ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ПЕПТИДОВ ТРИПСИНОВОГО ГИДРОЛИЗАТА МОЛОЗИВА КОРОВ С ОЦЕНКОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

Тихонов С.Л.; Тихонова Н.В.; Поповских А.Д.; Тихонова М.С.

УДК 615.35

DOI 10.29141/2500-1922-2022-7-4-10 EDN SPQPLN

Выделение и характеристика индивидуальных пептидов трипсинового гидролизата молозива коров с оценкой биологической активности

С.Л. Тихонов1 Н.В. Тихонова1, А.Д. Поповских1, М.С. Тихонова2

1Уральский государственный экономический университет, г. Екатеринбург, Российская Федерация 2Уральский государственный медицинский университет, г. Екатеринбург, Российская Федерация

Реферат

Исследования посвящены анализу пептидов трипсинового гидролизата молозива коров. Выделено семь индивидуальных пептидов: TT1, TT2, TT3, T(1), T1.1, T1.2, mpT. Методом масс-спектрометрии определена молекулярная масса пептидов и аминокислотная последовательность в пептидной цепи. Для идентификации пептидов использована международная база данных Protein NCBI. Пептид mpT содержит в своем составе наибольшее количество аминокислот - 49. Пептид T1.2 имеет сходство с мем-браноактивным пептидом BAMA Bos taurus, что открывает перспективы его использования в составе противобактериальных средств или в качестве переносчика БАВ. Наибольшей концентрацией (2,04 мг/мл) в гидролизате молозива характеризуется пептид TT1, состоящий из 17 аминокислот и сходный с пептидом NCI_CGAP_Brn23 клон кДНК Homo sapiens, который похож на TR: 035085 ARX HOMEOPROTEIN. Родственным пептиду Т(1) является белок гомеобокс, содержащий ген развития PRD-по-добного класса. Этот ген у человека располагается в Х-хромосоме и участвует в развитии центральной нервной системы и поджелудочной железы. По результатам исследований из гидролизата молозива коров выделены пептиды, некоторые из них идентифицированы, однако биологическая роль большинства установленных пептидов малоизучена, а безопасность не доказана. В связи с этим проведены исследования по оценке цитотоксичности гидролизата методом Neutral Red Assay на клеточной линии HEK293 при 24-часовой инкубации. Цитотоксичность при первом, втором и третьем измерениях в концентрации 0,1 мг/мл составила: -3,3; -1,0 и 0,20; в концентрации 0,3 мг/мл: -1,3; -3,5 и -8,7; при 0,5 мг/мл: -2,6; -0,6 и 0,4. Результаты свидетельствуют об отсутствии токсичности. Исследована антимикробная и противогрибковая активность гидролизата. Гидролизат молозива коров проявляет антимикробную активность в отношении бактерий E. coliи B. subtilisи противогрибковую активность в отношении C. albicans. Результаты демонстрируют, что пептиды имеют клиническое значение и могут служить матрицей для разработки противоинфекционного препарата.

Для цитирования: Тихонов С.Л., Тихонова Н.В., Поповских А.Д., Тихонова М.С. Выделение и характеристика индивидуальных пептидов трипсинового гидролизата молозива коров с оценкой биологической активности//Индустрия питания|Food Industry. 2022. Т. 7, № 4. С. 83-94. DOI: 10.29141/2500-1922-2022-7-4-10. EDN: SPQPLN.

Дата поступления статьи: 11 июля 2022 г.

Н [email protected]

Ключевые слова:

молозиво коров;

ферментативный

гидролизат;

пептиды;

трипсин;

антимикробная

активность;

противогрибковая

активность;

цитотоксичность;

молекулярная масса

Individual Peptides Extraction and Characteristics of Cow Colostrum Trypsin Hydrolysate with Biological Activity Assessment

Sergey L. Tikhonov1 Natalia V. Tikhonova1, Angelika D. Popovskikh1, Maria S. Tikhonova2

1Ural State University of Economics, Ekaterinburg, Russian Federation 2Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russian Federation IS [email protected]

