CC BY
45
УДК 612.1:618.48
ВЫДЕЛЕНИЕ ФРАКЦИИ ЯДРОСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОК ИЗ ПУПОВИННОЙ КРОВИ - ВЫБОР МЕТОДА
Д.А. Иволгин 12, А.Б. Смолянинов 12 1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова,
Санкт-Петербург, Россия 2 Покровский банк стволовых клеток, Санкт-Петербург, Россия
ISOLATION OF NUCLEATED CELLS FRACTION FROM UMBILICAL CORD BLOOD - CHOICE OF METHOD
D.A. Ivolgin 12, A.B. Smolyaninov 1 2 1 North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia 2 Stem cell bank «Pokrovsky», Saint-Petersburg, Russia
© Д.А. Иволгин, А.Б. Смолянинов, 2014
Проведено сравнительное исследование эффективности выделения фракции ядросодержащих клеток из пуповинной крови методами двойного центрифугирования, полуавтоматической и автоматической сепарации. Полуавтоматическая и автоматическая системы сепарации эффективнее метода двойного центрифугирования по основным качественным показателям клеточного концентрата: общему количеству ядросодержащих клеток, выходу ядросодержащих клеток. Показано, что полуавтоматическая система выделения фракции ядросодержащих клеток требует наименьшее количество времени для обработки одного образца. На основании полученных данных такая система предложена как оптимальная при большом (более 5) ежедневном поступлении образцов пуповинной крови в банк пуповинной крови для обработки и хранения.
Ключевые слова: банк пуповинной крови, полуавтоматическая система сепарации, пуповинная кровь.
A comparative study of the effectiveness of nucleated cells fraction isolation from umbilical cord blood. The methods of double centrifugation, automatic and semi- automatic separation was compared. It was shown that semi-automatic and automatic processing methods were more efficient then the double centrifugation by cell concentrate quality key indicators: the total number of nucleated cells, nucleated cells recovery. Also, the semi-automatic nucleated cells fraction isolation method requires the least amount of time for a single sample processing. Based on these data such a system has been proposed as optimal for large (more than 5) cord blood samples daily admission into cord blood bank.
Key words: cord blood bank, semi-automatic separation system, the umbilical cord blood.
Пуповинная кровь (ПК) в настоящее время является одним из основных источников стволовых клеток для лечения различных заболеваний. Наряду с преимуществами, по сравнению с другими источниками стволовых клеток -костным мозгом и периферической кровью, ПК имеет недостатки, одним из которых является ограниченное количество ГСК в образце [1, 2]. Так как исход трансплантации во многом зависит от количества трансплантируемых клеток [3], существует необходимость максимального увеличения содержания клеток в трансплантируемом образце. Проводимые в банках ПК работы по повышению эффективности выделения ядросодержащих клеток (ЯК) могу значительно улучшить исходы трансплантации стволовых клеток ПК [4, 5].
Идея обработки (сокращения объема) ПК, помещаемой на длительное криохранение, принадлежит основателю первого общественного банка пуповинной крови (БПК) профессору П. Рубинштейну (1995), до этого на хранение помещалась необработанная ПК. Обработка или сокращение объема ПК преследовала следующие цели: сокращение места для хранения, а, следовательно, связанных с этим расходов; уменьшение количества вводимого в образец ПК криопротектора для снижения частоты проявлений побочных эффектов криопротек-тора при трансплантации. Первым подходом к сокращению объема образцов ПК стал метод двойного центрифугирования [6]. Данный метод и его модификации [7, 8] используются в настоящее время и остаются стандартом
для сравнения эффективности выделения фракции ЯК.
