CC BY
49
УДК 578.821.52:57.083.24:57.083.224
Ключевые слова: вирус, оспа мышей, культура клеток, пассаж, реакция диффузионной преципитации
Key words: virus, mousepox, cell culture, passage, diffusion precipitation reaction
Жилин Е. С., Русанова А. М., Червякова О. В., Зайцев В. Л., Кошеметов Ж. К., Булатов Е. А.
ВЫДЕЛЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСА ОСПЫ МЫШЕЙ
ISOLATION, IDENTIFICATION AND STUDY OF SOME BIOLOGICAL PROPERTIES
OF THE MOUSEPOX VIRUS
РГП Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности (НИИПББ) КН МОН РК Адрес: 080409, Республика Казахстан, Жамбылская область, Кордайский район, пгт. Гвардейский
RGE Research Institute for Biological Safety Problems (RIBSP) SC ME&S RK Address: 080409, Republic of Kazakhstan, Zhambylskaya oblast, Kordaiskiy region, pgt. Gvardeiskiy
Жилин Евгений Сергеевич, зав. лабораторией «Методы и технологии консервирования биопрепаратов»
Zhilin Evgeniy S., Head of the Laboratory "Biopreparations preservation methods and technology" Русанова Анастасия Михайловна, к. б. н., ст. научн. сотрудник Rusanova AnastasiaM., Ph.D., Ph.D., Senior Staff Scientist Червякова Ольга Викторовна, к. б. н., ст. научн. сотрудник
Chervyakova Olga V., Ph.D., Senior Staff Scientist Зайцев Валентин Лукьянович, к. б. н., вед. научн. сотрудник Zaitsev Valentin L., Ph.D., Chief Staff Scientist Кошеметов Жумагали Каукарбаевич, к. б. н., зав. лабораторией «Диагностика и индикация вирусных инфекций» Koshemetov Zhumagali K., Ph.D., Head of the Laboratory "Infectious diseases diagnostics and indication" Булатов Ербол Акенович, к. б. н., ст. научн. сотрудник Bulatov Yerbol A., Ph.D., Senior Staff Scientist
Аннотация. В статье представлены результаты экспериментов по выделению, идентификации и изучению некоторых биологических свойств вируса оспы мышей. Установлена возможность репродукции вируса оспы мышей с проявлением выраженного цитопатического действия в первичной культуре клеток почек ягненка. Инфицирование культуральными суспензиями инициировало у мышей развитие оспоподобных поражений, некроза конечностей и гибель животных. Вирус 20-кратно пассированный в культуре клеток почек ягненка, сохранил свои патогенные свойства для белых мышей. Установлено антигенное родство выделенного изолята вируса оспы мышей с вирусами оспы коров, овец, коз, кур.
Summary. The given article presents the results of experiments on the isolation, identification and study of some biological properties of the mousepox virus. The possibility of reproduction of mousepox virus with expressed cytopathic effect in primary cell culture of lamb kidney had been established. Infection of mice with culture suspensions initiated development of varioloid lesions, necrosis of extremities and death of animals. 20-fold passed virus in cell culture of lamb kidney kept its pathogenicity for white mice. The antigenic similarity of isolates of the mousepox virus with viruses ofcowpox, sheep-pox, goat-pox and chicken-pox had been established.
Введение
Оспа мышей (variola murina, инфекционная эктромелия) - инфекционная вирусная болезнь мышей и крыс. Патогенез оспы мышей сходен с патогенезом натуральной оспы человека, который предполагает быструю репликацию вируса в первоначальном месте проникновения, как правило, кожи, а также быстрым распространением вируса кровью во внутренние органы, вторичной репликацией вируса в селезенке и печени и, наконец, распространением на кожу, что сопровожда-
ется типичной сыпью, характерной для других вирусов рода Orthopoxvirus [5].
