CC BY
107
Выбор оптимальных методов очистки белковых веществ, входящих в состав вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной инактивированной (КОКАВ)
А.В. Мухачева1 (muhacheva@expmed.ru), А.А. Мовсесянц1, М.М. Алсынбаев2
Ш1ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, Москва
2ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа
Резюме
В статье представлены данные исследований по выбору оптимальных методов очистки белковых веществ, входящих в состав сред для культивирования вируса бешенства, используемых при получении вакцины КОКАВ. Приведены результаты исследования по показателям качества «пирогенность» и «стерильность» белковых компонентов вирусологических питательных сред, очищенных различными методами. Итогом работы стал выбор оптимальных методов очистки компонентов ростовых питательных сред и сред для размножения вируса бешенства с целью получения апирогенного препарата.
Ключевые слова: вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная (КОКАВ), амино-пептид для микробиологических питательных сред, очистка белковых компонентов, сыворотка крови крупного рогатого скота жидкая для культур клеток, полуфабрикат для приготовления КОКАВ, показатель«пирогенность»
choice of the optimum Methods of purification of the proteins which are a part of AntiRabies Vaccine cultural concentrated cleared Inactivated (KoKAV)
A.V. Mukhacheva1 (muhacheva@expmed.ru), A.A. Movsesyants1, M.M. Alsynbaev2
1Federal State Budgetary Institution «Scientific Center on Expertise of Medicinal Application Products» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Moscow
2State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Training «Bashkir State Medical University» of Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Ufa
Abstract
The article presents the results of research the choice of optimal methods of purification proteins that are part of the culture anti-rabies vaccine (KOKAV). Presents the results of the testing of the quality«pyrogenicity»and«sterility»of protein components virological nutrient media, treated with various methods. Made choice of optimal methods for cleaning the protein substances that will get pyrogen-free and sterile components of growth of nutrient media for virus of rabies to obtain pyrogen-free drug.
Key words: rabies vaccine cultural concentrated purified inactivated (KOKAV), aminopeptid for microbiological culture media, cleaning the protein components, bovine serum liquid for cultures of cells, intermediate product for producing KOKAV, testing of«pyrogenicity»
Введение
Безопасность вакцин, в частности КОКАВ, является одним из основных показателей качества иммунобиологических лекарственных препаратов. Одним из важнейших показателей, позволяющих судить о качестве и безопасности антирабических вакцин, служит показатель «пирогенность».
Соответствие инъекционных растворов и субстанций, из которых они изготавливаются, показателю «пирогенность» определяется на основании измерения температуры тела у подопытных животных (кроликов) до и после инъекции. Исследуемый препарат считается не соответствующим требова-
ниям Государственной фармакопеи по показателю «пирогенность», если при его внутривенном введении наблюдается суммарное повышение температуры у трех животных на величину, превышающую 1,2 °С [1].
Промышленная технология производства вакцины антирабической в Уфимском филиале «Иммуно-препарат» ФГУП «НПО «Микроген» позволяет выпускать высокоэффективный иммунобиологический препарат, предназначенный для профилактики смертельного заболевания - бешенства. Препарат очищен от балластных веществ и таких примесей, как бычий сывороточный альбумин; строго регла-
ментировано содержание общего белка в полуфабрикате. Однако в процессе выпуска вакцины возникли проблемы, связанные с несоответствием серий готового препарата требованиям нормативной документации по показателю «пирогенность», что свидетельствовало о недостаточности очистки препарата на стадиях производства. Причиной повышения температуры у кроликов могли быть многие факторы, которые зависели как от качества вводимого препарата, так и от физиологического состояния организма животного. Многокомпонентный состав вакцины - концентрированный очищенный вирус бешенства, компоненты, входящие в состав среды для лиофилизации, а также составные части сырья, используемые в технологическом цикле производства КОКАВ, - мог стать источником появления пирогенности. Такими компонентами являются:
• сыворотка крови крупного рогатого скота жидкая для культур клеток, входящая в состав ростовой питательной среды (сыворотка КРС). Используется на этапе получения монослоя клеток почек сирийских хомячков на поверхности культуральных сосудов;
• аминопептид для микробиологических питательных сред, используемый в качестве белкового компонента в составе среды для размножения вируса бешенства.