Следующим этапом совершенствования технологии обработки ПК стало появление так называемых полуавтоматических систем «top-and-bottom», используемых первоначально для фракционирования периферической крови [9]. Примерами таких систем могут быть «Optipress II» (Baxter, США) и Compomat G4 (Fresenius, Германия). На сегодняшний день данные системы активно используются для выделения фракции ЯК из ПК [10-13]. Эффективность метода оценивалась как в рамках технологических решений систем полуавтоматической сепарации [14], так и в сравнении с другими способами обработки ПК [15, 16]. Накопленный опыт свидетельствует о явных перспективах применения полуавтоматических систем [17], обеспечении высокого и стабильного выхода клеток ПК. Кроме того, использование полуавтоматических систем обработки ПК значительно снижает риск контаминации и повреждения контейнера с ПК [18].
Наряду с использованием полуавтоматических систем с 2000 года для обработки ПК стали использоваться полностью автоматические системы, такие как Sepax S-100 (Biosafe, Швейцария) [19,20]. При помощи такого клеточного сепаратора количество манипуляций, производимых с ПК, уменьшается по сравнению и с полуавтоматическими системами. Кроме этого, в таком аппарате существуют программы, позволяющие проводить выделение клеточного кон-
центрата из образца ПК малого объема, отмывание размороженного клеточного концентрата от криопротектора.
Существует и ряд других способов обработки ПК, однако широкого распространения они в настоящий момент не получили [21].
В таблице 1 приведены некоторые сравнительные данные эффективности различных методов обработки пуповинной крови.
Однако при организации деятельности банка ПК по обработке и хранению образцов ПК необходимо учитывать не только эффективность выделения фракции ЯК из ПК, но и ряд дополнительных факторов. К ним относятся затраты на приобретение оборудования и расходных материалов, а также количество времени на обработку одного образца ПК.
Цель исследования - сравнительная оценка различных технических приемов обработки ПК для организации деятельности лаборатории выделения стволовых клеток, обеспечивающих максимально высокий выход ЯК с учетом соотношения «затраты - эффективность».
Материалы и методы
Основу работы составил ретроспективный количественный и качественный анализ образцов ПК (п = 2898), собранных в родовспомога-ющих учреждениях Санкт-Петербурга, Ленинградской области и других городов Российской Федерации. Все образцы ПК доставлены, обработаны, заморожены и помещены на длительное
Таблица 1 [22]
Показатели эффективности различных методов обработки пуповинной крови
Технология n Выход ОЯК, % Выход CD34+,% Выход МНК, % Выход КОЕ, % Конечный объем Время обработки, мин
ГЭК [6] 390 90,7 98,1 98 20
ГЭК [23] 750 80,0±8,6 79,1±8,9 23,1±1,0
ГЭК [15] 350 74,7±8,2 105±25 102,5±81,1 55±10
П/а [18] 169 83,3±9,7 88,7±7,8 98,9±15,6 102,9±15,6 24,5±1,5 25
П/а [15] 325 78,7±7,8 89,5±23,0 92,6±27,8 25±5
Автомат [23] 750 87,6±10,0 87,7±9,7 22,9±0,8
Автомат [24] 691 82 19,6±0,8
Автомат [22] 1156 87,0±11,8 93,4±12,8 90,9±11,8 90,9±20,1 21,0±0,1 30
Фильтр [25] 12 73,9±13,9 80,8±16,3 81,7±27,0 80,8±27,7 27,4±2,2 11,3
Фильтр [26] 10 62,3±11,6 80,7±12,6 78,9±10,5 74,8±39,8 7,9±2,2
Среднее или среднее ± ОЯК - общее количество единицы.
стандартное отклонение; ГЭК - гидроксиэтилкрахмал; П/а - полуавтоматический метод; ядросодержащих клеток;МНК - мононуклеарные клетки; КОЕ - колониеобразующие
криохранение в НИЛ клеточных технологий Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова и Покровского банка стволовых клеток в рамках создания общественного хранилища ПК. Все образцы ПК были собраны как во время срочных родов, так и во время операции кесарева сечения.
Выделение стволовых клеток из образцов ПК осуществляли следующими способами:
I группа (n = 1797) - методом двойного центрифугирования [6] в модификации Американской ассоциации банков крови [27].