При острой форме течения болезни животные погибают без видимых признаков болезни через 5-14 сут. Смертность, в зависимости от вирулентности штамма, достигает 50-100 %. Для хронической формы характерны поражения кожи и мышц конечностей, результатом которых являются отеки и гнойничковые высыпания, из которых выделяется серозная жидкость, образующая после подсыхания корочки, напоминающие
оспины у людей. Часто возникает некроз, гангрена, отпадение конечностей с образованием округлой культи. Кроме конечностей поражаются хвост, уши, мордочка и различные участки кожи [3].
Диагноз ставят на основании эпизоото-логических, клинических, патологоанатоми-ческих данных и результатов лабораторного исследования [6]. Антигены вируса оспы мышей имеют родственные связи с антигенами вирусов оспы коров, осповакцины, оспы обезьян [7]. Лечение не разработано. Для профилактики обязательно карантини-рование вновь завозимых животных.
Оспа мышей - широко распространенное заболевание в питомниках многих стран, где разводят лабораторных животных. Заболевание протекает спорадически, но часто поражаются все животные в эпизоотическом очаге. Эктромелия может приводить к контаминации вакцинных и вирулентных штаммов вирусов, пассируемых на белых мышах.
Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности по роду своей деятельности занимается изоляцией и поддержанием различных вакцинных и вирулентных штаммов вирусов. Для исследований ряда вирусных агентов в качестве чувствительной модели используются лабораторные мыши, что не исключает контаминацию материалов вирусом оспы мышей. Так, при проведении серии экспериментов по освежению вакцинного вируса бешенства на мышах был получен биоматериал из мозга, в препаратах которого методом электронной микроскопии обнаружены вирионы, морфологически сходные с вирусами рода Orthopoxvirus. Для идентификации вирусного агента были проведены исследования по его изоляции на чувствительных системах.
Материалы и методы
В качестве исходной суспензии использовали 20%-ю мозговую суспензию мыши, в препаратах которой при электроно-микро-скопических исследованиях были обнаружены вирионы, морфологически сходные c вирусами рода Orthopoxvirus.
Для изоляции вирусного агента использовали беспородных мышей и культуру клеток
почек ягнят (ПЯ) (Банк первичных и перевиваемых культур клеток НИИПЬБ).
Для заражения культур клеток 20%-ю суспензию мозга мыши подвергали центрифугированию при 3000 об./мин, 20 мин. Надо-садок в объеме 0,1 см3 вносили в пробирку с монослоем клеток ПЯ и инкубировали в течение 60 мин. Удаляли вирусный материал и вносили пристеночную полусинтетическую среду (1,0 % глютамина, 2,0 % инактивиро-ванной сыворотки крупного рогатого скота, 100 МЕ сульфата гентамицина). Культивирование вируса осуществляли при 37 °С. Контроль репродукции вируса проводили визуально по цитопатическому действию (ЦПД) вируса на клетки. Инфекционную активность вируса определяли по ЦПД в культуре клеток ПЯ. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча в модификации Ашмари-на и выражали в ^ ТЦД50/см3 [1].
Тканевыми и культуральными суспензиями вируса заражали мышей интрацере-брально в дозе 0,03 см3, внутрибрюшинно -0,5 см3, внутрикожно - 0,1 см3. Наблюдение за животными проводили в течение 21 суток.
Контроль наличия вируса в культураль-ных суспензиях и патологических материалах проводили электронной микроскопией методом негативного контрастирования. Культуральные и тканевые антигены исследовали в реакции преципитации со специфическими сыворотками при оспе коров, овец, коз, кур, контагиозной эктиме овец, хлами-диозе, болезни Ауески, катаральной лихорадке овец, чуме мелких жвачных животных (коммерческие препараты, изготавливаемые в НИИПЬБ). В качестве контроля использовали нормальную сыворотку овцы. Постановка реакции преципитации осуществлялась по методу ОисЫ;ег1опу [9].
