CC BY
105
удк
ВЫДЕЛЕНИЕ И ПОДГОТОВКА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ К ТРАНСПЛАНТАЦИИ
О.Г. Хурцилава 1, Д.А. Иволгин 13, К.В. Коровина3, А.С. Хрупина 13,
А.Б. Смолянинов 13, Е.А. Селиванов2 1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова,
Санкт-Петербург, Россия 2 ФГУ РосНИИГТ ФМБА РФ, Санкт-Петербург, Россия 3 Покровский банк стволовых клеток, Санкт-Петербург, Россия
HUMAN UMBILICAL STEM CELLS PROCESSING AND PREPARETION FOR TRANPLANTATION
O.G. Hurtsilava 1, D.A. Ivolgin 13, X.V. Korovina3, A.S. Khrupina 13,
A.B. Smolyaninov 13, E.A. Selivanov 2 1 North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia
2 FSO Hematology and Transfusiology Research Institute FMBA RF, Saint-Petersburg, Russia 3 Pokrovski Stem cell Bank, Saint-Petersburg, Russia
© Коллектив авторов, 2012
В данной работе изучены изменения качественных показателей 85 образцов пуповинной крови в процессе обработки для выделения концентрата ядросодержащих клеток при размораживании и отмывке от криопротектора. Установлено, что метод сепарации пуповинной крови и метод отмывки пуповинной крови от криопротектора после размораживания с использованием автоматической системы обеспечивает наилучшие качественные показатели образца пуповинной крови. Также не была выявлена связь жизнеспособности CD 34/45+ клеток с показателями гематокрита.
Ключевые слова: криоконсервация, гемопоэтические стволовые клетки, обработка
пуповинной крови, диметилсульфоксид, Sepax S-100.
In this study changes of quality characteristics of 85 umbilical cord blood units during processing for obtaining a nuclear cells concentrate, thawing and washing of cryoprotector were studied. It was established that method of umbilical cord blood separation and a method of cells washing with the help of automated system provides the best quality characteristics of umbilical cord blood units. It was also establish that haematocrit volume doesn’t affect the viability of CD 34/45+ cells.
Key words: cryopreservation, human umbilical cord blood processing, haemopoietic stem cells, dimethylsulphoxide, Sepax S-100 automated system.
Введение
Пуповинная кровь (ПК) была использована для лечения более 14 000 пациентов с различными заболеваниями - как злокачественными, так и незлокачественными. Эта особенность основана, прежде всего, на том, что ПК содержит гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) и гемопоэтические клетки-предшественники (ГКП), которые могут замещать систему крови должным образом подготовленного (кондиционированного) пациента. Начало большому количеству исследований, подтверждающих, что ПК может быть потенциальным источником пригодных для трансплантации ГСК/ ГКП, положила успешная трансплантация ПК, осуществленная 6 октября 1988 г. [7].
Криоконсервация традиционно применяемых источников (ГСК/ГПК) - костного мозга
и периферической крови - для терапевтического использования проводится более 30 лет, тот же метод применяется и для длительного хранения ПК. Оптимальная криоконсервация и получение жизнеспособных ГСК/ГПК (определяемая по потенциалу приживления (энграфтмента)) зависит от ряда параметров, включающих:
1) время перевозки и температуру хранения после сбора;
2) обработку перед криохранением;
3) выбранный криопротектор;
4) скорость, температуру и протоколы замораживания и размораживания;
5) температуру длительного хранения [23].
Рассмотрим эти параметры более подробно,
тем более что единой точки зрения на оптимум криоконсервации пока нет.
1. Время перевозки и температура хранения после сбора.
По данным A. Hubel et al. [10], на жизнеспособность клеток ПК, оцениваемую после размораживания, не оказывало влияние хранение и транспортировка её в течение 24 часов после сбора.
В исследовании, посвященном оценке влияния места сбора, отсрочки обработки ПК, эффекту криоконсервации на прогениторные клетки ПК (Shlebak A. et al., 1999), было выявлено что:
- значимых различий в общем количестве ядросодержащих клеток (ОЯК), мононуклеар-ных клеток (МНК), колониеобразующих единиц-гранулоцитарно-макрофагальных (КОЕ-ГМ) или колониеобразующей единицы-эритроцитов (КОЕ-Э) в образцах, взятых из вен пуповины или вен основания плаценты, не было;
- хранение ПК при комнатной температуре или при +4°C более 9 часов приводит к значимому сокращению количества прогениторных клеток и их жизнеспособности;
- криоконсервация как после программируемого замораживания, так и после пассивного замораживания незначительно сокращала количество МНК, жизнеспособность и выживание КОЕ-ГМ, а потенциал КОЕ-ГМ продуцировать вторичные колонии значимо сокращался после криконсервации (P = 0,04) [22].