II группа (n = 1012) - с использованием автоматической системы «Sepax S100» («Biosafe», Швейцария).
III группа (n = 78) - с помощью полуавтоматической системы «MacoPress Smart» («MacoPharma», Франция).
a) Лабораторные методы исследования
В соответствии с международными стандартами заготовки ПК [8, 28] существуют обязательные исследования качественных показателей ПК в процессе её обработки. К ним относятся: определение общего количества ядро-содержащих клеток (ОЯК), количества CD34+ клеток и жизнеспособности клеток. В данной работе проводились исследования образцов ПК по следующим показателям:
- до начала обработки - определение ОЯК при помощи гематологического анализатора Coulter AcT diff 2 (Beckman Coulter, США)
- после обработки и перед замораживанием -определение ОЯК при помощи гематологического анализатора Coulter AcT diff 2 (Beckman Coulter, США), количества и жизнеспособности CD34+ клеток (на единицу объема и абсолютное) - с использованием проточного цитофлу-ориметра FC500 (Beckman Coulter, США) (программное обеспечение CXP с длиной волны лазерного излучения 488 нм, набор реагентов Stem-Kit (Beckman Coulter, США).
Выход ОЯК после обработки - рассчитывался в % от ОЯК до обработки,
b) Статистические методы
Статистическая обработка данных осуществлялась по параметрическим и непараметрическим (ненормальное распределение) статистическим методикам [29, 30]. Для определения нормальности распределения переменных проводился тест Колмогорова - Смирнова [31, 32]. Исходные данные ПК, обработанной затем тремя методами, представлены в виде M±m, где М - среднее арифметическое, m - стандартная ошибка среднего арифметического. Остальные данные представлены в виде медианы и размаха данных.
Статистический анализ проводился с использованием t-критерия Стъюдента, U-критерия Манна - Уитни. Критический уровень значимости был принят p<0,05. Применялся стандартный пакет прикладных программ Microsoft Office Excel 2003 для Windows 2003 версия 1.0, SPSS для Windows 2007 версия 19.
Результаты и их обсуждение
Исходные данные образцов пуповинной крови, которые затем были обработаны тремя методами, представлены в таблицах 2-4. Согласно результатам теста Колмогорова - Смирнова, исходные показатели ПК отвечали нормальному распределению (p двусторонняя = 0,72, 0,12 и 0,68 соответственно), и значения t-критерия, рассчитанные попарно в группах для объема ПК, количества ЯК/мл и ОЯК в образце ПК, позволяют говорить о том, что все три группы достоверно не различаются.
Результаты, полученные после обработки ПК с использованием метода двойного центрифугирования, полуавтоматического способа и автоматической системы, представлены в таблице 5.
Таблица 2
Исходные данные образцов пуповинной крови в группах, обработанных с применением различных методов (М±т)
№ гр. Метод обработки ПК Объем образца, мл ЯК, х106 клеток/мл ОЯК, х106 клеток
I Двойное центрифугирование (n =1797) 111,8±0,8 11,4±0,08 1286,4±13,4
II Автоматическая сепарация (n = 1012) 110,9±0,2 11,1±0,16 1235,8±23,2
t-критерий (p<0,05) 0,66 1,54 1,89
Таблица 3
Исходные данные образцов пуповинной крови в группах, обработанных с применением различных методов (M±m)
№ гр. Метод обработки ПК Объем образца, мл ЯК, х106 клеток/мл ОЯК, х106 клеток
I III Двойное центрифугирование (n = 1797) Полуавтоматическая сепарация (n =78) t-критерий (p<0,05) 111,8±0,8 111,1±0,4 0,78 11,4±0,08 11,2±0,08 1,82 1286,4±13,4 1266,6±18,9 1,97
Таблица 4 Исходные данные образцов пуповинной крови в группах, обработанных с применением различных методов (M±m)
№ Гр. Метод обработки ПК Объем образца, мл ЯК, х106 клеток/мл ОЯК, х106 клеток
II III Автоматическая сепарация (n = 1012) Полуавтоматическая сепарация (n =78) t-критерий (p<0,05) 110,9±0,2 111,1±0,4 0,82 11,1±0,16 11,2±0,08 1,98 1235,8±23,2 1266,6±18,9 1,73
Таблица 5