Результаты и обсуждение
С целью выделения вирусного агента использовали белых мышей и культуру клеток ПЯ. Интрацеребральное и внутрибрюшин-ное заражение мышей мозговой суспензией вируса приводило к их гибели через 7-10 суток после заражения без клинических проявлений заболевания животных. Внутрикож-ное введение вирусного материала и исполь-
Рис. 1. Световая микроскопия инфицированной и неинфицированной культуры клеток ПЯ (Инстр. ув. х200): а - деструктивные изменения культуры клеток ПЯ, 5 сутки после инфицирования; б - незараженная культура клеток ПЯ, 5 сутки инкубирования.
Рис. 3. Клинические признаки заболевания у инфицированных мышей: а - конъюнктивит глаз, б - отеки конечностей, в - пустулезная сыпь, г - некроз тканей конечностей, отсутствие фаланг пальцев.
зование для последующих 4 пассажей на мышах мозговых суспензий павших мышей при различных способах введения не приводило к заболеванию и гибели животных в течение всего срока наблюдения.
При инфицировании культуры клеток ПЯ на втором пассажном уровне на 3 сутки культивирования обнаружены деструктивные изменения клеточного монослоя, проявлявшиеся в виде небольшого разрежения монослоя, окруженного округлыми светопреломляющими клетками. Количество очагов и площадь деструктивного поражения клеток увеличивались к 10 пассажному уровню, наблюдалось 80-90%-е поражение клеточного монослоя (рис. 1а). Начало поражения клеток выявлялось на 2 сутки, максимальное поражение клеточного монослоя установлено на 5 сутки. В монослое незараженных клеток подобных изменений не отмечали (рис. 1б).
При электронно-микроскопическом исследовании препаратов культуральной суспензии 10 пассажного уровня были обнаружены единичные вирусные частицы и скопления вирионов. Вирионы имели морфологическую характеристику, типичную (кирпичеобразную) для рода Orthopoxvirus (рис. 2а). Диаметр вирусных частиц варьировал в пределах 200-250 нм, длина составляла 250-300 нм. Многослойная оболочка вируса толщиной 20-25 нм была покрыта многочисленными полыми трубкообразны-ми структурами диаметром 5-7 нм и длиной 18-20 нм (рис. 2б).
Суспензией 10-пассажного уровня были инфицированы 3 группы животных по 10 мышей в каждой. В результате проведенного опыта было установлено, что интраце-ребральное и внутрибрюшинное введение культуральной суспензии вызывало гибель всех животных (1, 2 группа животных) на 5-10 сутки после заражения. Клинических симптомов заболевания при этом не отмечали. При внутрикожном введении вируса в область хвоста на 7 сутки отмечено появление конъюнктивита глаз (рис. 3 а) и отеков конечностей (рис. 3б) с последующим появлением на 10 сутки пустулезной сыпи, из которой происходило выделение серозного экссудата (рис. 3в). После спадания отеков на месте
пустул образовывались язвочки и корочки. Через 15 суток после заражения наблюдали некроз тканей конечностей с последующим отпадением фаланг пальцев и конечностей с образованием культи (рис. 3г). Все вышеописанные симптомы соответствовали клиническому течению и поражениям, развивающимся при оспе мышей, приведенным в литературе [2, 8].
Мыши, павшие после заражения, были подвергнуты патологоанатомическому вскрытию. В результате вскрытия установлено наличие кровоизлияний в верхнем отделе кишечника и легких, увеличение печени и селезенки, при гистологическом исследовании найдены цитоплазматические включения в клетках эпидермиса кожи и печени, что также соответствует патогенезу оспы мышей [3, 4, 5].
Пробы органов (мозг, печень, селезенка, легкие, кишечник в виде 20%-х суспензий) павших мышей, а также антигены, полученные из инфицированных клеток 10 пассажного уровня, были исследованы в реакции преципитации со специфическими сыворотками при оспе коров, овец, коз, кур, контагиозной эктиме овец, хламидиозном аборте овец, болезни Ауески, катаральной лихорадке овец и нормальной овечьей сыворотке.
Результаты исследований отражены в таблице. Из таблицы видно, что антигены, полученные из инфицированных клеток ПЯ и печени павших животных, реагировали положительно со специфическими сыворотками при оспе коров, овец, коз, кур при отрицательных результатах с другими гете-рологичными сыворотками, что свидетельствует о наличии антигенных связей с вирусами рода Orthopoxvirus и Capripoxvirus.