Keywords:

colostrum;

enzymatic hydrolyzate;

peptides;

trypsin;

antimicrobial activity; antifungal activity; cytotoxicity; molecular mass

Abstract

The research concerned the trypsin peptides analysis of colostrum hydrolyzate. The authors isolated seven individual peptides: TT1, TT2, TT3, T(1), T1.1, T1.2, mpT. They determined the molecular weight of the peptides and the amino acid sequence in the peptide chain by mass spectrometry; peptides - using the international database Protein NCBI. The mpT peptide contains the largest number of amino acids - 49. The T1.2 peptide is similar to the membrane-active peptide BAMA Bos taurus, which opens prospects for its use as a part of antibacterial agents or as a BAS carrier. In colostrum hydrolyzate the T1 peptide has the T highest concentration (2.04 mg/ml). It consists of 17 amino acids and matches the peptide NCI_CGAP_Brn23 cDNA Homo sapiens clone, which is similar to TR: 035085 ARX HOMEOPROTEIN. The homeobox protein containing the development gene of a PRD-like class is related to the T(1) peptide. This gene in humans is located on the X chromosome and is involved in the central nervous system and pancreas development. According to the results, the researchers isolated peptides from colostrum hydrolyzate, and identified some of them. Still a man understudies the biological role of most of the determined peptides, and has not proved its safety. In this regard, the study aimed at assessing the hydrolyzate cytotoxicity using the Neutral Red Assay method on the HEK293 cell line during a 24-hour incubation. Cytotoxicity in the first, second and third measurements at a concentration of 0.1 mg/ml was: -3.3; -1.0 and 0.20; at a concentration of 0.3 mg/ml: -1.3; -3.5 and -8.7; at 0.5 mg/ml: -2.6; -0.6 and 0.4. The results indicate no toxicity. The authors studied the antimicrobial and antifungal hydrolyzate activity. Colostrum hydrolyzate demonstrates antimicrobial activity against E. coliand B. subtilis bacteria and antifungal activity against C. albicans. The results assert that the peptides are of clinical importance and can serve as a template for the anti-infective drug development.

For citation: Sergey L. Tikhonov, Natalia V. Tikhonova, Angelika D. Popovskikh, Maria S. Tikhonova. Individual Peptides Extraction and Characteristics of Cow Colostrum Trypsin Hydrolysate with Biological Activity Assessment. Индустрия питания|Food Industry. 2022. Vol. 7, No. 4. Pp. 83-94. DOI: 10.29141/2500-1922-2022-7-4-10. EDN: SPQPLN.

Paper submitted: July 11, 2022

Введение

Пептиды - это фрагменты белков, которые выполняют биологические функции. Они действуют как сигнальные объекты во всех сферах жизни и участвуют в межбелковых взаимодействиях, необходимых для протекания биопроцессов. Короткие пептиды содержат фундаментальную молекулярную информацию. Они вызвали значительный интерес благодаря своим уникальным свойствам и большим перспективам в области инновационной биотерапии. Пептидные «лекарства» изначально играли только роль гормональных аналогов для устранения нару-

шений баланса. В настоящее время они решают многочисленные биомедицинские задачи, могут проникать через мембраны или достигать внутриклеточных мишеней. Роль пептидов в биопроцессах вряд ли могут выполнять другие химические вещества. Исследование пептидов развивается в следующих направлениях: SWOT-анализ коротких пептидов, их актуальность в терапии различных заболеваний, совершенствование платформ (био)синтеза, передовые наносупрамолекулярные технологии, ап-тамеры, измененные пептидные лиганды и ме-

тодологии in silico для преодоления ограничений пептидов, современные интеллектуальные биофункциональные материалы. Обсуждаются функциональные материалы, вакцины и целевые системы доставки лекарств/генов [1].

Ряд пептидов уже доступны на рынке, в частности, одобренный FDA полимиксин B-колли-стин-коломицин (пролекарство) и даптомицин (кубицин). Внедрение антимикробных пептидов продемонстрировало их активность против грамположительных и грамотрицательных бактерий, простейших, грибков, вирусов, в частности ВИЧ [2].

Авторы [3] разработали пегилированные пептиды (соединения нативной молекулы лекарственного препарата с полиэтиленгликолем (ПЭГ)) на основе пептида N6 и изучили влияние пегилирования различной длины модификаций ПЭГП (n = 2; 6; 12 и 24) на токсичность, стабильность, механизм, распределение, а также на антибактериальные/противовоспалительные свойства in vitro и in vivo. Результаты показали, что пегилированный пептид N6 на С-конце (n = 2, N6-COOH-miniPEG) значительно улучшил протеоли-тическую стабильность. N6-COOH-miniPEG более эффективно связывался с липополисахаридами и дольше удерживался in vivo, чем N6; при этом он сохранял противовоспалительную активность исходного пептида N6. N6-COOH-miniPEG показал несколько более низкую эффективность у мышей, чем N6. Пегилирование N6 способствует разработке эффективных противовоспалительных и антибактериальных пегилированных пептидов для клинического применения.