Показатели пуповинной крови, обработанной с использованием различных методов,
(медиана и размах)
№ Гр. Метод обработки ПК ЯК, х106 кл/мл ОЯК, х106 кл Выход ЯК от исходного количества (%) CD34+ х106 кл/мл ОК CD34+, х106 кл Жизнеспособность (%)
I Двойное центрифугирование (п =1797) 39,2** 2,5-93,1 860,0* 50,0-2000,0 73,04** 47,3-98,2 0,09 ** 0,002-0,31 1,95 0,05-6,6 98,6** 96,6-100,0
II Автоматическая сепарация (п = 1012) 43,3** 12,5-95,0 905,33* 247,1- 1950,0 81,9** 65,1-97,6 0,11** 0,005-0,4 2,1 0,09-7,5 99,2** 96,6-100,0
III Полуавтоматическая сепарация (п = 78) 42,3** 8,5-83,5 891,8* 669,0-1787,1 81,7** 61,7-94,4 0,1 0,003-0,4 1,9 0,07-6,8 99,1** 96,5-100,0
* - различия достоверны при сравнении группы I и группы II, группы I и группы III (p<0,05); ** - различия достоверны при сравнении группы I и группы II, группы I и группы III (p<0,001).
Установлено, что медиана значений ряда показателей в группах полуавтоматической обработки и автоматической сепарации превышает значения полученные при обработке ПК двойным центрифугированием. При сравнении трех групп непараметрическим методом с использованием критерия Манна - Уитни было выявлено достоверное различие в группах II, III и группе I для показателя «общее количество ядросодержащих клеток» (р<0,05), и для показателей «количество ЯК на единицу объема», «выход ядросодержащих клеток», «жизнеспособность» (р<0,001). Также количество CD34+ на единицу объема достоверно различалось в группах I и II (р<0,001). Достоверных различий в группах II и III выявлено не было. Кроме того, показатель количества CD34+ клеток на мил-
лилитр в группе III, по сравнению с группами I и II, достоверно не отличался. Для показателя «ОК CD34+ клеток» превышение медианы значений в группе автоматической сепарации по сравнению с остальными группами было статистически недостоверным. Полученные данные позволяют говорить о том, что на этапе выделения фракции ЯК из ПК методы полуавтоматической и автоматической сепарации эффективнее метода двойного центрифугирования, что подтверждается и данными литературы [23, 33].
Временные затраты на выделение фракции ядросодержащих клеток из одного образца ПК составили для метода двойного центрифугирования 27,25 мин, для автоматической обработки -54 мин и 25,7 мин для полуавтоматического метода.
При сравнении расходов (все цены даны по данным дистрибьюторов) - организация обработки ПК методом двойного центрифугирования требует приобретения рефрижераторной центрифуги - 780 тыс. рублей, и расходных материалов (контейнер для крови) из расчета 27 рублей на один образец. Для автоматической сепарации ПК необходимо приобретение системы Sepax S100 за 2,3 млн рублей и разовых систем для обработки из расчета 6150 руб. на один образец.
Для деятельности банка ПК выделение фракции ЯК их пуповинной крови является одним из наиболее важных для последующего применения этапов. Использование для обработки ПК полуавтоматических и автоматических систем позволяет повысить выделяемое количество ЯК. Выбор конкретного метода обработки ПК остается за банком и зависит от большого количества факторов: персонал, количество поступающих и обрабатываемых образцов ПК в день, финансирование и возможность закупки расходного имущества и обслуживания оборудования и пр. Так, например, исходя из полученных нами данных, при ежедневном поступлении и обработке 5 и более образцов пуповинной крови можно предложить систему полуавтоматической сепарации Macopress Smart (MacoPharma, France) как эффективную и требующую минимальных затрат времени для обработки одного образца пуповинной крови. Кроме того, при сравнимой с автоматическим методом обработки ПК эффективности, расходы на внедрение метода полуавтоматической сепарации составляют 1,3 млн рублей на приобретение аппарата и 1650 рублей для обработки одного образца ПК (все цены даны по данным дистрибьюторов).