2. Обработка перед криохранением.
На сегодняшний день достаточных данных о влиянии способа обработки пуповинной крови на количественные и качественные показатели ГСК/ГПК пуповинной крови нет, этот аспект оптимизации процедуры криоконсервации нуждается в дальнейшем изучении.
3. Выбор криопротектора.
В 1959 г. в качестве криопротектора для ГСК/ ГПК был предложен и получил широкое распространение в протоколах криоконсервации диметилсульфоксид (ДМСО) [14]. В настоящее время различия в протоколах использования ДМСО как криопротектора представляют собой применение его в разных концентрациях с целью максимально снизить количество токсических эффектов и осмотического стресса.
Исследуя влияние концентрации ДМСО, скорости его добавления и удаления, было подтверждено заключение об оптимальной для ПК концентрации ДМСО - 10% [11].
4. Скорость, температура и протоколы замораживания и размораживания.
Одним из первых протоколов криоконсервации и размораживания пуповинной крови, по-
лучивших широкое распространение, стал метод Нью-Йоркского центра крови [20], в котором образцы пуповинной крови после добавления 10% ДМСО пассивно охлаждались до -50°С и затем помещались в жидкую фракцию азота для хранения. Размораживание проводилось в водяной бане при +37°С, затем клетки отмывались в растворе 2,5% альбумина и 5% декстрана, центрифугировались и ресуспендировались.
С развитием оборудования для замораживания и появлением т. н. замораживателей с программируемой скоростью протоколы замораживания также претерпели изменения. Появилась возможность составлять программы замораживания - примером может служить протокол Университета Миннесоты [10]. В ряде исследований была показана эффективность программного замораживания. Так, например, в исследовании T.P. Meyer et al. [15] после криоконсервации на программном замораживателе наблюдалась высокая жизнеспособность (89%), количество CD34+ клеток (89%) и КОЕ (88%).
5. Температура длительного хранения.
Около 10 лет назад стали появляться работы по оценке влияния на стволовые клетки длительного хранения в замороженном виде. Так, исследование длительного криохранения стволовых клеток КМ и периферической крови показало, что ГСК остаются пригодными для трансплантации после 14 лет криохранения. В конце прошлого века оценка количества КОЕ-ГМ, КОЕ-Э и колониеобразующих единиц гранулоцитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ) в ПК после 12 лет хранения, а также построенная линейная модель (логарифм результатов жизнеспособности клеток) показали, что ПК может храниться длительное время без существенной потери ГПК [16].
При помощи исследований пролиферативной способности и способности к самовоспроиз-водству КОЕ-ГМ, КОЕ-Э и КОЕ-ГЭММ, а также оценки ex vivo экспансии и инфузии NOD/ SCID мышам CD34+ клеток, выделенных из размороженных образцов ПК, было продемонстрировано отсутствие отрицательного эффекта длительного криохранения, по последним данным, в течение 23,5 лет [2] на количественные и качественные показатели ГСК/ГПК.
Сейчас уже существуют и данные о клиническом применении ПК после длительного криохранения, в которых показано, что применение «старых», т.е. хранившихся 8 и более лет, образцов ПК не снижает итоговую выживаемость после трансплантации ПК по сравнению со
«свежими» образцами ПК [21]. Длительность криохранения не коррелирует с худшими показателями итоговой выживаемости, бессобытийной выживаемости, трансплантат-ассоциированной смертности, рецидива или приживления.
В нашей работе мы суммируем опыт Покровского банка стволовых клеток - НИЛ клеточных технологий СЗГМУ им. И.И. Мечникова по выделению ГСК/ГПК из ПК, размораживанию и отмывке клеток от ДМСО различными способами для того, чтобы разработать оптимальные для наших условий протоколы обработки, криоконсервирования и подготовки ГСК/ГПК ПК к трансплантации.