Для получения апирогенного препарата требовалось определение степени влияния данных компонентов вирусологических питательных сред на показатель «пирогенность» готового препарата и подбор пригодных методов очистки данного сырья от веществ, при внутривенном введении которых у животных наблюдается повышение температуры.
Цель исследования - выбор оптимальных методов очистки белковых веществ, входящих в состав КОКАВ с целью получения апирогенного препарата.
Материалы и методы
В работе использовали:
• сыворотку крови крупного рогатого скота жидкую для культур клеток (ФСП 42-0343-3539-02);
• раствор аминопептида для микробиологических питательных сред (ТУ 9219-003-52126638-01) (раствор аминопептида);
• вируссодержащую культуральную жидкость, полученную при культивировании штамма вируса бешенства Внуково-32 (ВКЖ).
Проверку теста на пирогенность проводили на кроликах породы шиншилла весом 2 - 2,5 кг по методу, описанному в Государственной фармакопее (ГФ), с использованием в качестве контроля отраслевого стандартного образца пирогена производства ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО 42-28-341-07П). Тест-доза вводимых исследуемых компонентов вирусологических питательных сред составляла 10 мл/кг веса животного.
Для очистки сырья от возможных факторов, приводящих к появлению пирогенности, использовали: методы ультрафильтрации через полые волокна с порогом задержания 15 кД; адсорбенты - активированный уголь, гель гидроокиси алюминия; коммерческий препарат Полисорб; микрофильтрацию через глубинные химически модифицированные фильтры производства фирмы CUNO Incorporated 3M Company (США) [2]. Исследования серий готового препарата по показателю «пирогенность» проводили по ФСП 42-05047029-05 [3].
Работа была выполнена на базе ФГУП «НПО «Ми-кроген» (филиал «Иммунопрепарат», г. Уфа), Минздрава России и ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России.
Для обработки статистических данных использовали программу Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
При изучении показателя «пирогенность» у раствора аминопептида было установлено, что он не соответствовал требованиям Государственной фармакопеи. Суммарное повышение температуры тела ŒDt) у животных при исследовании составляло 5,6 °С (при норме < 1,2 °С). Кроме того, исследования по данному показателю не были предусмотрены в нормативной документации на препарат.
Метод адсорбции раствора аминопептида с использованием активированного угля, добавленного из расчета 10 г на 1 л при температуре 60 -70 °C и при контакте в течение 30 - 60 мин с последующей микрофильтрацией и стерилизующей фильтрацией, не снижал пирогенность препарата (среднее суммарное повышение температуры тела у животных составило 5,1 °C). Использование коммерческого препарата Полисорб в дозах 15 г на 100 - 150 мл раствора аминопептида с последующей микрофильтрацией и стерилизующей фильтрацией также не вызвало существенного суммарного понижения температуры тела у кроликов (^At - 4,6 °C). Метод мембранной фильтрации с использованием угольных фильтров производства фирмы Cuno с последующей стерилизующей фильтрацией позволил снизить величину показателя «пирогенность» более чем в 2 раза (значение данного показателя составило 2,4 °C), но это снижение не позволило добиться апирогенности препарата.
Применение метода ультрафильтрации через мембраны с полыми волокнами с порогом задержания 15 кД и последующей стерилизующей фильтрации через мембраны с размером пор 0,22 мкм позволило получить апирогенное сырье. Значение показателя «пирогенность» очищенного раствора аминопептида составило 0,5 °C, что удовлетворяет требованиям ГФ.
Всего было проведено по три опыта каждого из методов очистки раствора аминопептида, что позволило достоверно оценить результаты (P > 0,95).
Полученные результаты по дополнительной очистке раствора аминопептида позволили реко-
мендовать внесение изменений в технологический процесс на этапе приготовления среды для размножения вируса бешенства и предотвратить риск возникновения несоответствия серий готового препарата требованиям по показателю «пи-рогенность».