Заключение
Представленные результаты сравнительной оценки основных способов выделения фракций ядросодержащих клеток ПК по критерию «затраты - эффективность» могут быть учтены при организации деятельности банков пу-повинной крови. Дальнейшие исследования эффективности основных способов выделения фракции ЯК на гораздо большем количестве образцов ПК, и особенно экономической составляющей (себестоимости процедур обработки ПК различными методами), смогут помочь в организации деятельности банков пу-повинной крови.
Литература
1. Factors associated with outcomes of unrelated cord blood transplant: Guidelines for donor choice / E. Gluckman [et al.] // Experimental Hematology. - 2004. - Vol. 32, № 4. - P. 397-407.
2. Unrelated donor hematopoietic cell transplantation: marrow or umbilical cord blood? / S.S. Grewal [et al.] // Blood. - 2003. - Vol. 101, № 11. - P. 4233-4244.
3. Gluckman, E. Ten years of cord blood transplantation: from bench to bedside / E. Gluckman // British Journal of Haematology. -
2009. - Vol. 147, № 2. - P. 192-199.
4. Barker, J.N. Umbilical cord blood transplantation for the treatment of cancer/ J.N. Barker, J. E. Wagner // Nature Reviews Cancer. - 2003. - Vol. 3, № 7. - P. 526-532.
5. Barker, J.N. Optimizing Unrelated Donor Cord Blood Transplantation / J.N. Barker, V. Rocha, A.Scaradavou // Biol. Blood Marrow Transplant. - 2009. - Vol.15, № 1 Suppl. -P. 154-161.
6. Processing and cryopreservation of placental/ umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution / P. Rubinstein [et al.] // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. - 1995. - Vol. 92, № 22. -P. 10119-10122.
7. A simple and reliable procedure for cord blood banking, processing, and freezing: St Louis and Ohio Cord Blood Bank experiences / J.M. Alonso [et al.] // Cytotherapy. - 2001. - Vol. 3, №6. -Р. 429-433.
8. Standarts for Cellular Therapy Product Services. 5th edition / AABB. - Bethesda,
2010. - 126 p.
9. The Bottom and Top System: A New Technique for Blood Component Preparation and Storage / C. F. Högman [et al.] // Vox Sanguinis. - 1988. -Vol. 55, № 4. - P. 211-217.
10. Umbilical cord blood collection and separation for haematopoietic progenitor cell banking / J.A. Ademokun [et al.] // Bone Marrow Transplantation. - 1997. - Vol. 19, № 10. -P. 1023-1028.
11. The London Cord Blood Bank: analysis of banking and transplantation outcome / S. Davey [et al.] // British Journal of Haematology. -2004. - Vol.125, № 3. - P. 358-365.
12. Development of a district Cord Blood Bank: a model for cord blood banking in the National Health Service / C. Donaldson [et al.] // Bone Marrow Transplantation. - 2000. - Vol. 25, № 8. - P. 899-905.
13. Umbilical cord blood processing with the Optipress II blood extractor / M.I. Godinho [et al.] // Cytotherapy. - 2000. - Vol. 2, № 6. - P. 439-443.
14. Automated separation of cord blood units in top and bottom bags using the Compomat G4 / P. Solves [et al.] // Clin Lab Haematol. - 2006. -Vol. 28, № 3. - P. 202-207.
15. Red blood cell depletion with a semiautoma-ted system or hydroxyethyl starch sedimentation for routine cord blood banking: a comparative study / P. Solves [et al.] // Transfusion. - 2005. -Vol. 45, № 6. - P. 867-873.