Материалы и методы исследования
Основу работы составил:
а) ретроспективный количественный и качественный анализ образцов ПК, собранных в родовспомогающих учреждениях Санкт-Петербурга, Ленинградской области и других городов Российской Федерации. Все образцы ПК доставлены, обработаны, заморожены и помещены на длительное криохранение в ОРДПК НИЛ клеточных технологий Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова и Покровского банка стволовых клеток в период с 2009 по 2012 гг. в рамках создания общественного хранилища ПК (n = 2809);
б) количественный и качественный анализ размороженных различными способами образцов ПК, находящихся на длительном криохранении в ОРДПК НИЛ клеточных технологий Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова и Покровского банка стволовых клеток (n = 85). (срок криохранения - 7,0±0,42 мес.).
Перед замораживанием выделение лейкоцитарной фракции проводилось на клеточном сепараторе Sepax S100 («Biosafe», Швейцария) Kit CS-530 (группа I; n = 30 образцов), и методом двойного центрифугирования на центрифуге Rotanta 460 RS («Hettich», Германия) (группа II; n = 55 образцов). Все образцы замораживались по одной методике: введения расчетного количества 10% раствора ДМСО («Pall», Великобритания) (расчет проводился по формуле:
V = 0,25 х V
лф’
где Vк - объем криопротектора, а Vлф - объем лейкоцитарной фракции.
Замораживание концентрата осуществлялось в программируемом замораживателе Сгуо
560-16 (Planer, Великобритания) по следующей схеме (Hubel A. et al., 2003, модифицированный [10]):
Стартовая температура - 4°С - удерживается в течение 10 минут;
- далее образец охлаждается со скоростью 10С/мин до -120С;
- далее образец охлаждается со скоростью 200С/мин до -600С;
- далее образец нагревается со скоростью 100С/мин до -180С;
- далее образец охлаждается со скоростью 10С/мин до -600С;
- и в конце образец охлаждается со скоростью 30С/мин. до -1000С.
Затем все размороженные образцы обрабатывали (отмывали от криопротектора - 10% раствора ДМСО («Pall», Великобритания)) методом простого центрифугирования (технология Нью-Йоркского центра крови) [7] (подгруппа 1; n = 21 образец), с помощью клеточного сепаратора Sepax S100 («Biosafe», Швейцария) на Kit CS-600 (группа 2; n = 14 образцов) и методом разведения (группа 3; n = 50 образцов).
Во всех образцах определялось ОЯК, абсолютное количество CD34+/CD45+ клеток и жизнеспособность в концентрате лейкоцитарной фракции до замораживания, после размораживания и отмывки клеток от криопротектора. Также определялись показатели выхода (recovery) CD34+/CD45+ клеток, ЯК и жизнеспособности по формуле:
Y /Yf х 100, где Y - показатели после размораживания и отмывки; Ypf - показатели до замораживания.
При отмывке ручным методом образцы ПК размораживалсь при 37°С на водяной бане в течение 5 мин. Непосредственно после размораживания на водяной бане ПК из криопакета шприцом переносилась в стерильный двойной пакет, заполненный раствором альбумина (2,5% раствор) на физиологическом растворе, затем пакет центрифугировался при 400 g в течение 10 мин. Супернатант удалялся, а осажденные клетки ресуспендировались в растворе альбумина. Все процедуры проводились в воздушном потоке ламинарного бокса Herasafe KS 12 («Heraeus», Германия).
Во втором случае размораживание образцов ПК проводилось аналогично на водяной бане при 37°С, но для отмывки клеток от криопротектора использовался набор для аппаратной отмывки CS-600 («Biosafe», Швейцария). Отмывочным
буфером в данном случае также являлся 10% раствор альбумина на физиологическом растворе.
При методе разведения также использовался 10% раствор альбумина в соотношении 1:4.
После размораживания и отмывки от криопротектора концентрата лейкоцитарной взвеси проводился подсчет ОЯК при помощи гематологического анализатора ACT diff 2 («Beckman Culter», США), и количества и жизнеспособности CD34/45+ клеток на проточном цитометре Cytomix FC500 («Beckman Coulter», США). Определение количества клеток CD 34+/45+ осуществляли с помощью набора Stem-Kit («Beckman Coulter», США).
Пробоподготовку проводили стандартным образом согласно рекомендации производителя.
Измерение проводили на проточном цитометре Cytomix FC500 («Beckman Coulter», США) с использованием программы CXP.