При изучении показателя «пирогенность» у коммерческих серий сыворотки КРС было установлено, что у данный ростовой питательной среды, использующейся на стадии приготовления полуфабриката, этот показатель в 2,5 раза превышал требования ГФ и составлял 3,6 °С. Применение методов очистки с использованием активированного угля, Полисорба, гидроокиси алюминия с последующей фильтрацией не дало существенного снижения значений данного показателя (среднее суммарное повышение температуры тела у кроликов колебалось от 2,3 до 2,8 °С), что не соответствовало требованиям ГФ и могло повлиять на качество готового препарата.
Результаты исследований представлены в таблице 1.
Следующим этапом работы было изучение метода каскадной микрофильтрации и стерилизующей фильтрации. Сыворотка крови КРС предварительно нагревалась в термальной камере до температуры 35 ± 1 °С и подвергалась микро-фильтации и стерилизующей фильтрации через мембраны с размером пор 0,22 мкм. До проведения дополнительных технологических операций сыворотка хранилась в замороженном состоянии при температуре - 18 ± 2 °С. Использование данного метода очистки дало возможность получения апирогенной сыворотки крови крупного рогатого скота. Суммарное повышение температуры тела у трех кроликов в составе ростовой питательной среды составило 1,0 °С.
Всего было проведено по три опыта каждого
из методов доочистки сыворотки крови КРС (данные представленны в табл. 2), что позволило достоверно оценить результаты полученных исследований (Р > 0,95).
Оптимальным методом дополнительной очистки сыворотки КРС стало использование микрофильтрации и стерилизующей фильтрации, в результате чего была получена апирогенная ростовая питательная среда.
После подбора метода очистки сыворотки КРС и раствора аминопептида от веществ, способствующих повышенному температурному ответу при внутривенном введении вакцины животным, из коммерческих серий сырья были приготовлены производственные серии данных компонентов.
Серия коммерческого препарата «Сыворотка крови крупного рогатого скота жидкая для культур клеток» подвергалась каскадной микрофильтрации и стерилизующей фильтрации по технологии, описанной выше. По завершении данного процесса приготовленные производственные серии сыворотки № 1, 2 и 3 изучили по показателям «стерильность» и «отсутствие микоплазм», «пирогенность». Полученные результаты представлены в таблице 2.
Все приготовленные производственные серии сыворотки КРС были апирогенны, среднее арифметическое значение показателя пирогенности составило 0,98 ± 0,12 °С.
Полученные результаты позволяют рекомендовать депирогенизацию сыворотки крови крупного рогатого скота, метод каскадной микрофильтрации и последующей стерилизующей фильтрации, ее хранение при температуре -8 ± 2 °С, а также внесение данной операции в изменения к промышленному регламенту на производство препарата.
С целью приготовления раствора аминопепти-да, отвечающего требованиям ГФ по показателям «стерильность» и «пирогенность», раствор амино-
Таблица 1.
Результаты очистки сыворотки кРС различными методами
Материал Метод очистки Значение показателя пирогенности, 24t , °C
Сыворотка крови КРС Адсорбция на активированном угле 2,8
Сыворотка крови КРС Адсорбция на коммерческом препарате Полисорб 2,3
Сыворотка крови КРС Мембранная фильтрация с использованием угольных фильтров производства фирмы Cuno после предварительной адсорбции с использованием гидроокиси алюминия 2,0
Сыворотка крови КРС (П = 3) ^ > 0,95) Стерилизация мембранными методами (микрофильтрация через мембраны с размером пор 1,2; 0,8; 0,45 мкм и стерилизующая фильтрация через мембраны с размером пор 0,22 мкм) 1,0
Примечание: суммарное повышение температуры при контроле коммерческой сыворотки КРС = 3,6 °С
Дисперсия (а) = ± 0,04 °С
Стандартное отклонение (М ± а) = 3,6 ± 0,2 °С
Средняя квадратическая ошибка (т) = ± 0,02 °С
Доверительный интервал (Р > 0,95, f = 2) = 0,497
Норма показателя «пирогенность» < 1,2 °С
Показатель «пирогенность» коммерческой сыворотки КРС составлял в среднем 3,6 ± 0,2 °С.
