU/mL
vB_AorP_1/G-12 vB_AorP_2/Ch-28 vB_AorP_3/Bl-35 vB_AacS_1/Dc-1
2 0 0 0 (1,0±0,1)x104
4 (1,0±0,05)*105 (5,0±0,5)*105 (3,0±0,3)x104 (2,0±0,8)x104
7 (2,8±0,6)*109 (1,5±1,6)*109 (9,2±1,5)*108 (2,1±0,7)x109
11 0 0 (1,2±0,1)*101 (1,0±0,3)x104
Таблица составлена авторами по собственным данным / The tabLe is prepared by the authors using their own data
Таблица 5. Активность бактериофагов после хранения при 4 °C в течение 6 мес. Table 5. Viability of bacteriophages after storage at 4 °C for 6 months
Бактериофаг Bacteriophage Значение титра фага до хранения, БОЕ/мл Phage titre before storage, PFU/mL Значение титра фага после 6 мес. хранения, БОЕ/мл Phage titre in 6 months, PFU/mL
vB_AorP_l/G-12 (3,4±1,1)x109 (3,5±0,3)x109
vB_AorP_2/Ch-28 (2,2±0,5)x109 (1,3±0,5)x109
vB_AorP_3/Bl-35 (1,8±0,6)x109 (1,0±0,8)x109
vB_AacS_1/Dc-1 (3,1±0,7)x109 (1,2±1,3)x109
Таблица составлена авторами по собственным данным / The table is prepared by the authors using their own data
титра не изменяются после хранения в течение 6 мес. при температуре 4 °C (табл. 5).
Заключение
Выделены три новых бактериофага, активных в отношении A. oris (vB_AorP_1/G-12, vB_AorP_2/Ch-28, vB_AorP_3/BL-35), и один бактериофаг, активный в отношении Ag. actinomycetemcomitans (vB_AacS_1/Dc-1). Изучены биологические свойства бактериофагов, такие как морфология вири-
Литература/References
1. Periasamy S, KoLenbrander PE. Central roLe of the early colonizer Veillonella sp. in establishing muL-tispecies biofiLm communities with initial, middle, and Late coLonizers of enameL. J Bacteriol. 2010;192(12):2965-72. https://doi.org/10.1128/JB.01631-09
2. Wu C, Mishra A, Reardon ME, Huang IH, Counts SC, Das A, Ton-That H. StructuraL determinants of Actinomyces sortase SrtC2 required for membrane LocaLization and assembLy of type 2 fimbriae for interbacteriaL coaggregation and oraL biofiLm formation. J Bacteriol. 2012;194(10):2531-9. https://doi.org/10.1128/JB.00093-12
3. Sterzenbach T, HeLbig R, Hannig C, Hannig M. Bioad-hesion in the oraL cavity and approaches for biofiLm management by surface modifications. Clin Oral In-vestig. 2020;24(12):4237-60. https://doi.org/10.1007/s00784-020-03646-1
4. Das V, Vinod V, Biswas L, Kumar A, Biswas R. An update on possibLe aLternative therapeutics for future periodontaL disease management. J Appl Microbiol. 2023;134(1):Lxac039. https://doi.org/10.1093/jambio/Lxac039
5. MombeLLi A. MicrobiaL coLonization of the periodon-taL pocket and its significance for periodontaL therapy. Periodontol 2000. 2018;76(1):85-96. https://doi.org/10.1111/prd.12147
6. Szafranski SP, WinkeL A, Stiesch M. The use of bacteriophages to biocontroL oraL biofiLms. J Biotechnol. 2017;250:29-44.
https://doi.org/10.1016/jjbiotec.2017.01.002
7. TagLiaferri TL, Jansen M, Horz HP. Fighting pathogenic bacteria on two fronts: phages and antibiotics as combined strategy. Front Cell Infect Microbiol. 2019;9:22.
https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00022
онов фагов и фаговых бляшек, литическая активность, спектр хозяев, множественность инфекции, время культивирования системы «фаг-клетка», специфичность. Исследуемые фаги продемонстрировали стабильность при абиотическом стрессе и длительном хранении. Таким образом, выделенные бактериофаги являются перспективными для дальнейших научных исследований на клинических штаммах, а также для проведения полногеномного секвенирования.