Статистическая обработка данных осуществлялась по непараметрическим статистическим методикам. Результаты представлены в виде медианы и размаха данных. Статистический анализ полученных данных проводился с пакета прикладных программ Microsoft Office Excel 2003 для Windows 2003 версия 1.0, IBM® SPSS® Statistics версия 19.0 .
Результаты и их обсуждение
При выделении ГСК/ГПК из ПК способом автоматической сепарации и двойного центрифугирования были получены следующие результаты (табл. 1).
Таблица 1
Показатели концентрата ядросодержащих клеток пуповинной крови при выделении различными способами до замораживания (медиана + размах)
№ группы Метод обработки ПК , » g * х § ОЯК, х106 кл Выход ЯК от исходного количества (%) CD34+, х106 кл/мл ОК CD34+, х106 кл Жизне- способность (%) Гематокрит
I Двойное центрифугирование (п =1797) * * CN СО 860,0* 73,04** * * о 0 1,95 98,6** 41,7
2,52-93,1 50,0-2000,0 47,3-98,2 0,002-0,31 0,05-6,65 96,6-100,0 7,30-65,8
II Автоматическая сепарация аппаратом Sepax S100(п=1012) 43,35** 905,33* 81,88** 0,11** 2,1 99,23** 30,9
12,5-95,0 247,1-1950,0 65,1-97,6 0,005-0,375 0,09-7,5 96,6-100,0 12,6-56,4
Примечание: * - различия достоверны в сравнении с группой II (р < 0,05); ** - различия достоверны в сравнении с группой II (р < 0,001).
Таблица 2
Изменение показателей ядросодержащих клеток в концентрате пуповинной крови при выделении различными способами после размораживания
(медиана и размах)
№ группы Метод обработки ПК ЯК, х106 кл/мл ОК ЯК, х106 кл Выход ЯК от ДЗ, (%) CD34+, х106 кл/мл ОК CD34+, х106 кл Выход CD34+ кл Жизне- способность, (%)
I Двойное центрифугирование (п = 55) 37,8 858,0 82,1* 0,1 2,25 85,27** 82,7*
(14,32-70,5) (406,2-1531) (63,77-91,32) (0,2-0,32) (0,58-7,6) (67,4-98,7) (55,6-98,82)
II Автоматическая сепарация (п = 30) 38,5 977,5 91,7 0,115 2,27 91,34 89,3
(13,7-78,2) (343,25-1919,6) (81,9-99,6) (0,001-0,26) (0,02-5,7) (71,7-110,9) (78,7-98,47)
Р - - < 0,001 - - 0,018 < 0,001
Примечание: * - различия достоверны в сравнении с группой II (р < 0,001); ** - различия достоверны в сравнении с группой II (р < 0,05).
Изменение показателей клеточного концентрата, выделенного из пуповинной крови различными способами после размораживания представлен в таблице 2.
При сравнении обеих групп непараметрическим методом с использованием критерия Манна - Уитни было выявлено достоверное различие для показателя «ОЯК» (р < 0,05) и для остальных показателей (р < 0,001). Для показателя «ОК CD34+ клеток» превышение медианы значений в группе автоматической сепарации было статистически недостоверным. Полученные данные позволяют говорить о том, что на этапе выделения фракции ЯК из ПК метод автоматической сепарации Sepax 8100 эффективнее метода двойного центрифугирования, что подтверждается данными литературы [25, 12], и показывают, что по всем общепринятым показателям качества ПК метод автоматической сепарации эффективнее стандартной методики двойного центрифугирования.
Кроме того, показатели размороженного концентрата, выделенного автоматическим способом, в частности выход ОЯК, выход CD34+ клеток, жизнеспособность, также соответствуют данным литературы [19] и достоверно превышают показатели концентрата, размороженного после выделения методом центрифугирования.
В целом полученные данные позволяют говорить о более высокой эффективности выделения клеточного концентрата при помощи автоматической системы сепарации клеток по сравнению с методом двойного центрифугирования.
Кроме того, выделение клеточного концентрата из пуповинной крови с использованием системы Зерах 8100 позволяет получить клеточный концентрат с лучшими показателями после размораживания и отмывания от криопротектора. Однако полученные нами данные по изменениям показателей клеточного концентрата после размораживания и подготовке к трансплантации не учитывали метод размораживания и отмывания клеточного концентрата от криопротектора. С целью определения влияния методов подготовки к трансплантации на показатели образцов клеточного концентрата мы сравнили показатели без учета метода выделения клеточного концентрата (табл. 3).