Авторы [4] собрали рубцовую эукариотическую метатранскриптомную библиотеку новых антимикробных пептидов (AMP) с использованием вычислительных методов, а затем охарактеризовали терапевтический потенциал AMP, идентифицировали в общей сложности 208 потенциально новых AMP из рубцового эукариотома и охарактеризовали один из них, а именно лю-белизин. Любелизин (GIVAWFWRLAR) представляет собой a-спиральный пептид длиной 11 аминокислот с теоретической молекулярной массой 1373,76 Да. В присутствии любелизина штаммы S. aureus (MRSA) USA300 и EMRSA-15, устойчивые к метициллину, были уничтожены в течение 30 мин после воздействия. Цитотоксичность лю-белизина в отношении эритроцитов человека и овцы была низкой, что обусловило терапевтический индекс 0,43. Анализы проницаемости мембран с использованием йодида пропидия наряду с просвечивающей электронной микроскопией показали, что повреждение цитоплаз-матической мембраны может способствовать антимикробной активности любелизина.

Авторами [5] по ингибирующей активности в отношении ВИЧ были идентифицированы пептиды Cap18 и Cap11, дополнительно исследована антибактериальная активность путем определения их кинетики, а также цитотоксич-ности. Бактерицидное действие отмечено у двух AMP при минимально ингибирующей концентрации 12,5 мкг/мл для K. pneumoniae (ATCC 700603) и 6,25 мкг/мл для P. aeruginosa (ATCC 22108). Пептиды предотвращали рост бактерий в течение нескольких часов после обработки. Кроме того, цитотоксическая активность этих двух пептидов была значительно низкой даже при их концентрации 100 мкг/мл. Эти результаты показали, что пептиды Cap18 и Cap11 обладают большим потенциалом в качестве антибактериальных препаратов или могут служить ведущими соединениями при разработке терапевтических схем для лечения заболеваний, вызванных устойчивыми к антибиотикам бактериями.

База данных антимикробных пептидов содержит 7 007 уникальных последовательностей и 759 структур и предназначена для систематического установления всесторонних ассоциаций между последовательностями AMP и структурами через структурные складки, обеспечения легкого доступа для просмотра их взаимосвязей. Обнаружено 30 различных кластеров структурной складки AMP с более чем одной структурой, около тысячи AMP связаны по меньшей мере с одним кластером структурной складки [6].

Одним из перспективных направлений использования пептидов является диагностика различных инфекций. Авторами [7] изучен потенциал пептида AB1-HLys-DOTA для визуализации и определения инфекции, вызванной грамположи-тельными и грамотрицательными бактериями. Пептид AB1-HLys-DOTA отличается более высокой специфичностью от пептида HLys-DOTA. Исследования показали более высокое поглощение в клетках бактерий S. aureus in vitro и улучшенное накопление в месте заражения мышей, инокули-рованных S. aureus, по сравнению с нековалентно нацеленным 64Cu-HLys-DOTA, помеченным радиоактивным изотопом 64Cu. Поглощение дозы 64Cu-AB1-HLys-DOTA на инфицированном участке было различимо уже через 1 ч после введения, что указывает на высокий потенциал пептида AB1-HLys-DOTA для быстрого выявления инфекции.

Пептиды получают в результате органического синтеза методом твердофазного синтеза с использованием растворителей, а идентифицируют масс-спектрометрией путем определения молекулярной массы. Однако метод органического синтеза является трудоемким и дорогостоящим. Кроме того, пептиды можно получить микроволновой экстракцией из самых разнообразных

природных ресурсов, содержащих белок [8]. Также для выделения пептидов применяется химический гидролиз белков, предполагающий расщепление пептидных связей кислотой или щелочью [9]. Ферментативная модификация белков с использованием отборных протеолити-ческих ферментных препаратов для расщепления специфических пептидных связей широко применяется в пищевой и фармацевтической промышленности [10]. В данной работе для гидролиза ферментов нами использован трипсин, рекомендованный для гидролиза белков с целью получения пептидных цепей [11].

Для выделения биологически активных пептидов рекомендуется использовать ткани и биожидкости животных с высоким содержанием белка и фармакологически активных компонентов. К одному из таких источников пептидов относится молозиво коров.

