CC BY
18105.18.04 Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств (технические науки) DOI: 10.25712^Ш2072-8921.2019.02.009 УДК 637.055:637.3
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ
Т. Н. Орлова, И. А. Функ, Р. В. Дорофеев, Е. Ф. Отт, К. Е. Шевченко
Исследования проводились в лаборатории микробиологии молока и молочных продуктов отдела «Сибирский НИИ сыроделия» ФГБНУ ФАНЦА. Объектом исследования являлись вновь выделенные штаммы лактобактерий. В ходе селекционной работы применяли общепринятые и стандартные методы микробиологического анализа. Изучены морфолого-культуральные, физиолого-биохимические и технологически ценные свойства 25 штаммов молочнокислых бактерий, выделенных из объектов природного происхождения. Объектами для выделения молочнокислых бактерий было молоко натуральное коровье - сырьё и молоко козье сырое. Идентификация выделенных штаммов молочнокислых бактерий проводилась по ключевым свойствам, указанным в девятом издании «Определителя Берджи». По результатам проведённых исследований вновь выделенные штаммы молочнокислых бактерий были отнесены к Lactococcus 1ас^ ssp. На выделенные штаммы лактококков составлены паспорта. Вновь выделенные штаммы молочнокислых бактерий были включены в состав «Сибирской коллекции микроорганизмов» (СКМ) лаборатории микробиологии молока и молочных продуктов отдела СибНИИС ФГБНУ ФАНЦА как перспективные штаммы для включения в состав бактериальных заквасок при производстве ферментированных молочных продуктов.
Ключевые слова: молочнокислые бактерии, селекция лактококков, физиолого-биохимические свойства, органолептические показатели, технологически ценные свойства, терморезистентность, солеустойчивость, фагочувствительность, антибиотикоустойчи-вость, ферментированные молочные продукты.
Бактериальная закваска была и остаётся важным звеном формирования качества любой ферментированной молочной продукции. В качестве заквасочной микрофлоры используются разные штаммы и виды молочнокислых бактерий (лактококки, термофильный стрептококк, лактобациллы), бифидо- и пропи-оновокислые бактерии. Молочнокислые бактерии осуществляют трансформацию основных компонентов молока (лактоза, белки, жиры) во вкусовые, ароматические, биологически активные вещества, а также подавляют рост технически вредных микроорганизмов.
Выделение чистых культур молочнокислых бактерий является основой по созданию и поддержанию отраслевых коллекций микроорганизмов. Поиск конкурентоспособных заква-сочных бактериальных культур и в последующем разработка, изготовление бактериальных заквасок и бактериальных концентратов проводится в различных отечественных и зарубежных научно-исследовательских организациях [1, 2].
Молочнокислые бактерии, входящие в состав заквасок и бактериальных концентратов, позволяют получать ферментированные молочные продукты с разнообразными вкусовыми характеристиками, присущими определённому виду продукции. В большинство бактериальных заквасок и концентратов, исполь-
зуемых при производстве сыров, сметаны, творога, кислосливочного масла и других продуктов, включают мезофильные лактококки.
Процесс создания бактериальных заквасок трудоёмкий и включает следующие основные этапы работ: выделение микроорганизмов из различных источников, их изучение, отбор перспективных штаммов с производственно ценными свойствами и в дальнейшем подбор чистых культур в состав бактериальных заквасочных композиций.
При разработке новых бактериальных заквасок и концентратов проводится многоступенчатая работа по селекции молочнокислых бактерий с технологически ценными свойствами. Большая часть молочнокислых бактерий, выделяемых из природных источников, часто не удовлетворяют требованиям, предъявляемым к заквасочным штаммам, используемых в молочной промышленности. После определенного срока эксплуатации вновь выделенные штаммы могут утрачивать свои производственно ценные свойства, и в этом случае необходимо заменять неактивные штаммы на новые заквасочные микроорганизмы.
При подборе заквасочных микроорганизмов селекционеры учитывают фагоустой-чивость штаммов, так как в производственных условиях заквасочная микрофлора под-
вергается лизису бактериофагами. Активность молочнокислой микрофлоры является одним из главных условий получения ферментируемой молочной продукции высокого качества как по органолептическим показателям, так и по показателям безопасности. Причиной потери активности заквасок и неудачных выработок ферментированных молочных продуктов в 80-90 % случаев является поражение заквасочной микрофлоры бактериофагом. Фаголизис заквасочной микрофлоры приводит к нарушению молочнокислого процесса, в результате чего полученный продукт не соответствует качественным показателям и может быть небезопасным для потребителя [3, 4, 5].