Эти данные свидетельствуют о преимуществе подготовки клеточного концентрата к трансплантации методом размораживания без отмывания от криопротектора по показателю (содержание ЯК в миллилитре ПК). Также видно, что процент жизнеспособных клеток, отмытых от ДМСО с использованием автоматической системы Зерах З100, достоверно превышает таковой при размораживании без отмывания от криопротектора.
Полученные нами данные не дают однозначного ответа о преимуществе того или иного способа размораживания и отмывания клеточного концентрата от криопротектора. Для выявления взаимосвязей методов выделения клеточного концентрата из пуповинной крови и методов его подготовки к трансплантации, а также влияния этих методов на показатели размороженного
Таблица 3
Показатели количества ядросодержащих клеток концентрата пуповинной крови после размораживания и отмывки различными способами (медиана и размах)
№ группы Метод отмывания от криопротектора ЯК, х106 кл/мл ОЯК, х106 кл Выход ЯК от ДЗ, (%) CD34+, х106 кл/ мл ОК CD34+, х106 кл Выход CD34+ кл Жизне- способность (%) Выход жизне- способности (%) 87,57
1 Центрифугирование (п = 21) 29,9* 717,6 83,8 0,1 5 2 ,2 8 86,43
(13,5-46,8) (326,9-1528,1) (64,9-101,0) (0,001-0,3) (0,03-8,3) (77,5-101,8) (67,47-95,93) (75,8-98,83)
2 При помощи Зерах З100 (п = 14) ,5 ОО 3 872,0 ,6 ОО 8 0,11 2,2 90,1 88,41* 8 6
(23,3-73,5) (600-1469,0) (67,4-97,7) (0-0,14) (0,02-2,9) (72,9-98,1) (75,2-96,96) (76,07-97,35)
3 Без отмывания (п = 50) 42,1 955,5 8 9 0,11 2,4 87,8 83,75 86,88
(14,1-75,1) (403,9-1703,25) (72,1-95,2) (0,02-0,3) (0,52-6,6) (64,6-107,2) (56,1-98,82) (65,0-101,8)
р 0,013 0,041 - - - - 0,042 -
Примечание: * - различия достоверны в сравнении с группой 3 (р < 0,05).
клеточного концентрата необходимы дополнительные исследования и использование дополнительных методов статистического анализа.
Также нами проводилось исследования воздействия эритроцитов, оставшихся в концентрате ЯК после выделения на жизнеспособность CD34/45+ клеток. Для этого проводился корреляционный анализ влияния гематокрита в образцах до криоконсервации на показатели размороженного клеточного концентрата. Гематокрит в образцах ПК составил 38,16±1,5%. В соответствии с нашими данными (рис.), величина гематокрита не оказывает выраженного действия на выход и жизнеспособность CD34/45+ клеток (коэффициент корреляции -0,101 и -0,143 соответственно), что, скорее, подтверждает данные R. Chow [5].
Успешное приживление при трансплантации ПК в значительной степени зависит от сбора адекватного количества гемопоэтических прогениторных клеток с последующей успешной криконсервацией этих клеток без серьезных потерь в жизнеспособности и количестве.
120
100
Я 80
о 60
*40
20
R2 = 0,0103
ч * ч>*
^----------------г*
> ♦ •
• ♦ ♦
10
20
30 40
Гематокрит
50
60
70
R2 = 0,0025
120
100
80
60
J 40 20 0
10
20
30 40 50
Гематокрит
60
70
Зависимость выхода и жизнеспособности СОЭ4/45+ клеток в пуповинной крови после размораживания от величины гематокрита до криоконсервации
Исходя из этого, критерии криоконсервации, разработанные для стволовых клеток периферической крови и КМ, разработанные зачастую эмпирически, неприменимы для ПК. В первую очередь, это связано с большой разницей в количестве клеток между трансплантатом КМ, при котором потеря до 50% стволовых клеток не является критичной, и ПК, где потеря даже 10% может оказаться фатальной.
Сегодня все больше говорится о том, что одним из способов улучшения исходов трансплантации ПК является улучшение качества образцов ПК, помещаемых для длительного криохранения в общественные банки ПК. То есть, каждый этап банкирования ПК, особенно такие критичные, как выделение ЯК, криохранение и подготовка к трансплантации, требуют особенного внимания.