Молозиво - это сложная биологическая жидкость, содержащая пептиды, иммунорегулиру-ющие соединения и факторы роста. Основные функции молозива заключаются в укреплении естественной защитной системы организма, модуляции иммунного ответа, балансировании кишечной микробиоты, усилении процессов роста и восстановления тканей. Несколько исследований и клинических испытаний, проведенных как in vitro, так и in vivo на людях и животных, свидетельствуют о клинической пользе биологически активных добавок из коровьего молозива при желудочно-кишечных заболеваниях. Авторы [12] заявляют о безопасности молозива, поскольку нет противопоказаний в отношении высоких доз и не сообщается о побочных эффектах. Несмотря на обнадеживающие результаты, необходимы дальнейшие хорошо продуманные исследования, чтобы подтвердить биологические эффекты молозива, дозу и продолжительность лечения.

Целью настоящего исследования является выделение и характеристика индивидуальных пептидов трипсинового гидролизата молозива коров с оценкой их цитотоксичности, антимикробной и противогрибковой активности.

Для достижения поставленной цели поставлены следующие задачи:

• выделить пептиды трипсинового гидролиза-та молозива коров, установить их концентрацию и определить аминокислотную последовательность, молекулярную массу;

• идентифицировать выделенные пептиды с использованием базы данных Protein NCBI и дать характеристику их биологической активности;

• определить токсичность ферментативного гидролизата молозива коров на клетках HEK293;

• дать оценку антимикробной и противогрибковой активности ферментативного гидролизата молозива коров.

Объекты и методы исследования

Ферментативный гидролизат молозива коров растворяли в 10 % растворе щелочи методом препаративной хроматографии на силикагеле, элюент PBS и EtOH в изократическом соотношении 9:1. Выделенные пептидные фракции исследовали на масс-спектрометре MALDI-TOF, расшифровку проводили с помощью базы данных Mascot, опция Peptide Fingerprint (Matrix Science, США), с использованием базы данных Protein NCBI.

Для изучения общей цитотоксичности клетки HEK293 выращивали на среде DMEM, содержащей 10 % FBS и 1 % PS, и высевали в 96-луноч-ный планшет в концентрации 5-104 клеток/мл. К клеткам добавляли исследуемый гидролизат в концентрациях от 0,1 до 0,5 мкг/мл и инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 ч. Далее культуральную среду удаляли, лунки очищали промывочным раствором. Затем в лунки добавляли 150 мкл однократного красителя Neutral Red и инкубировали в течение 2 ч. По истечении времени инкубации окрашивающий раствор удаляли, клетки очищали промывочным раствором. После этого в каждую лунку добавляли 150 мкл раствора Neutral Red Staining и инкубировали еще 2 ч. Далее клетки снова обрабатывали промывочным раствором и добавляли 150 мкл со-любилизирующего раствора с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем измеряли оптическую плотность при длине волны 540 нм.

Цитотоксичность в процентах вычисляли по формуле (№онт] - ^опыт]) / [ODraJ * 100 %, где ODkoht - оптическая плотность контрольного образца; ODo^-r - оптическая плотность опытного образца.

Антимикробные и противогрибковые свойства гидролизата изучали диско-диффузионным методом. В качестве тест-штаммов выбраны Escherichia coli - условно-патогенная бактерия, вызывающая гастроэнтерит у животных и человека, и грамположительные бактерии Bacillus subtilis и C. albicans.

Культивирование штаммов проводили на плотной питательной среде LB (агар - 1,5 %, трип-тон - 1 %, дрожжевой экстракт - 0,5 %, NaCl - 1 %) и жидкой питательной среде LB (триптон - 1 %, дрожжевой экстракт - 0,5 %, NaCl - 1 %) при температуре 37 °C.

Диско-диффузионный метод определения антимикробной активности гидролизатов заключался в следующем. Тест-штамм высевали на агаризованную питательную среду газоном, одновременно на газон помещали гидролизат. В качестве контроля использовали бумажный диск с питательной средой, в качестве препара-

та сравнения - диск с антибиотиком канамици-ном и противогрибковым средством флукона-золом (из стандартного набора). Чашки Петри инкубировали при температуре, соответствующей оптимальной температуре роста каждого тест-штамма микроорганизма, в течение (24 ± 0,5) ч. Результаты учитывались по наличию и размеру (мм) прозрачной зоны отсутствия роста микроорганизмов и грибков вокруг диска.