Отраслевые коллекции микроорганизмов должны иметь определённый набор штаммов с идентичными свойствами для составления бактериальных композиций, которые будут в дальнейшем использоваться при ротации бактериальных заквасок на производстве.
Несмотря на имеющийся фонд коллекционных штаммов молочнокислых бактерий, активно используемых в промышленных целях, поиск новых штаммов мезофильных лак-тококков и пополнение коллекции вновь выделенными штаммами с технологически ценными свойствами для получения ферментированного молочного продукта с заданными характеристиками не утрачивает своей актуальности [6, 7, 8].
В лаборатории микробиологии молока и молочных продуктов отдела «Сибирский НИИ сыроделия» (СибНИИС) сформирована коллекция различных групп полезных микроорганизмов «Сибирская коллекция микроорганизмов» (СКМ) (лактококки, термофильный стрептококк, лейконостоки, лактобациллы, бифидобактерии, пропионовокислые бактерии). Эта коллекция создавалась несколько десятилетий трудом микробиологов Сибирского НИИ сыроделия (М. А. Алексеева, И. П. Анищенко, Я. Р. Каган, И. Я. Сергеева, Е. Ф. Отт), которые выделяли микроорганизмы из различных природных источников и получали новые штаммы путем селекции или путём обмена с другими отечественными или зарубежными научными организациями.
Для поддержания и пополнения СКМ необходимо постоянно проводить работы по выделению перспективных штаммов молочнокислых бактерий, которые в дальнейшем могут быть использованы для создания бактериальных заквасок и бактериальных концентратов при производстве ферментируемых молочных продуктов [9, 10].
Задачей проводимых исследований бы-
ло выделение перспективных штаммов лак-тококков для включения их в состав бактериальных заквасок, используемых при производстве ферментируемых молочных продуктов. Выделенные перспективные штаммы будут введены в состав «Сибирской коллекции микроорганизмов» лаборатории микробиологии молока и молочных продуктов отдела СибНИИС ФГБНУ ФАНЦА.
Объектами для выделения молочнокислых бактерий служили молоко натуральное коровье - сырьё и молоко козье сырое.
Выделение чистых культур лактококков проводили многократным пассажем в стерильное обезжиренное молоко с последующим культивированием при оптимальной для мезофильных лактококков температуре (30±1) оС. Идентификация выделенных штаммов проводилась по морфолого-культуральным и физиолого-биохимическим свойствам по показателям, указанным в «Определителе Берджи» [11].
Селекция мезофильных лактококков включала следующие этапы работ: отбор образцов, выделение чистых культур, исследование морфолого-культуральных и физиоло-го-биохимических свойств выделенных штаммов для проведения идентификации, тестирование штаммов по технологически ценным свойствам, составление паспортов на штаммы, включение перспективных штаммов мезофильных лактококков в состав СКМ.
В работе использовали стандартные и общепринятые методы микробиологического анализа [12, 13, 14].
Всего в ходе работы было выделено 100 штаммов. Выделенные культуры исследовали на способность образовывать сгусток на стерильном обезжиренном молоке в течение 24 часов при дозе инокулюма в размере одной бактериологической петли с образованием ровного плотного сгустка, на морфолого-культуральные (внешний вид колоний, микроскопический препарат) и на физиолого-биохимические свойства (окраска по Граму, каталазная активность, образование аммиака из аргинина, сбраживание цитрата кальция, сбраживание углеводов).
По результатам проведённых исследований для дальнейшей работы было отобрано 25 штаммов, которые по ключевым свойствам, согласно определю «Берджи», были отнесены к Lactococcus ¡actis ssp. Отобранные 25 штаммов лактококков были изучены по технологически ценным свойствам: активность кислотообразования, органолептиче-ские показатели, активность газо- и аромато-образования, солеустойчивость, терморези-
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ
стентность, антибиотикоустойчивость, фаго-устойчивость.
Одним из ключевых показателей молочнокислых бактерий является кислотообразующая активность, характеризующая сбраживание лактозы. Данный показатель у исследуемых штаммов оценивали по титруемой кислотности через 4 часа культивирования и времени образования сгустка при дозе ино-кулюма 5 % культуры. Большинство исследованных штаммов обладало хорошей кислотообразующей активностью. Через 4 часа культивирования 17 штаммов показали кислотность 44-61 оТ, а 8 штаммов - 33-42 оТ. Все штаммы (25) образовали сгусток в течение 6-8 часов и имели титруемую кислотность в пределах 71-100 оТ.