16. Inhibition of CD26 peptidase activity significantly improves engraftment of retrovirally transduced hematopoietic progenitors / C. Tian [et al.] // Gene Therap. - 2006. - Vol. 13, № 7. -P. 652-658.
17. Ten-year quality control of a semiautomated procedure of cord blood unit volume reduction / L. Lecchi [et al.] // Transfusion. - 2008. - Vol. 49, №3. - P. 563-569.
18. Cord blood banking: volume reduction of cord blood units using a semi-automated closed system / S. Armitage [et al.] // Bone Marrow Transplantation. - 1999. - Vol. 23, № 5. - P. 505-509.
19. A strategy of splitting individual high volume cord blood units into two half subunits prior to processing increases the recovery of cells and facilitates ex vivo expansion of the infused haematopoietic progenitor cells in adults / A.C. Papassavas [et al.] // Int J Lab Hematol. -
2008. - Vol. 30, № 2. - P. 124-132.
20. Fully automated and reproducible cord blood processing using the Biosafe Sepax and Coolmix Devices / K.Theunissen [et al.] // Abstracts of ASN Conference, San-Diego, 2003.
21. A simple filtration system for red blood cell depletion and volume reduction in routine processing of human umbilical cord blood / S.O. Sowemimo-Coker [et al.] // Vox Sanguinis. -
2009. - Vol. 96, № 2. - P. 138-145.
22. Armitage, S. Cord Blood Processing: Volume Reduction / S. Armitage // Cell preservation technology. - 2006. - Vol. 4, № 1. - P. 9-16.
23. Highly efficient and reproducible cord blood banking using the Biosafe Sepax and Coolmix
Devices / K. Theunissen [et al.] // Abstracts of 10th Annual Meeting of the International Society of Cellular Therapy. - Ireland, Dublin, 2004.
24. Querol, S. An automated and closed procedure for cord blood processing, freezing and thawing: the Barcelona cord blood bank experience [Abstract] // 30th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplanation. Barcelona, Spain / S. Querol [et al.]. - March, 2004.
25. Yasutake, M. Stem cell collection filter system for human placental/umbilical cord blood processing / M. Yasutake [et al.] // Vox Sang. -2001. - № 80. - Р. 101-105.
26. Eichler, H. Engraftment capacity of umbilical cord blood cells processed by either whole blood preparation or filtration / H. Eichler [et al.]// Stem Cells. - 2003. - № 21. - Р. 208-216.
27. McKenna, D.H. Umbilical cord blood / D.H. McKenna [et al.] // Core Principles in cellular therapy / ed. by J.D. Roback [et al.] // AABB; Bethesda, 2008. - Chapter 3. - P. 47-72.
28. Cryopreservation of umbilical cord blood with a novel freezing solution that mimics intracellular ionic composition / I.B. Nicoud [et al.] // Transfusion. - 2012. - Vol. 52, № 9. -P. 2055-2062.
29. Орлов, А.И. Непараметрическое точечное и интервальное оценивание характеристик распределения / А.И. Орлов // Заводская лаборатория. - 2004. - Т. 70, № 5. - С. 65-70.
30. Холлендер, М. Непараметрические методы статистики : пер. с англ. / М. Холлендер, Д. Вульф. -М. : Финансы и статистика, 1983. - 518 с.
31. Вероятность и математическая статистика. Энциклопедия / гл. ред. Ю.В. Прохоров. - М. : Большая Российская Энциклопедия, 1999. - 910 с.
32. Власов, В.В. Введение в доказательную медицину / В.В. Власов. - М. : МедиаСфера, 2001. - 392 с.
33. Cord blood volume reduction using an automated system (Sepax) vs. a semi-automated system (Optipress II) and a manual method (hydroxyethyl starch sedimentation) for routine cord blood banking: a comparative study / Lapierre V. [et al.] // Cytotherapy. - 2007. - Vol. 9, № 2. -Р. 165-169.
Д.А. Иволгин
Тел.: 8-965-063-23-03
e-mail: ida59m@mail.ru