Результаты исследований и их обсуждение

В трипсиновом гидролизате молозива коров выделено семь индивидуальных пептидов (табл. 1).

Выделенные пептиды различаются количеством и сочетанием аминокислот в цепи. Наибольшее количество аминокислот (49) насчитывается в пептиде mpT, который относится к полипептидам и, согласно базе данных Protein NCBI, аналогичен пептиду С0950255 protein Sus scrofa, функции которого не исследованы. Пептид T1.2 имеет молекулярную массу 15 кДа, состоит из 28 аминокислот, имеет сходство с пептидом BAMA Bos taurus и согласно данным, представленным в работе [13], обладает способностью проникать во внешнюю мембрану грамотрица-тельных бактерий. Этот процесс опосредуется мультибелковым комплексом (BamA), состоящим из незаменимого р-ствола OMP BamA и четырех липопротеинов (BamBCDE). BamA является центральным компонентом механизма сборки бета-ствола (P-barrel assembly machinery, BAM) и состоит из встроенного в мембрану р-ствола и

периплазматического домена с пятью мотивами, связанными с полипептидной транслокацией (POTRA), которые, как считается, взаимодействуют с вспомогательными липопротеинами [14]. Длина BamA в его расширенной конформации предполагает, что пептид может соединять внутреннюю и внешнюю мембраны через периплаз-матическое пространство. В бактерии Escherichia coli комплекс BAM необходим для сборки и вставки белков внешней мембраны [15].

Следовательно, T1.2 относится к мембраноак-тивным пептидам, способным проникать в клетку, которые могут использованы в качестве антибактериальных средств или выступать в качестве переносчиков биологически активных веществ в клетки-мишени [16].

Выделенный пептид T1.1 имеет большую молекулярную массу (22 кДа) в сравнении с другими пептидами гидролизата молозива и состоит из 28 аминокислот, как и пептид T1.2. Согласно базе данных Protein NCBI, пептид Т1.1 идентифицируется как POSSUM_01-POSSUM-C-EMBRYO-2KB Trichosurus vulpécula, функции которого не изучены.

Пептид T(1) сходен с пептидом DG9-ovary Canis familiaris, функции которого также не изучены.

При исследовании ферментативного гидроли-зата выделен пептид TT3, который состоит из девяти аминокислот и, соответственно, относится к коротким; функции указанного пептида не исследованы. Пептид ТТ2 с низкой молекулярной массой 6,5 кДа в сравнении с другими пептидами ферментативного гидролизата молозива

Таблица 1. Индивидуальные пептиды, содержащиеся в трипсиновом гидролизате молозива коров Table 1. Individual Peptides Contained in Trypsin Colostrum Hydrolyzate

Пептид Концентрация, мг/мл Последовательность аминокислот* Молекулярная масса, кДа Идентификация и функция пептида по базе данных Protein NCBI

NCI_CGAP_Brn23 клон кДНК Homo

TT1 2,04 EGKSPRQ CLK SR G RK GY (17) 8,4 sapiens, похож на TR: 035085 ARX HOMEOPROTEIN

TT2 1,59 PK CD YKRRS GP ALR TAK (17) 6,5 Подобный пептид не найден

TT3 1,б1 LARKTSK IK (9) 13,0

T(1) 1,95 SQ KKKN CP NGTRIRVPGP GP (20) 16 DG9-ovary Canis familiaris

T1.1 1,60 STKRHR M HAC SWR GP LKALSNPRAE FRR (28) 22 POSSUM_01-POSSUM-C-EMBRYO-2 KB Trichosurus vulpecula

T1.2 1,94 IK GS K EKLRGL KSKSF VR LFG_DLL QMGL (28) 15 BAMA Bos taurus

M H N NE TN S AS NT V NHTV TPF

mpT 1,44 K IS SH KHIRTR TK KNEGKA GT ILS TALT R (49) 18 CO950255 protein Sus scrofa

Примечание. * Аминокислоты, выделенные в полипептидной цепи: А - аланин, С - цистеин, D - аспарагиновая кислота, Е - глутаминовая кислота, F - фенилаланин, G - глицин, Н - гистидин, I - изолейцин, К - лизин, L - лейцин, М - метионин, N - аспарагин, Р - пролин, Q - глутамин, R - аргинин, S - серин, Т - треонин, V - валин, W - триптофан, Y - тирозин.