В отношении обработки пуповинной крови перед криоконсервацией до недавнего времени ни у кого не вызывала сомнения предложенная P. Rubinstein et al. (1985) необходимость сокращения объема собранной ПК, то есть удаление плазмы и большей части эритроцитарной массы для оптимизации хранилища, уменьшения количества криопротектора [20]. Также считается, что оставшиеся эритроциты, разрушающиеся в процессе криоконсервации, снижают жизнеспособность ГСК/ГПК [18]. Однако появившиеся недавно данные показали, что удаление из ПК только плазмы значительно увеличивает количество ядросодержащих клеток (ЯК) в образце ПК до и после размораживания без серьезного влияния на качественные показатели [16].
Также нельзя не упомянуть о влиянии на качество образца пуповинной крови и на исход собственно трансплантации наиболее часто используемого криопротектора. Способность ДМСО вызывать токсические эффекты известна. Исследования на животных моделях показали дозозависимое сосудосуживающее действие ДМСО [3,4]. Также описаны и токсические явления при использовании ДМСО у людей. Такие явления развиваются во время реинфу-зии криоконсервированных клеток. Наиболее частые побочные эффекты, такие как тошнота, рвота и колики в животе, наблюдаются практически у 50% пациентов [28] и, как считается, возникают из-за вагусного ответа, вызываемого внутривенной инфузией холодной жидкости.
Были также сообщения о сердечнососудистых и респираторных нарушених, таких как гипотензия и брадикардия, или, гораздо реже, гипертензия и тахикардия, фатальная
0
0
0
аритмия, остановка дыхания и диффузное альвеолярное кровотечение. Некоторые центры описывали случаи токсического действия на нервную систему, такие как обратимая лейко-энцефалопатия, эпилептические припадки и инсульт. Кроме того, сообщалось также и о подъеме уровней ЛДГ и гемоглобинемии.
Наряду с традиционно применяемой в трансплантации стволовых клеток стандартной концентрацией ДМСО - 10%, было высказано предположение, что целесообразным может быть снижение его концентрации. Более низкие концентрации ДМСО, например 5% [6] или 3,5% [9], также являются эффективными криопротекторами. Отмывка стволовых клеток для удаления ДМСО, судя по всему, не оказывает неблагоприятного действия на гематологическое восстановление и может сократить токсические эффекты и дробное применение стволовых клеток, а также уменьшить риск побочных эффектов. Несколько лет назад под эгидой ЕВМТ (Европейская организация по трансплантации костного мозга) проводилось исследование, в котором приняли участие 97 центров трансплантации, целью которого было оценить современную практику использования ДМСО и получить данные по его токсичности [26].
Большинство центров (п = 78) использовали концентрацию 10% ДМСО и только 5 центров -5% ДМСО. Из 95 центров токсические эффекты ДМСО наблюдались в 57 (60%), общее количество таких случаев составило 470. Всего 95 центрами было проведено примерно 34 000 трансплантаций, что дает минимальную итоговую частоту (т.е. общее количество побочных эффектов, разделенное на общее количество трансплантаций) в 1,4% примерно один на каждые 70 выполненных трансплантаций. Средняя частота токсических эффектов ДМСО на центр составила 2,1%. В то же время использование стратегий снижения количества ДМСО (концентрация менее 10% или отмывка клеток перед возвратом - 22 центра) была ассоциирована с итоговой частотой токсичности 0,3%.
Интересно, что при таких данных авторы сделали вывод о том, что неизвестно, приводит ли сокращение вводимого количества ДМСО к сокращению побочных эффектов, а также о том, что сегодня не существует никаких нормативных документов по его использованию и большинство трансплантационных центров разрабатывают собственные протоколы для использования и применения ДМСО.
Одним из спорных моментов до сих пор является вопрос об отмывке клеток от ДМСО. Однако исследование показало, что размораживание и отмывка клеток приводит к значительной потере клеток (20% ОЯК по сравнению с количеством до замораживания), причем на отмывку приходится половина этой потери [13]. Удаление ДМСО не приводит к значимой потере количества клеток, жизнеспособности, активности КОЕ-ГМ или количества CD34+ клеток, с учетом того, что данная процедура занимает 3-4 часа работы лаборатории [24]. Есть данные
о том, что удаление ДМСО центрифугированием значительно снижает количество и жизнеспособность CD34+ клеток после размораживания как ПК, так и периферической крови [27]. С другой стороны, показатели кумулятивной частоты приживления и медианы времени восстановления количества нейтрофилов и тромбоцитов в группах с отмыванием клеток и без отмывания не различались [17].