8. tusiak-Szelachowska M, Weber-Dgbrowska B, Gorski A. Bacteriophages and lysins in biofilm control. Virol Sin. 2020;35(2):125-33. https://doi.org/10.1007/s12250-019-00192-3
9. Suzuki I, Shimizu T, Senpuku H. Role of SCFAs for fimbrillin-dependent biofilm formation of Actinomyces oris. Microorganisms. 2018;6(4):114. https://doi.org/10.3390/microorganisms6040114
10. Mishra A, Wu C, Yang J, Cisar JO, Das A, Ton-That H. The Actinomyces oris type 2 fimbrial shaft FimA mediates co-aggregation with oral streptococci, adherence to red blood cells and biofilm development. Mol Microbiol. 2010;77(4):841-54. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2010.07252.x
11. Sanchez BC, Chang C, Wu C, Tran B, Ton-That H. Electron transport chain is biochemically linked to pilus assembly required for polymicrobial interactions and biofilm formation in the gram-positive actinobacterium Actinomyces oris. mBio. 2017;8(3):e00399-17. https://doi.org/10.1128/mBio.00399-17
12. Kachlany SC. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin: from threat to therapy. J Dent Res. 2010;89(6):561-70.
https://doi.org/10.1177/0022034510363682
13. Danforth DR, Tang-Siegel G, Ruiz T, Mintz KP. A non-fimbrial adhesin of Aggregatibacter actinomycetemcomitans mediates biofilm biogenesis. Infect Immun. 2018;87(1):e00704-18. https://doi.org/10.1128/IAI.00704-18
14. Nambu T, Mashimo C, Maruyama H, Taniguchi M, Huang Y, Takigawa H, et al. Complete genome sequence of Actinomyces oris strain K20, isolated from an oral apical lesion. Microbiol Resour Announc. 2022;11(8):e0054122. https://doi.org/10.1128/mra.00541-22
15. Phichaphop C, Apiwattanakul N, Wanitkun S, Boonsathorn S. Bacterial endocarditis caused by Actinomyces oris: first reported case and literature review. J Investig Med High Impact Case Rep. 2020;8:2324709620910645. https://doi.org/10.1177/2324709620910645
16. Tang-Siegel GG, Chen C, Mintz KP. Increased sensitivity of Aggregatibacter actinomycetemcomitans to human serum is mediated by induction of a bacteriophage. Mol Oral Microbiol. 2023:38(1):58-70. https://doi.org/10.1111/omi.12378
17. Hbibi A, Bouziane A, Lyoussi B, Zouhdi M, Benazza D. Aggregatibacter actinomycetemcomitans: from basic to advanced research. Adv Exp Med Biol. 2022;1373:45-67.
https://doi.org/10.1007/978-3-030-96881-6_3
18. Gholizadeh P, Pormohammad A, Eslami H, Shokou-hi B, Fakhrzadeh V, Kafil HS. Oral pathogenesis of Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Microb Pathog. 2017;113:303-11.
https://doi.org/10.1016/j~.micpath.2017.11.001
19. Романова НА, Феоктистова НА, Золотухин СН, Васильев ДА, Алешкин АВ. Сравнительная эффективность методов выделения фагов бактерий Bacillus megaterium. Вестник ветеринарии. 2013;(1):26-7. Romanovа NA, Feoktistovа NA, Zolotukhin SN, Vasi-lyev DA, Aleshkin AV. Comparative efficacy of isolation methods for phages of Bacillus megaterium. Vest-nik Veterinarii. 2013;(1):26-7 (In Russ.).
EDN: PLHIWV
20. Лурия С, Дарнелл Дж. Общая вирусология. М.: Мир; 1970.
Luria S, Darnell J. General virology. Moscow: Mir; 1970 (In Russ.).
21. Kropinski AM, Prangishvili D, Lavigne R. Position paper: the creation of a rational scheme for the nomenclature of viruses of Bacteria and Archaea. Environ Microbiol. 2009;11(11):2775-7. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2009.01970.x
22. Адамс М. Бактериофаги. М.: Медгиз; 1961. Adams M. Bacteriophages. Moscow: Medgiz; 1961 (In Russ.).
23. Гольдфарб ДМ. Бактериофагия. М.: Медгиз; 1961. Goldfarb DM. Bacteriophagy. Moscow: Medgiz; 1961 (In Russ.).
24. Peng SY, Chen LK, Wu WJ, Paramita P, Yang PW, Li YZ, Lai MJ, Chang KC. Isolation and characterization of a new phage infecting Elizabethkingia anophelis and evaluation of its therapeutic efficacy in vitro and in vivo. Front Microbiol. 2020;11:728. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00728
25. Сульдина ЕВ. Разработка ускоренной схемы идентификации листерий с помощью фагового
биопрепарата L.m 4УЛГАУ. Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. 2020;(4):191-7.
SuLdina EV. Development of quick scheme identification of Listeria using phage biopreparation L.m 4УЛГАУ. Vestnik of Ulyanovsk State Agricultural Academy. 2020;4(52):191-7 (In Russ.). https://doi.org/10.18286/1816-4501-2020-4-191-197
26. Орловская ПИ, Гирилович НИ, Пилипчук ТА, Мандрик-Литвинкович МН, Коломиец ЭИ. Влияние физико-химических факторов на выживаемость бактериофагов фитопатогенных бактерий. В кн.: Коломиец ЭИ, ред. Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты. Минск: Беларуская навука; 2021. С. 204-11. Orlovskaya PI, Girilovich NI, Pilipchuk TA, Man-drik-Litvinkovich MN, Kolomiets EI. Effect of physico-chemical factors on survival of bacteriophages of phytopathogenic bacteria. In: Kolomiets, ed. Microbial biotechnologies: fundamental and applied aspects. Minsk: Belaruskaya navuka; 2021. P. 204-11 (In Russ.).