коров состоит из 17 аминокислот и относится к полипептидам, его функции также не установлены. Наибольшей концентрацией (2,04 мг/мл) в гидролизате молозива характеризуется пептид TT1, состоящий из 17 аминокислот и сходный с пептидом NCI_CGAP_Brn23 клон кДНК Homo sapiens - он похож на TR: 035085 ARX HOMEOPROTEIN согласно данным, представленным в работе [17]. Указанный пептид ARX принадлежит к большому семейству гомеопро-теинов и характеризуется С-концевым доменом без аристалла и октапептидным доменом вблизи N-конца. На ранних стадиях развития пептид ARX экспрессируется в значительной доле нейронов в коре головного мозга, полосатом ядре, ганглионарных бугорках, а также в спинном мозге. У взрослого человека экспрессия ARX присутствует и ограничена областями, богатыми ГАМК-ергическими нейронами, такими как миндалина и обонятельная луковица. Возможная роль ARX в этом типе нейронов дополнительно подтверждается экспрессией ARX в подмножестве ГАМК-ергических интернейронов в молодых и зрелых первичных культурах кортикальных нейрональных клеток, а также in vivo.

Родственным пептиду Т(1) является белок го-меобокс, содержащий ген, экспрессирующийся в процессе развития. Экспрессируемый белок содержит два консервативных домена: С-пептид (или домен без аристалина) и гомеобоксовый домен PRD-подобного класса. Он входит в семейство белков группы II, члены которого экс-прессируются в основном в центральной и (или) периферической нервной системе. Этот ген у человека располагается в Х-хромосоме (рис. 1) и участвует в развитии ЦНС и поджелудочной железы [18].

8 9 10111213141516171819202122 X YMT

Рис. 1. Расположение гена, содержащегося в белке, родственном пептиду Т(1), в Х-хромосоме человека Fig. 1. Layout of the Gene Contained in a Protein Related to the T (1) Peptide in the Human X Chromosome

На рис. 2 представлена Х-хромосома человека с указанием расположения гена, содержащегося в белке, родственном пептиду Т(1).

Рис. 2. Х-хромосома человека с указанием расположения гена, содержащегося в белке, родственном пептиду Т (1) Fig. 2. X-Human Chromosome with the Layout Indication of the Gene Contained in the Protein Related to the T Peptide (1)

По данным [19] высокая плотность Агх+-ин-тернейронов коры уменьшает неврологические расстройствах.

На рис. 3-9 представлены масс-спектры образцов выделенных пептидов.

Рис. 3. Масс-спектр образца TT1 Fig. 3. Mass Spectrum of Sample TT1

Рис. 4. Масс-спектр образца TT2 Fig. 4. Mass Spectrum of Sample TT2

Рис. 5. Масс-спектр образца TT3 Fig. 5. Mass Spectrum of Sample TT3

Рис. 6. Масс-спектр образца mpT Fig. 6. Mass Spectrum of Sample mpT

Рис.7. Масс-спектр образца T1.1 Fig.7. Mass Spectrum of Sample T1.1

Рис. 8. Масс-спектр образца T1.2 Fig. 8. Mass Spectrum of Sample T1.2

Рис. 9. Масс-спектр образца T (1) Fig. 9. Mass Spectrum of Sample T (1)

По результатам исследований из гидролизата молозива коров выделены пептиды, некоторые из них идентифицированы, но вместе с тем биологическая роль большинства установленных пептидов малоизучена, а безопасность не доказана. В связи с этим проведены исследования по оценке цитотоксичности гидролизата методом Neutral Red Assay на клеточной линии HEK293 при 24-часовой инкубации (табл. 2).

Из табл. 2 следует, что цитотоксичность гидролизата при первом, втором и третьем измерениях в концентрации 0,1 мг/мл составила -3,3; -1,0 и 0,20; в концентрации 0,3 мг/мл: -1,3; -3,5

и -8,7; при 0,5 мг/мл: -2,6; -0,6 и 0,4. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии токсического влияния гидролизата на клеточные линии НЕК293. Следовательно, полученный трип-синовый гидролизат молозива коров, а также содержащиеся в нем пептиды нетоксичны.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Из выдвинутой гипотезы следует, что пептид Т1.2 относится к мембраноактивным пептидам, соответственно, может проявлять антимикробные и противогрибковые свойства. Далее была изучена противомикробная активность гидроли-зата (рис. 10).