T. Hahn в своей работе предлагает вводить ПК пациентам сразу после размораживания, не отмывая, для упрощения процедуры и сокращения потерь клеток, особенно в случаях, находящихся на пределе клеточных доз, когда есть заключение, что предстоящая потеря клеток может неблагоприятно повлиять на исход ТПК [8].
Развитие технологий и, в частности, появление автоматических клеточных сепараторов, частично разрешило многолетнюю дискуссию о необходимости отмывки клеток от ДМСО.
В одном из исследований при использовании для отмывки клеток автоматической системы были получены следующие результаты: медиана полученных CD34+ клеток составила 93% и ОЯК - 89%; кроме того, медиана жизнеспособности CD34+ клеток по оценке аннексином V и 7-аминоактиномицином D (7-AAD), была 98% и 94% соответственно [15].
Суммируя вышеизложенное и основываясь на полученных нами данных, можно сделать вывод о том, что при наличии соответствующего технического оснащения, наиболее эффективным методом обработки ПК для выделения концентрата ЯК и, вероятно, для последующей его отмывки после размораживания является автоматический и, в частности, система клеточной сепарации Sepax S100 («Biosafe», Швейцария).
Так как данная система, к сожалению, не является широко распространенной в основном по экономическим причинам, при использовании метода двойного центрифугирования
каждый банк ПК и центр трансплантации должен делать выбор между подготовкой образца ПК для трансплантации путем разведения, что позволяет сохранить большее количество клеток, а, значит, и приживление трансплантата будет более успешным, но с возможным развитием побочных токсических эффектов ДМСО и менее высокой вероятностью приживления без побочных эффектов ДМСО в случае отмывки концентрата от криопротектора методом центрифугирования.
Литература
1 Пат. 2416197 РФ, МПК A01N 1/02, A61K 35/14, A61K 35/44. Способ криоконсервации гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови / А.Б. Смолянинов [и др.]; Федеральная Служба по интеллектуальной собственности и товарным знакам. - № 2009146082/21; заявл.11.12.2009; опубл. 20.04.2011, Бюл. N° 11. -
1 с.
2. Experimental basis of cord blood transplantation / H.E. Broxmeyer [et al.] // Bone Marrow Transplantation. - 2009. - Vol. 44, N10. - P. 627-633.
3. Technical feasibility and histopatho-logicstudies of ethylene vinyl copolymer (EVAL) using a swine endovascular embolization model J.C. Chaloupka [et al.] // Am J Neuroradiol. -1994. - Vol. 15, N 6. - P. 1107-1115.
4. A reexamination of the angiotoxicity of superselective injection of DMSO in the swine rete embolization model / J.C. Chaloupka [et al.] // Am J Neuroradiol. - 1999. - Vol. 20, N 3. - P. 401-410.
5. Cell recovery comparison between plasmadepletion/reduction- and red cell reduction processing of umbilical cord blood / R. Chow [et al.] // Cytotherapy. - 2011. - Vol. 13, N 9. -Р. 1105-1119.
6. Long-term storage at -80 degrees C of hematopoietic progenitor cells with 5-percent dimethyl sulfoxide as the sole cryoprotectant / A. Galmes [et al.] // Transfusion. - 1999. - Vol. 39, N 1. - P. 70-73.
7. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling / E. Gluckman [et al.] // N Engl J Med. -1989. - Vol. 321, N17. -P. 1174-1178.
8. Use of nonvolume-reduced (unmanipulated after thawing) umbilical cord blood stem cells for allogeneic transplantation results in safe
engraftment / T. Hahn [et al.] // Bone Marrow Transplantation. - 2003. - Vol. 32, № 2. -P. 145-150.
9. Uncontrolled-rate freezing and storage at -80 degrees C, with only 3.5-percent DMSO in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations / P. Halle [et al.] // Transfusion. - 2001. - Vol. 41, № 5. - P. 579-580.
10. Cryopreservation of cord blood after liquid storage / A. Hubel [et al.] // Cytotherapy. -
2003, - Vol. 5, №5. - P. 370-376.