https://doi.org/10.47612/2226-3136-2021-13-204-211
27. Кочетова ТА, Юскевич ВВ, Садикова ГТ, Попова ВМ. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов, специфичных к Bordetella bronchi-septica. Ветеринария сегодня. 2022;11(3):273-9. Kochetova TA, Yuskevich VV, Sadykova GT, Popova VM. Isolation and study of biological properties of Bordetella bronchiseptica-specific bacterio-phages. Veterinary Science Today. 2022;11(3):273-9 (In Russ.).
https://doi.org/10.29326/2304-196X-2022-11-3-273-279
28. Stevens RH, Preus HR, Dokko B, Russell DT, Fur-gang D, Schreiner HC, et al. Prevalence and distribution of bacteriophage phi Aa DNA in strains of Actinobacillus actinomycetemcomitans. FEMS Microbiol Lett. 1994;119(3):329-37.
https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1994.tb06909.x
29. Loftus A, Delisle AL. Inducible bacteriophages of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Curr Microbiol. 1995;30(5):317-21. https://doi.org/10.1007/BF00295508
30. Dige I, Raarup MK, Nyengaard JR, Kilian M, Ny-vad B. Actinomyces naeslundii in initial dental biofilm formation. Microbiology (Reading). 2009;155(Pt 7):2116-26. https://doi.org/10.1099/mic.0.027706-0
31. Arai T, Ochiai K, Senpuku H. Actinomyces naeslun-dii GroEL-dependent initial attachment and biofilm formation in a flow cell system. J Microbiol Methods. 2015;109:160-6.
https://doi.org/10.1016/j~.mimet.2014.12.021
Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства критериям 1СМУЕ. Наибольший вклад распределен следующим образом: Т.А. Кочето-ва - сбор и анализ литературных данных, планирование экспериментов, выполнение экспериментальных работ (исследование специфичности и стабильности выделенных фагов, подбор оптимальных параметров культивирования системы «фаг-клетка») и статистическая обработка данных, обсуждение результатов исследования, написание текста рукописи; В.В. Юс-кевич - обобщение и обсуждение результатов исследования; Ф.М. Зурабов - критический анализ результатов исследования; Г.Т. Садикова - выполнение экспериментальных работ (исследование литической активности, спектра хозяев, морфологии фаговых бляшек); П.В. Медведев - электронно-микроскопические исследования бактериофагов; В.М. Попова - обсуждение результатов исследования, утверждение окончательной версии рукописи для публикации.
Authors' contributions. AH the authors confirm that they meet the ICMJE criteria for authorship. The most significant contributions were as follows. T.A. Koche-tova collected and analysed literature data, planned and conducted the experiments (studied the specificity and stability of isolated phages and selected optimal parameters for cultivating the phage-cell system), carried out statistical data processing, discussed the study results, and drafted the manuscript. V.V. Yuskevich generalised and discussed the study results. F.M. Zurabov critically analysed the study results. G.T. Sadykova performed the experiments (studied the lytic activity, the host spectrum, and the morphology of phage plaques). P.V. Medvedev performed electron microscopy of bacteriophages. V.M. Popova discussed the study results and approved the final version of the manuscript for publication.
Об авторах / Authors
Кочетова Татьяна Андреевна
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8280-4341 kochetova@micromir.bio
Юскевич Виктория Викторовна, канд. биол. наук
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0459-7479
v.yuskevich@micromir.bio
Зурабов Федор Михайлович
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7947-1128
fmzurabov@micromir.bio
Садикова Гульнур Тахавиевна
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7711-7958
gulnurs.5959@gmail.com
Медведев Павел Витальевич
ORCID: https://orcid.org/0009-0004-8857-9519
p.medvedev@micromir.bio
Попова Валентина Михайловна, канд. мед. наук ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9630-1945 popovavm9@yandex.ru
Поступила 19.09.2023 После доработки 28.02.2024 Принята к публикации 29.02.2024
Tatiana A. Kochetova
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8280-4341
kochetova@micromir.bio
Victoria V. Yuskevich, Cand. Sci. (Biol.)
ORCID: https://orcid.org/00 00-0002-0459-7479
v.yuskevich@micromir.bio
Fedor M. Zurabov
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7947-1128
fmzurabov@micromir.bio
Gulnur T. Sadykova
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7711-7958
gulnurs.5959@gmail.com
Pavel V. Medvedev
ORCID: https://orcid.org/0009-0004-8857-9519 p.medvedev@micromir.bio Valentina M. Popova, Cand. Sci. (Med.) ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9630-1945 popovavm9@yandex.ru
Received 19 September 2023 Revised 28 February 2024 Accepted 29 February 2024