При проведении дальнейшего пассирования вируса (10 пассажей) в культуре клеток ПЯ наблюдалось сохранение выраженного цитопатогенного действия вируса на клеточный монослой. В вирусных материалах выборочных пассажей определена инфекционная активность вируса. В результате установлено, что при выбранных условиях культивирования титры вируса в культуральных суспензиях 11-20 пассажного уровня составляли 5,5^6,26 lg ТЦД50/см3. Независимо
Примечание: СС - сыворотка специфическая; СН- сыворотка нормальная; АгС - антиген специфический; АгН - антиген нормальный; КЭО - контагиозная эктима овец; ХАО - хламидиозный аборт овец; КЛО - катаральная лихорадка овец; ОО - оспа овец; ЧМЖЖ - чума мелких жвачных животных; «+» - положительный результат; «-» - отрицательный результат; «н/и» - не исследовали.
Таблица.
Результаты исследований тканевых и культуральных проб в реакции диффузионной преципитации
№ п/п Наименование исследуемых проб Контрольные сыворотки
СС оспы коз СС ОО СС оспы коров СС оспы кур СС КЭО СС ХАО * о ^ и i СС КЛО СС Ауе-ски К О
1 Мозг - - - - - - - - - -
2 Легкие - - - - - - - - - -
3 Печень + + + + - - - - - -
4 Кишечник - - - - - - - - - -
5 Селезенка - - - - - - - - - -
6 АгС оспа мышей на ПЯ (100 раз концентрированный) + + + +
7 АгС ОО - + + - - - - - - -
8 АгС оспа коров + н/и + н/и н/и н/и н/и н/и н/и н/и
9 АгС болезни Ауески - - - - - - - - + -
10 АгС КЛО - - - - - - - + - -
11 АгС КЭО н/и н/и н/и н/и + н/и н/и н/и н/и н/и
12 АгС оспа кур н/и н/и н/и + н/и - н/и н/и н/и н/и
13 АгС ЧМЖЖ н/и - н/и н/и н/и н/и + - - -
14 АгН ПЯ - - - - - - - - - -
от пассажного уровня вирус сохранял патогенные свойства для мышей при различных методах инфицирования.
Заключение
В результате проведенных исследований установлено, что вирус оспы мышей успешно культивируется в первичной культуре клеток почек ягненка с проявлением выраженного цитопатического действия. При заражении мышей исследуемый вирус вызывает развитие характерных для инфекционной эктромелии клинических признаков и пато-логоанатомических изменений. В антигенном отношении изолированный вирус близкородственен к вирусам родов Orthopoxvirus и Capripoxvirus. Совокупность клинических, патоморфологических признаков и морфо-метрических антигенных свойств выделенного изолята позволяет идентифицировать
изолированный вирусный агент как вирус оспы мышей.
Список литературы
1. Ашмарин, И. П. Статистические методы в микробиологии / И. П. Ашмарин, А. А. Воробъев. - Л. : Медгиз, 1962. - 180 с.
2. Сенкевич, Т. Г. Рекомбинанты вирусов осповак-цины и эктромелии, вызывающие характерные для вируса эктромелии поражения у мышей / Т. Г. Сенкевич, P. P. Арасланов, Т. С. Вовк и др. // Молекул. генетика, микробиология и вирусология. - 1989. -№ 8. - С. 20-23.
3. Allen, A. M. Pathology and diagnosis of mousepox / A. M. Allen, G. L. Clarke, J. R. Ganaway et al. // Laboratory Animal Science. - 1981. - 31. -P. 599-608.
4. Baker, D. G. Natural Pathogens of Laboratory Mice, Rats, and Rabbits and Their Effects on Research / D. G. Baker // Clinical Microbiology Reviews. - 1998. -Vol. 11. - No. 2. - P. 231-266.