Таблица 2. Цитотоксичность ферментативного гидролизата молозива коров при различных концентрациях методом Neutral Red Assay при 24-часовой инкубации Table 2. Enzymatic Colostrum Hydrolyzate Cytotoxicity at Various Concentrations by the Neutral Red Assay Method during 24 Hours of Incubation

Показатель Контроль, Концентрация гидролизата, мг/мл

мг/мл 0,1 0,3 0,5

Измерение 1 89 436 92 367 90 554 91 685

Измерение 2 85 682 86 470 88 678 85 232

Измерение 3 90 034 89 932 97 836 90 322

Цитотоксичность 1 - -3,30 -1,30 -2,60

Цитотоксичность 2 - -1,00 -3,50 0,60

Цитотоксичность 3 - 0,20 -8,70 -0,40

30 25 20 15 10 5 О

15

16

Гидролизат молозива коров

Контроль

Канамицин

Флуконазол

Е. coli АТСС 25922 Bacillus subtUis С. albicans

Рис. 10. Сравнительная антимикробная и противогрибковая активность гидролизата молозива коров Fig. 10. Comparative Antimicrobial and Antifungal Activity ofColostrum Hydrolyzate

Установлено, что гидролизат молозива коров проявляет антимикробную активность в отношении бактерий E. coli и B. subtilis (диаметр зоны лизиса бактерий составляет 15 и 12 мм соответственно). Следует отметить, что антимикробная активность гидролизата значительно ниже, чем антимикробная активность антибиотика кана-мицина (диаметр зоны лизиса 15 и 26 мм соответственно). Доказана противогрибковая активность гидролизата молозива коров в отношении C. albicans (диаметр зоны лизиса 16 мм; при использовании антигрибкового препарата «Флуконазол» - 5 мм). Полученные данные свидетельствуют о том, что в гидролизате присутствуют пептиды, обладающие противомикробными и противогрибковыми свойствами. Однако для доказательства выдвинутой гипотезы необходимо выделить указанные пептиды и исследовать их биологическую активность в отношении бактерий и грибов.

Научная новизна проведенных исследований заключается в том, что впервые установлен пептидный состав, на культурах клеток доказана безопасность применения, определены некоторые биологические функции (противомикроб-ная и антигрибковая активность) ферментативного гидролизата молозива, что представляет определенный интерес в связи с потенциальным промышленным использованием выделенных пептидов в качестве новых БАВ в составе продуктов питания функционального назначения и действующих начал в лекарственных препаратах.

Заключение

На основании исследований пептидного состава в трипсиновом гидролизате молозива коров выделено семь индивидуальных пептидов, определена их молекулярная масса и последовательность аминокислот, проведена идентификация некоторых пептидов и на основании литературных данных сделаны предположения о их возможной биологической активности. На клеточной линии HEK293 методом Neutral Red Assay доказана безопасность выделенных пептидов в составе гидролизата молозива коров. Диско-диффузным методом установлено, что полученный гидроли-зат молозива коров обладает противомикробной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибков на примере C. albicans. Полученные результаты демонстрируют, что пептиды имеют клиническое значение и являются шаблоном для разработки противоинфекционного препарата. Следует подчеркнуть, что это первые исследования пептидного состава и биологической активности гидролизата молозива коров, которые необходимо подтвердить дополнительными научными изысканиями, возможно, путем выделения индивидуальных пептидов и анализа их возможной эффективности при различных патологических процессах. Одним из направлений дальнейших исследований представляется тестирование пептидной активности на клинических штаммах, установление механизма действия антимикробных пептидов и тестирование пептидов in vivo для подтверждения их антибиотического потенциала.

Библиографический список

1. Apostolopoulos, V.; Bojarska, J.; Chai, T.-T., et al. A Global Review on Short Peptides: Frontiers and Perspectives. Molecules. 2021. Vol. 26. Iss. 2. Article Number: 430. DOI: https://doi.org/10.3390/mole-cules26020430.

Bibliography

1. Apostolopoulos, V.; Bojarska, J.; Chai, T.-T., et al. A Global Review on Short Peptides: Frontiers and Perspectives. Molecules. 2021. Vol. 26. Iss. 2. Article Number: 430. DOI: https://doi.org/10.3390/mole-cules26020430.

2. Wang, G.; Watson, K.M.; Peterkofsky, A., et al. Identification of Novel Human Immunodeficiency Virus Type 1-Inhibitory Peptides Based on the Antimicrobial Peptide Database. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2010. Vol. 54. Iss. 3. Pp. 1343-1346. DOI: https://doi.org/10.1128/aac.01448-09.