Органолептические показатели молочнокислых бактерий являются важным критерием при их подборе в состав бактериальных заквасок. По результатам дегустации выделенные штаммы характеризовались плотным сгустком, однородной консистенцией и чистым кисломолочным вкусом.
Исследования по определению способности выделенных штаммов к образованию углекислоты (газообразующая активность) и продуцированию диацетила и ацетоина (аро-матобразующая активность) показали, что из 25 выделенных штаммов один штамм дал положительные результаты по аромато- и газообразующей активности.
Устойчивость лактококков к разным концентрациям поваренной пищевой соли (% NaCl) наиболее актуальна при производстве сыров. Соль регулирует микробиологические, биохимические и физико-химические процессы во время выработки и созревания сыра и оказывает влияние на формирование вкуса и консистенции. Поэтому молочнокислые бактерии, входящие в состав бактериальных заквасок, должны быть тестированы на устойчивость к концентрации поваренной пищевой соли (% NaCl).
Исследуемые штаммы показали рост в питательной среде с содержанием NaCl 2 % и 4 %. Концентрация NaCl 6,5 % оказала ингиби-рующее влияние на рост тестируемых штаммов.
Способность микроорганизмов выдерживать высокую температуру в течение определённого времени играет важную роль при производстве сыров во время второго нагревания. Исследования показали, что все выделенные штаммы лактококков выдерживают нагревание при температуре 65 °С в течение 30 и 60 минут.
Молоко, поступающее на молокоперера-
батывающие предприятия, часто содержит ингибирующие вещества, в том числе антибиотики. Техническим регламентом Таможенного союза ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции» установлены допустимые уровни содержания антибиотиков в молоке и молочных продуктах [15, 16]. Большинство антибиотиков ингиби-руют рост молочнокислой заквасочной микрофлоры. По отношению к антибиотикам чувствительность молочнокислых бактерий может варьировать. Поэтому при подборе чистых культур в состав бактериальных заквасок необходимо учитывать их устойчивость по отношению к антибиотикам.
Выделенные штаммы исследовали на устойчивость к таким антибиотикам, как пенициллин, тетрациклин и стрептомицин.
По результатам исследований установлено, что к пенициллину в концентрации 0,004 мг/л устойчивы 18 штаммов лактокок-ков, слабоустойчивы 7 штаммов. К тетрациклину в концентрации 0,01 мг/л устойчивы 8 штаммов лактококков, слабоустойчивы 17 штаммов. К стрептомицину в концентрации 0,2 мг/л устойчивы 15 штаммов лактококков, остальные 10 штаммов отнесли к слабоустойчивым.
При селекции штаммов молочнокислых бактерий учитывается их фагочувствитель-ность. Определение устойчивости выделенных штаммов к бактериофагам проводили при совместном культивировании исследуемых штаммов и бактериофагов (из коллекции СКМ лаборатории микробиологии) в бульоне из гидролизованного молока. Результаты оценивали по наличию или отсутствию роста исследуемой культуры.
Для оценки степени фагочувствительно-сти штаммов использовали показатель - индекс фагочувствительности (ИФ) - это отношение количества фагов, лизирующих штамм, к общему количеству использованных фагов [17]. По индексу фагочувствительности выделенные штаммы лактококков были отнесены: к слабочувствительным 18 штаммов (ИФ 0-0,3), среднечувствительным 7 штаммов (ИФ 0,31-0,7).
По результатам проведённых исследований на 25 выделенных штаммов лактокок-ков были составлены паспорта с указанием морфолого-культуральных, физиолого-
биохимических и технологически ценных показателей. Данные штаммы введены в состав «Сибирской коллекции микроорганизмов» и поддерживаются перевивками на питательные среды.
Однако со временем выделенные микро-
организмы при хранении и перевивках могут утратить технологически ценные свойства. Поэтому работу по выделению новых штаммов молочнокислых бактерий для поддержания коллекции СКМ следует продолжать.
Выделенные штаммы лактококков обязательно должны пройти генетический анализ на видовую принадлежность для возможного включения их в состав бактериальных заквасок.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ганина, В. И. Производство заквасок в России / В. И. Ганина, С. А. Фильчакова // Переработка молока. - 2018. - №3. - С. 38-41.