5. Chaudhri, G. Obligatory requirement for antibody in recovery from a primary poxvirus infection / G. Chaudhri,
V Panchanathan, H. Bluethmann, G. Karupiah // J. Virol. -2006. - 80 (13). - P. 6339-44.
6. Esteban, D. J. Ectromelia virus: the causative agent of mousepox / D. J. Esteban, R. M. Buller // J. Gen. Virol. - 2005. - 86. - P. 2645-2659.
7. Fenner, F. The Orthopoxvirus / F. Fenner, R. Wittek, K. Dumbell. - London : Academic Press, 1989.
8. Krzyzowska, M. Mousepox conjunctivities: the role of Fas/FasL-mediated apoptosis of epithelial cells in virus dissemination / M. Krzyzowska, M. Polanczyk, M. Bas, J. Cymerys et al. // J. Gen. Virol. - 2005. - 86. - P. 2007-2018.
9. Ouchterlony, O. Diffusion in gel methods for immunological analysis / O. Ouchterlony // Prog. Allergy. - 1962. - 6. - P. 3-15.
Л
НОУ ДО «Институт Ветеринарной Биологии» приглашает принять участие в семинарах в 2012/2013 учебном году:
+1
«Рентгенодиагностика
мелких домашних животных»
Семинар проводится с 2009 года. Состоит из теоретической и практической частей. В курсе теории слушатели знакомятся с терминологией, физическими и техническими аспектами рентгеновского излучения, общими принципами работы рентгеновского аппарата, рентгенологической фотохимией, характеристикой рентгенодиагностики исследуемых органов, укладками для рентгенографического исследования отдельных анатомических областей, картиной в норме и при патологии.
За время практических занятий в рентгеновском кабинете каждый участник семинара обучается самостоятельно изготавливать рентгеновский снимок. Большая часть семинара посвящена развитию практических навыков - чтению рентгеновских снимков. На примере более чем 2000 снимков из архива Института Ветеринарной Биологии подробно описывается норма и патология скелетных структур, органов грудной клетки и органов брюшной полости.
По окончании курсов слушатели проходят тестовое занятие по комплексному чтению рентгеновских снимков и получают соответствующие сертификаты.
Курс рассчитан на слушателей с базовым ветеринарным образованием. Курсы пятидневные, с 11.00 до 17.00. Форма оплаты: безналичный расчет.
График проведения
2012 год: 1-5 октября, 26-30 ноября
2013 год: 21-25 января, 18-22 марта, 13-17 мая
«УЗИ-диагностика мелких домашних животных»
Семинар проводится совместно с НПП «Ра-текс» с 2006 года. Включает в себя теоретическую и практическую программы. В курсе теории слушатели знакомятся с общими принципами работы УЗ-аппаратов, датчиков, возможностями визуализации изображения внутренних органов брюшной полости, правилами укладки животных.
Отдельное занятие посвящено системам управления приборами УЗИ, правильному выбору настроек, созданию архивов и выдаче заключения.
За время проведения практических занятий каждый участник семинара обучается самостоятельно находить все органы брюшной полости, подлежащие визуализации, правильно их описывать, различать норму и патологию. Особое внимание уделяется развитию визуальных практических навыков - чтению эхограмм.
По окончании курсов слушатели проходят тестовое занятие и получают соответствующие сертификаты.
Базовый курс рассчитан на слушателей, начинающих обучение с нуля. Курсы пятидневные, с 11.00 до 17.00.
Для иногородних бронируется гостиница или общежитие. Форма оплаты: безналичный расчет.
График проведения
2012 год: 17-21 сентября, 15-19 октября, 12-16 ноября, 10-14 декабря
2013 год: 4-8 февраля, 4-8 марта, 1-5 апреля, 29 апреля - 3 мая, 27-31 мая
V
Для записи на семинары обращайтесь по тел. +7 921 095-89-27, (812) 927-55-92 Интересующие вас вопросы можно уточнить по электронной почте: invetbio@yandex.ru Вся информация о семинарах (график и место проведения, стоимость, программа занятий, отзывы слушателей) доступна на сайте: www.invetbio.spb.ru/seminars.html
J