Таблица 2.
Исследования производственных серий сыворотки кРС, полученных методами микрофильтрации и стерилизующей фильтрации
№ производственной серии сыворотки КРС Показатели качества полученных производственных серий Среднее арифметическое значений показателя «пирогенность» по каждому опыту X. °С
стерильность отсутствие микоплазм значение показателя «пирогенность», 24t, °C
опыт № 1 опыт № 2 опыт № 3
1 Стерильна Микоплазмы отсутствуют 1,1 0,9 1,2 1,06
2 Стерильна Микоплазмы отсутствуют 0,8 1,1 1,2 1,03
3 Стерильна Микоплазмы отсутствуют 0,7 0,9 1,0 0,86
Примечание: среднее рифметическое значение показателя «пирогенность» по всем опытам (у) = 0,98 Дисперсия (а) = ± 0,12 °С
Стандартное отклонение (М ± а) = 0,98 ± 0,12 °С Средняя квадратическая ошибка (т) = ± 0,04 °С Доверительный интервал (Р > 0,95, f = 8) = 0,135 Норма показателя «пирогенность» < 1,2 °С
Показатель «пирогенность» коммерческой сыворотки КРС (X) составлял 3,6 ± 0,2 °С.
Таблица 3.
Исследования производственных серий аминопептида, полученных методами ультрафильтрации и стерилизующей фильтрации
№ производственной серии ами-нопептида Показатели качества полученных производственных серий Среднее арифметическое значений показателя «прирогенность» по каждому опыту X! °С
стерильность значение показателя «пирогенность», 24t, °C
опыт № 1 опыт № 2 опыт № 3
1 Стерилен 0,40 0,30 0,50 0,40
2 Стерилен 0,70 0,50 0,80 0,66
3 Стерилен 0,40 0,30 0,60 0,43
Примечание: среднее рифметическое значение показателя «пирогенность» по всем опытам (X) = 0,5 °С Дисперсия (а) = ± 0,03 'С
Стандартное отклонение (М ± а ) = 0,5 ± 0,03 °С Средняя квадратическая ошибка (т) = ± 0,173 °С Доверительный интервал (Р > 0,95, f = 8) = 0,133 Норма показателя «пирогенность» < 1,2 °С
Показатель пирогенности коммерческого раствора аминопептида (X) составлял 5,6 ± 0,3 °С.
пептида подвергался ультрафильтрации через мембраны с порогом пропускания 15 кД и стерилизующей фильтрации. По завершении данного процесса приготовленные производственные серии раствора аминопептида № 1, 2 и 3 контролировались по вышеперечисленным показателям. Результаты исследования представлены в таблице 3.
Представленные в таблице 3 результаты подтвердили, что проведение очистки серии коммерческого препарата раствора аминопепти-да методом ультрафильтрации через мембраны с полыми волокнами с порогом пропускания 15 кД с последующей стерилизующей фильтрацией дает возможность получения апирогенного компонента питательной среды для размножения вируса бешенства. Производственные серии раствора аминопептида были стерильны и апирогенны.
Приготовленные и отконтролированные по показателям «стерильность» и «пирогенность» производственные серии сыворотки КРС и раствора аминопептида были использованы при получении пяти серий полуфабриката для приготовления КОКАВ по стандартной технологической схеме, описанной в промышленном регламенте [4]. Данные серии полуфабриката помещались в холодильную камеру с температурой -35 ± 5 °С. Стадия замораживания полуфабриката предусмотрена в промышленном регламенте на производство препарата [4]. Данная стадия необходима для сохранения стабильных свойств вируса в период проведения исследований полуфабриката по показателям «стерильность» и «инфекционный титр». После получения положительных результатов полуфабрикат подвергался оттаиванию и оценивался по показателю «пирогенность». Тест-доза полуфабриката для
Таблица 4.
