CC BY
116
УДК 655. 637:631.427.2
Э. Р. Бабаев, П. Ш. Мамедова, Д. М. Кулиева, М. Э. Мовсумзаде
Выбор активного микроорганизма - деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв Балаханского месторождения
Институт химии присадок им. акад. А.М.Кулиева НАН Азербайджана 370000, г. Баку, Беюксорское шоссе, 24, тел (99412)4938058
E. R. Babayev, P. Sh. Mamedova, D. M. Quliyeva M. E. Movsumzade The Choice of Active Hydrocarbon Destructing Microorganism for Clean-up of Oil- polluted Soils of Balakhanskoe deposit
Academican A. M. Quliyev Institute of Chemistry of Additives NASA 24, Beyuksorskoe Shosse, Baku, 370000, Russia; Ph.: (99412)4938058
Из нефтезагрязненных почв территории Балаханского месторождения выделены углеводоро-докисляющие микроорганизмы, способные расти на питательных средах, содержащих в качестве единственного источника углерода и энергии нефть и нефтепродукты. Из 14 культур, способных к деструкции нефти, отобраны и исследованы 6 наиболее активных, способных утилизировать нефтепродукты различной степени конденсации: нефть, а также ее гексановые, бензольные и спирто-бензольные фракции. Максимальная степень деструкции нефти наблюдалась у культур: Д2(65%), Pseudomonas fluorecenses (56%) и Д5(54%); для гексановых фракций — у культур Д2(62%), Pseudomonas fluorecenses (60%), Д5(53%); для бензольных и спирто-бензольных — у культуры Д2 (38 и 25 %) соответственно. Изученные штаммы могут быть использованы для создания и дальнейшего применения биопрепаратов для биоремедиации от нефтезагрязнений.
Ключевые слова: биоремедиация; нефтедес-трукторы; нефтезагрязненные почвы; нефтепродукты; углеводородокисляющие микроорганизмы.
Microorganisms growing on mineral mediums with crude oil and oil products as only carbon and energy sources have been isolated from samples of oil polluted soils of Balakhanskoe Deposit. From 14 strains capable to oil degradation six were selected and studied as more active degraders of soil products of various condensation degrees (crude oil, hexane, benzene and ethanol-benzene fractions). The maximum degrees of degradation of crude oil were observed in strains D2(65%), D5 (54%) and Pseudomonas fluorecenses (56%); for the hexane fraction it were observed in D2(62%), Pseudomonas fluorecenses (60%) and D5 (53%); for the benzene and ethanol-benzene fractions were observed in D2 (38% and 25% respectively). The strains provide a basis for developing biopreparations applicable to bioremediation of oil polluted sites.
Key words: bioremediation; oil degradation; petropolluted ground; mineral oil; hydrocarbon oxyding microorganisms.
Нефть и нефтепродукты являются одними из основных загрязнителей среды 1. Среди мер, предпринимаемых с целью охраны окружающей среды от подобных загрязнений, важное место занимает биоремедиация почв, основанная на способности некоторых микроорганизмов к деградации нефти и нефтепродуктов 2. Эффективность процесса очистки зависит от ряда факторов, в том числе от правильного выбора микроорганизма-деструктора. Для
ликвидации региональных нефтезагрязнений предпочтительнее использование адаптированных к конкретным условиям микроорганиз-мов-нефтедеструкторов.
Целью настоящей работы являлось изучение деструктивной активности микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненных почв территории Балаханского месторождения, по отношению к нефтепродуктам различной степени конденсации.
Дата поступления 14,01,09
Экспериментальная часть
В работе использованы 6 активных культур, отобранных в результате целенаправленного скрининга из 14 культур микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненных почв Балаханского месторождения, способных расти на средах, содержащих в качестве единственного источника углерода выделенную из загрязненных почв нефть и нефтепродукты. В том числе были исследованы штаммы микроорганизмов-нефтедеструкторов, выделенные и протестированные ранее: Pseudomonas fluorecenses и Mucobacterium lacticolum. Культивирование микроорганизмов проводили в жидкой минеральной среде следующего состава (г/л): K2HPO4 — 0.5; KH2PO4 - 0.5; MgSO4 - 0.3; FeCl3 — 0.01; CaCl2 — 0.1; NaNO3 — 2.5. В качестве единственного источника углерода в среду вносили 1% нефти, выделенной из загрязненных почв Балаханского месторождения или ее некоторые фракций. Культивирование микроорганизмов проводили в колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл жидкой питательной среды, на круговой качалке (160 об./мин) при 28 оС. Инокулирование колб с питательной средой и нефтепродуктами производили суспензией микроорганизмов (4 мл на 100 мл среды). В качестве контроля использовали колбы со средой и нефтепродуктами без инокуляции микроорганизмами.