11. Hunt, C.J. Cryopreservation of umbilical cord blood: 2. Tolerance of CD34(+) cells to multimolar dimethyl sulphoxide and the effect of cooling rate on recovery after freezing and thawing / C.J. Hunt, S.E. Armitage, D.E. Pegg // Cryobiology. - 2003. - Vol. 46, № 1. -P. 61-75.
12. Cord blood volume reduction using an automated system (Sepax) vs. a semi-automated system (Optipress II) and a manual method (hydroxyethyl starch sedimentation) for routine cord blood banking: a comparative study / V. Lapierre [et al.] // Cytotherapy. - 2007. - Vol. 9, № 2. - P. 165-169.
13. Cell loss and recovery in umbilical cord blood processing: a comparison of postthaw and postwash samples / V. Laroche [et al.] // Transfusion. -2005. - Vol. 45, №12. - P. 1909-1916.
14. Lovelock, J.E. Prevention of freezing damage to living cells by dimethyl sulphoxide / J.E. Lovelock, M.W.H. Bishop // Nature. - 1959. -Vol. 183, № 4672. - P. 1394-1395.
15. Analysis and cryopreservation of hematopoietic stem and progenitor cells from umbilical cord blood / T.P. Meyer [et al.] // Cytotherapy. - 2006. - Vol. 8, № 3. -P. 265-276.
16. Effects of long-term cryopreservation on hematopoietic progenitor cells in umbilical cord blood / H. Mugishima [et al.] // Bone Marrow Transplantation. - 1999. - Vol. 23, № 4. -P. 395-396.
17. Wash-out of DMSO does not improve the speed of engraftment of cord blood transplantation: follow-up of 46 adult patients with units shipped from a single cord blood bank / T. Nagamura-Inoue [et al.] // Transfusion. - 2003. - Vol. 43, № 9. -P. 1285-1295.
18. Quality rather than quantity: the cord blood bank dilemma / S. Querol [et al.] // Bone Marrow Transplantation. - 2010. - Vol. 45, № 6. -P. 970-978.
19. Washing of cord blood grafts after thawing: high cell recovery using an automated and closed system / L. Rodrigues [et al.] // Vox Sanguinis. -2004. - Vol. 87, M 3. - Р. 165-172
20. Processing and cryopreservation of placental/ umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution / P. Rubinstein [et al.] // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. - 1995. - Vol. 92, M 22. -P. 10119-10122.
21. «Age» of the Cord Blood (CB) Unit: Impact of Long-Term Cryopreservation and Storage on Transplant Outcome / A. Scaradavou [et al.] // Blood (ASH Annual Meeting Abstracts). -2007. - Vol. 110, Suppl. 11. - Abstract 2033.
22. Optimal timing for processing and cryopreservation of umbilical cord haematopoietic stem cells for clinical transplantation / A.A. Shlebak [et al.] // Bone Marrow Transplantation. - 1999. -Vol. 23, M 2. - P.131-136.
23 Suzanne, M.W. Cryopreservation of Hematopoietic Stem/Progenitor Cells for Therapeutic Use / M.W. Suzanne, E. Austin,
S. Armitage ; edited by J.G. Day, G.N. Stacey // Cryopreservation and freeze-drying protocols. -
2nd edn. - Humana Press Inc. Totowa, New Jersey, 2007. - P. 237-259.
24. The Role of Depletion of Dimethyl Sulfoxide before Autografting: On Hematologic Recovery, Side Effects, and Toxicity / R. Syme [et al.] // Biology of Blood and Marrow Transplantation. -
2004. - Vol. 10, № 2. - P. 135-141.
25. Fully automated and reproducible cord blood processing using the Biosafe Sepax and Coolmix Devices / K. Theunissen [et al.] // Abstracts of ASN Conference, San-Diego. - 2003.
26. Variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: a survey of EBMT centres / P. Windrum [et al.] // Bone Marrow Transplantation. - 2005. - Vol. 36, № 7. - P. 601-603.
27. Effect of dimethyl sulfoxide on post-thaw viability assessment of CD45+ and CD34+ cells of umbilical cord blood and mobilized peripheral blood / H. Yang [et al.] // Cryobiology. - 2005. -Vol. 51, № 2. - P. 165-175.
28. Clinical toxicity of cryopreserved circulating progenitor cells infusion / A. Zambelli [et al.] // Anticancer Res. - 1998. - Vol. 18, № 6B. -P. 4705-4708.
ДА. Иволгин
Тел.: +7-965-063-23-03
e-mail: [email protected]