Значения показателя «пирогенность» полуфабриката для получения кокав, приготовленного с использованием сыворотки крови кРС и раствора аминопептида, прошедших дополнительную очистку
№ серии Значение показателя «пирогенность» сборов ВКЖ после размораживания, 2At, °C
1 0,8
2 1,1
3 0,9
4 1,0
5 1,1
Примечание: среднее арифметическое значений показателя «пирогенность» (X) = 0,98 °С Дисперсия (О) = 0,11 С
Стандартное отклонение (М ± О) = 0,98 ± 0,11 °С Норма показателя «пирогенность» < 1,2 °С.
введения одному кролику составляла 1 мл на 1 кг массы тела животного. Данные значений показателя «пирогенность» представлены в таблице 4.
Минимальное значение показателя «пирогенность» полуфабриката, который приготовлен с использованием сырья, прошедшего стадии дополнительной очистки, составило 0,8 °С, а максимальное - 1,1 °С. Среднее арифметическое значений данного показателя составило 0,98 ± 0,11 °С, что соответствует требованиям Государственной фармакопеи.
Вывод
Выбраны оптимальные методы очистки раствора аминопептида и сыворотки крови крупного рогатого скота жидкой для культуры клеток, позволяющие получать апирогенные и стерильные компоненты ростовой питательной среды и среды для размножения вируса бешенства, что позволяет получить апирогенный полуфабрикат для приготовления антирабической вакцины и готового апирогенного препарата КОКАВ. ■
Литература
1. Государственная фармакопея Российской Федерации, XII издание. Москва: Научный центр экспертизы средств медицинского применения; 2008: 125.
2. Кевин Л.У Эндотоксины, пирогены, ЛАЛ-тест и методы депирогенизации. Третье издание. Индианаполис, Индиана: Здравоохранение США; 2007
3. Фармакопейная статья предприятия ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России на препарат «КОКАВ Вакцина антирабическая культуральная концентрированная очищенная инактивированная, лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения». ФСП № 42-05047029-05. 2005.
4. Промышленный регламент № 1613-05 на производство «КОКАВ - Вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной инактивированной сухой, лиофилизата для приготовления раствора для внутримышечного введения». ПР № 04863057-48-05. 2005: 253.
References
1. The state Pharmacopeia of the Russian Federation. Moscow: Research centre of medical products; 2008: 125 (in Russian).
2. Kevin L.W. Endotoxins Pyrogens, LAL-testing and depyrogenation. Third edition. Indianapolis, Indiana: Healthcare USA; 2007.
3. Pharmacopeia article «FGUP «NPO «Microgen», Ministry of health of the Russian Federation on the preparation «KOKAV Vaccine rabies cultural concentrated purified inactivated dry, for solution for intramuscular injection». Pharmacopeial article Enterprise № 42-05047029-05 2005 (in Russian).
4. Industrial regulation № 1613-05 for production the preparation «KOKAV - Vaccine rabies cultural concentrated purified inactivated dry, for solution for intramuscular injection». PR № 04863057=48=05. 2005: 253 (in Russian).
10-е издание Австралийского руководства по иммунизации
Руководство (529 стр.) выпущено Департаментом здравоохранения правительства Австралии, одобрено Советом по Национальному здравоохранению и медицинским исследованиям (MHMRC), включает разделы: введение, процедуры вакцинации, вакцинация групп риска, заболевания, предотвращаемые вакцинацией, пассивная иммунизация, 7 приложений.
Особый интерес представляет раздел, посвященный вакцинации лиц групп риска (в т.ч. лиц с аллергиями, в частности, к куриному яйцу; женщин, планирующих беременность, беременных и кормящих грудью; недоношенных детей; иммунокомпроментированных лиц; онкологических больных; реципиентов стволовых клеток; ВИЧ-инфицированных; лиц с функциональной и анатомической
аспленией, больных аутоиммунными заболеваниями, нарушениями свертываемости крови; больных в пред- и послеоперационном периодах). Раздел «Заболевания, предотвращаемые вакцинацией» включает информацию о 21 нозоформе по единой стандартной форме: возбудитель, клиника, эпидемиология, вакцины,дозы и схемы вакцинации, противопоказания, побочное дей-ствие,особенности применения и рекомендации.
Источник: http://www.immunise.health.gov.au/
internet/immunise/publishing.nsf/Content/
Handbook10-home
Подготовил Н.А. Озерецковский.