Интенсивность биодеградации сырой нефти и нефтепродуктов определяли весовым методом 3 — по количеству остаточной нефти и по весу сухой биомассы, предварительно отмытой гексаном.
Для определения остаточной нефти или нефтепродуктов после окончания роста содержимое колб подвергали экстракции хлороформом. Пробы культуральной жидкости и кон-троль объемом 100 мл экстрагировали встряхиванием с 50 мл хлороформа в течение 30 мин. Хлороформный экстракт отделяли центрифугированием в течение 30 мин и высушивали в стакане над 3 г безводного сульфита натрия. Хлороформные экстракты переносили в пред-варительно взвешенные с точностью до 0.0001 г градуированные пробирки и помещали в вентилируемый термостат при 70—75 оС на 3—4 ч, выдерживали при 35—40 оС в течение ночи и взвешивали. Оценка нефтеразла-гающей активности весовым способом осуществлялась с учетом данных, полученных для контроля.
С применением фракционирования на си-ликагеле выделенная из нефтезагрязненных почв нефть была разделена на три условные фракции: гексановая — содержит парафино-на-фтеновые и ароматические углеводороды; бензольная — полициклические ароматические углеводороды (бензольные смолы); спирто-бен-зольная — нафтеновые кислоты, спирто-бен-зольные смолы.
Фракционирование нефти, выделенной из загрязненной почвы, проводили хромато-графическим способом с применением колонок, заполненных силикагелем Л 40/100 мк («Chemarol», Чехия). Сорбент уравновешивали гексаном. Навески проб, полученных экстракций, диспергировали в гексане, наносили на колонки. Элюцию углеводородов осуществляли гексаном, бензолом и смесью бензол-этанол (1 : 1 V/V), собирали в тарированные пробирки. Полученные гексановые, бензольные и спирто-бензольные фракции упаривали на воздухе и досушивали в вентилируемом сушильном шкафу при 75 оС до постоянного веса. Содержание фракций определяли в пересчете на исходную навеску пробы.
В опытах использовали выделенную из почв нефть следующего состава: гексановая фракция — 22%, бензольная — 15% и этанол-бензольная — 13%.
Результаты и их обсуждение
Известно, что в природе имеет место большая неоднородность распределения нефтяных компонентов в почвах разных участков нефтепромыслов, что зависит от физических и химических свойств конкретных почв, качества и состава поступившей нефти. Чувствительность отдельных групп микроорганизмов к отдельным фракциям нефти определяется химическим составом и физическими свойствами последних 4. В условиях природного микробиоценоза наблюдается одновременная ассимиляция разных фракций нефти различными группами микроорганизмов, при этом зачастую наиболее активными при интродукции являются культуры, выделенные из мест нефтезагряз-нения.
Нами проведен скрининг аборигенной микрофлоры, способной ассимилировать компоненты нефти месторождения Балаханы.
Было выделено 14 культур микроорганизмов, нефтедеструктивная активность которых определялась после проведения процесса культивирования по количеству остаточной нефти и
полученной биомассы (сухой вес), а также визуально. Результаты исследований приведены в табл. 1.
Из табл. 1 следует, что наиболее активными деструктами нефти являются Д 2, Д 4, Д 5 и Д 11.
Нами изучена способность отобранных активных штаммов культур к деструкции нефтепродуктов различной степени конденсации — нефти и ее фракций: гексановой, бензольной и спирто-бензольной, полученных ад-
сорбционным разделением нефти, выделенной из нефтезагрязненных почв месторождения Балаханы.