2. Бояринева, И. В. Криоконсервирование бактериального концентрата симбиотической закваски для хлебопекарного производства / И. В. Бояринева, И. С. Хамагаева, А. С. Столярова, Ю. Г. Калужских // Ползуновский вестник. - 2016. - №3. - С. 13-17.
3. Гудков, А. В. Сыроделие: технологические, биологические и физико-химические аспекты / Под ред. С. А. Гудкова, 2-е изд., испр. и доп. - М: ДеЛи принт, 2003. - 800 с.
4. Szczepanska, A. K. Biodiversity of Lactococcus lacyis bacteriophages in Polish dary environment / A. K. Szczepanska, M. S. Hej nowicz, P. Kolakowski ets. // Acta Biochimica polonica. - 2007. - Vol. 54 (1). - P. 151-158.
5. Moineau, S. Control of bacteriophages in industrial fermentation / S. Moineau, C. levesque // Bacteriophages: biology and applications. - CRC Press, BocaRaton, Fla, - 2005. - P. 286-296.
6. Каган, Я. Р. Каталог бактериальных препаратов и заквасок, реализуемых в РФ на рынке ингредиентов, необходимых при производстве сыров / Я. Р. Каган, А. Н. Иркитова - Барнаул: ГНУ Сиб-НИИС Россельхозакадемии, 2010. - 84 с.
7. Орлова, Т. Н. Выделение молочнокислых бактерий из объектов природного происхождения и отбор среди них штаммов, наиболее перспективных для создания бактериальных заквасок и концентратов / Т. Н. Орлова, А. Н. Иркитова // Сб. ст. конф.: «Биотехнология и общество в XXI веке». - Барнаул: Изд-во АлтГУ. - 2015. - С. 232-235.
8. Орлова, Т. Н. Изучение молочнокислых бактерий, выделенных из природных источников / Т. Н. Орлова, Р. В. Дорофеев, Г. С. Мещерякова // Сыроделие и маслоделие. - 2018. - № 2. - С. 36-37.
9. Соловьёва, И. В. Изучение биологических свойств новых штаммов рода Lactobacillus. Общая биология / И. В. Соловьёва, А. Г. Точилина, Н. А. Новикова // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. - 2010. - № 2 (2). -С. 462-468.
10. Бахнова, Н. В. Заквасочные культуры для производства сыров и кисломолочных продуктов / Н. В. Бахнова // Переработка молока. - 2012. -№ 2. - С. 36-38.
11. Bergey's manual of systematic bacteriology. Second edition. Volume three. The Firmicutes - Springer Science+Business Media, LLC, 233 Spring Street, New York, NY 10013, USA. - 2009. - 1422 р.
12. МУ ВНИИМС 01.86.02.-89 Методические указания по селекции молочнокислых бактерий в состав заквасок и препаратов для мелких сычужных сыров. - Углич: ВНИИМС, 1989. - 87 с.
13. МР 2.3.2.2327-08 Методические рекомендации по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности (с атласом значимых микроорганизмов). - Углич: ГНУ ВНИИМС, 2008. - 243 с.
14. Банникова, Л. А. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности / Л. А. Банникова - М.: Пищевая промышленность, 1975. - 255 с.
15. Определитель бактерий Берджи - 9-е изд. В 2 т. - М.: «Мир», 1997. - 800 с.
16. ТР ТС 033/2013. Технический регламент Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции»- Принят решением Совета Евразийской экономической комиссии от 9 октября 2013. - №67. - 71 с.
17. Ганина, В. И. Перспектива использования генетических методов в прогнозировании биотехнологических свойств молочнокислых бактерий / В. И. Ганина, А. М. Шалыгина, Т. А. Горина [и др.] // Известия ВУЗов. Пищевая технология. - №4-5 -1997. - С. 19-21.
Лаборатория микробиологии молока и молочных продуктов отдела СибНИИС ФГБНУ ФАНЦА, г. Барнаул, ул. Советской армии, д. 66:
Орлова Татьяна Николаевна, научный сотрудник, аспирант АГАУ e-mail: orlova_tn_92@mail.ru.
Функ Ирина Андреевна, младший научный сотрудник, аспирант АГАУ, e-mail: funk. irishka@mail. ru.
Дорофеев Роман Викторович, к.с.-х.н., старший научный сотрудник, e-mail: romandorof@yandex.ru.
Отт Екатерина Фёдоровна, к.б.н., старший научный сотрудник, e-mail: Katya. ott.49@mail.ru.
Шевченко Кристина Евгеньевна, инженер, e-mail: kristina.shevchenko.95@list.ru.