3. Li, T.; Yang, N.; Teng, D., et al. C-Terminal Mini-PEGylation of a Marine Peptide N6 Had Potent Antibacterial and Anti-Inflammatory Properties against Escherichia coli and Salmonella Strains In Vitro and In Vivo. BMC Microbiology. 2022. Vol. 22. Iss. 1. Article Number: 128. DOI: https://doi.org/10.1186/s12866-022-02534-w.

4. Onime, L.A.; Oyama, L.B.; Thomas, B.J., et al. The Rumen Eukary-otome Is a Source of Novel Antimicrobial Peptides with Therapeutic Potential. BMC Microbiology. 2021. Vol. 21. Iss. 1. Article Number: 105. DOI: https://doi.org/10.1186/s12866-021-02172-8.

5. Tincho, M.B.; Morris, T.; Meyer, M., et al. Antibacterial Activity of Rationally Designed Antimicrobial Peptides. International Journal of Microbiology. 2020. Vol. 2020. Article Number: 2131535. DOI: https://doi.org/10.1155/2020/2131535.

6. Lee, H.-T.; Lee, C.-C.; Yang, J.-R., et al. A Large-Scale Structural Classification of Antimicrobial Peptides. BioMed Research International. 2015. Vol. 2015. Article Number: 475062. DOI: https://doi. org/10.1155/2015/475062.

7. Aweda, T.A.; Muftuler, Z.F.B.; Massicano, A.V.F., et al. Radiolabeled Cationic Peptides for Targeted Imaging of Infection. Contrast Media & Molecular Imaging. 2019. Vol. 2019. Article Number: 3149249. DOI: https://doi.org/10.1155/2019/3149249.

8. Riss, T.L.; Moravec, R.A.; Niles, A.L., et al. Cell viability assays. In Markossian, S. (ed.). Assay Guidance Manual. Bethesda: Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, 2016. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/.

9. Lee, J.-W.; Jeffries, T.W. Efficiencies of Acid Catalysts in the Hydrolysis of Lignocellulosic Biomass over a Range of Combined Severity Factors. Bioresource Technology. 2011. Vol. 102. Iss. 10. Pp. 5884-5890. DOI: https://doi.org/10.1016/jj.biortech.2011.02.048.

10. Shteinfer-Kuzmine, A.; Amsalem, Z.; Arif, T., et al. Selective Induction of Cancer Cell Death by VDAC1-Based Peptides and Their Potential Use in Cancer Therapy. Molecular Oncology. 2018. Vol. 12. Iss. 7. Pp. 1077-1103. DOI: https://doi.org/10.1002/1878 -0261.12313.

11. Salampessy, J.; Reddy, N.; Kailasapathy, K., et al. Functional and Potential Therapeutic ACE-Inhibitory Peptides Derived from Bromelain Hydrolysis of Trevally Proteins. Journal of Functional Foods. 2015. Vol. 14. Pp. 716-725. DOI: https://doi.org/10.1016/jjff.2015.02.037.

12. Menchetti, L.; Traina, G.; Casagrande, P., et al. Bovine Colostrum Supplementation: Potential Benefits in Human and Animal Health. Journal of Biotechnology. 2014. Vol. 185. Pp. S85. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jbiotec.2014.07.293.

13. Gatzeva-Topalova, P.Z.; Warner, L.R.; Pardi, A., et al. Structure and Flexibility of the Complete Periplasmic Domain of BamA: The Protein Insertion Machine of the Outer Membrane. Structure. 2010. Vol. 18. Iss. 11. Pp. 1492-1501. DOI: https://doi.org/10.1016/jj. str.2010.08.012.

14. Jansen, K.B.; Baker, S.L.; Sousa, M.C. Crystal Structure of BamB Bound to a Periplasmic Domain Fragment of BamA, the Central Component of the ß-Barrel Assembly Machine. Journal of Biological Chemistry. 2015. Vol. 290. Iss. 4. Pp. 2126-2136. DOI: https://doi. org/10.1074/jbc.m114.584524.

15. Fleming, P.J.; Patel, D.S.; Wu, E.L., et al. BamA POTRA Domain Interacts with a Native Lipid Membrane Surface. Biophysical Journal. 2016. Vol. 110. Iss. 12. Pp. 2698-2709. DOI: https://doi.org/10.1016/j. bpj.2016.05.010.