Как следует из табл. 2, исследованные культуры имеют различную активность в отношении отдельных фракций нефти, выделенных из загрязненных почв. Так, культуры эффективны (32—62 %) при утилизации гекса-новой фракции (парафино-нафтеновые углеводороды). Максимальная степень деструкции этой фракции (62%) достигается культурой
Таблица 1
Hефтедеструктивная активность выделенных штаммов микроорганизмов
Штаммы Визуальное наблюдение Деструкция нефти, % рН Вес сухой биомассы, мг
До опыта После опыта
Pseudomonas fluorecenses + + + + 56 7.0 6.2 200
Mycobacterium lacticolum + + + 40 7.0 6.7 120
Д1 + + + 20 7.0 6.7 70
Д 2 + + + + 65 7.0 7.2 260
Д 3 + + + 30 7.0 7.0 160
Д 4 + + + + 44 7.0 6.5 200
Д 5 + + + + 54 7.0 7.2 200
Д 6 + + + 25 7.0 7.0 80
Д 7 + + 10 7.0 7.0 60
Д 8 + + 20 7.0 7.2 70
Д 9 + + 24 7.0 7.5 65
Д 10 + + + 20 7.0 7.5 100
Д 11 + + + + 40 7.0 7.5 150
Д 12 + + + 22 7.0 7.5 120
+ + — частичное разрушение пленки;
+ + + — разрушение пленки на мелкие частички, помутнение питательной среды, небольшой осадок; + + + + — разрушение пленки, помутнение среды и обильный осадок.
Таблица 2
Деструктивная активность культур по отношению к фракциям нефти, выделенной из загрязненных почв месторождении Балаханы
Культура Субстрат Визуальное наблюдение Степень деструкции, % Вес биомассы, г рН
До опыта После опыта
Pseudomonas fluorecenses Гексановая фракция + + + + 60 200 7.0 6.6
Myobacterium lacticolum + + + 32 100 7.0 6.5
Д 2 + + + + 62 270 7.0 6.7
Д 4 + + + + 51 200 7.0 7.0
Д 5 + + + + 53 240 7.0 7.2
Д 11 + + + 32 160 7.0 6.5
Pseudomonas fluorecenses Бензольная фракция + + + 30 100 7.0 7.2
Mycobacterium lacticolum + + 20 66 7.0 7.0
Д 2 + + + + 38 170 7.0 7.1
Д 4 + + 22 80 7.0 7.0
Д 5 + + + 28 100 7.0 6.8
Д 11 + + 18 60 7.0 6.6
Pseudomonas fluorecenses Спирто-бензольная фракция + + 20 100 7.0 7.0
Mycobacterium lacticolum + + 15 60 7.0 7.0
Д 2 + + + 25 110 7.0 6.5
Д 4 + + 12 60 7.0 7.0
Д 5 + + 20 67 7.0 7.2
Д 11 + + 22 100 7.0 7.0
Д 2. Слабо утилизируются бензольные (полициклические ароматические углеводороды, бензольные смолы), а также этанол-бензольные фракции. Смолистые фракции являются наиболее труднодоступными субстратами для биодеструкции.
Утилизация бензольных смол происходила относительно активно культурой Д 2 (38%), несколько ниже она у культур Д 4 и Д 5 (22 и 28 %) и минимальная у Д 11 (18%). Это можно объяснить избирательной активностью ферментных систем по отношению к используемому субстрату.
Спирто-бензольные смолы являются вы-сококонденсированной фракцией нефти и труднодоступным субстратом при культивировании микроорганизмов. Относительно активной культурой по утилизации этих углеводородов оказалась Д2. Степень деструкции этанол-бензольных смол у нее составила 25%. Следует отметить, что при культивировании
культур микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненных почв на средах с нефтью и ее фракциями, наблюдалась определенная корреляция между степенью деструкции и концентрацией биомассы.
Выделенные и отобранные активные микроорганизмы могут быть использованы для создания биопрепаратов и их дальнейшего применения для биоремедиации нефтезагряз-ненных почв Апшеронского полуострова.
Литература
1. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем.— М.: Наука, 1988.— 264 с.
2. Воищшп А. // ВюЫиг.- 1990.- № 93.-Р. 24.
3. Белоусова Н. И., Барышникова Л. М., Шкид-ченко А. Н. // Прикладная биохимия и микробиология.- 2002.- Т. 38, № 5.- С. 513.
4. Литвин Л. М., Зименко Т. Г. Влияние высоких доз нефтяного загрязнения на биологическую активность дерново-подземистых почв // Изв. АН СССР.- 1987.- № 2.
