CC BY
70
Раздел 6. Инженерная экология и смежные вопросы
Использование прямой схемы клеточной селекции и добавление токсиканта в питательную среду только на этапе культивирования каллусов, позволило получит нам растения-регенеранты. Было получено 30 регенерантов льна, толерантных к меди, в условиях in vitro и 21 растение хризантемы килеватой.
Таким образом, нами было показано, что исследуемые объекты очень чувствительны к меди как на уровне целых растений, так и в культуре клеток. Разработаны схемы клеточной селекции для получения декоративных двудольных растений, устойчивых к меди.
Литература
1. Ладонина H.H., Ладонин Д.В. Загрязнение почв юго-восточного административного округа г. Москвы медью и цинком; Экология, 2000, № 1: 61-65.
2. Титов А.Ф., Таланова В.В., Казнина Н.М., Лайдинен Г.Ф. Устойчивость растений к тяжелым металлам; Институт биологии КарНЦ Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007: 156.
3. Гладков Е.А. Оценка фитотоксичности комплексного воздействия тяжелых металлов и определение ориентировочно допустимых концентраций для цинка и меди. Сельскохозяйственная биология, № 6, 33-36, 2010.
4. Гладков Е.А. ,Гладкова О.В. Оценка комплексной фитотоксичности тяжелых металлов и получение растений, обладающих комплексной устойчивостью, Биотехнология, № 1, 81-86, 2007.
5. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassaya with tobacco tissue cultures//Physiologia Plantarum, 1962, V. 15: 473-476.
6. Gambourg O.L., Elevegh D. Culture methods and detection of glucanases in suspension cultures of weat and parleys // Can.J.Biochem, 1968, 46: 417-421.
Введение в культуру клеток и получение растений брахикомы иберисолистной и хризантемы килеватой
Литвинова ИИ, к.б.н. доц. Гладков Е.А.
Университет машиностроения 8 (499) 231-83-34, ilma-15Cdiya.ru Аннотация. Введены в культуру клеток брахикома иберисолистная, хризантема килеватая. Подобраны оптимальные среды для каллусообразования, регенерации и укоренения растений-регенерантов.
Ключевые слова: каллус, регенерация, хризантема, брахикома.
Хризантема килеватая и брахикома иберисолистная широко используются в озеленении города, на клумбах, в миксбордерах, в срезке, обладают удивительной многоликостью красок и продолжительным цветением.
Хризантема килеватая (Chrysanthemum carinatum L.) - однолетнее, обильноцветущее, с конца июня по сентябрь, растение, семейство Сложноцветных (Астровые). Соцветия - корзинки, чаще простые, реже полумахровые или махровые, душистые, довольно крупные, 5-7 см в диаметре, различной окраски. Плод - треугольная или сплюснутая семянка с крыловидными выростами. Семена сохраняют всхожесть 2-3 года. Хризантему килеватую часто выращивают на срезку, поскольку ее привлекательные соцветия могут довольно долго стоять в вазе с водой не увядая. Кроме этого она может быть с успехом использована для украшения клумб и рабаток как в одиночных посадках, так и небольшими компактными группами[1].
Брахикома иберисолистная (Brachycome iberidifolia L) - однолетнее сильноветвистое растение, семейство Сложноцветных, высотой 15-25 см с изящными листьями, расположенными в очередном порядке. Кустики несут многочисленные мелкие соцветия - корзинки 3-3,5 см в диаметре. Применяется для оформления клумб, бордюров, альпийский горок, как
Раздел 6. Инженерная экология и смежные вопросы, горшочная культура, входит в состав мавританского газона, используемого в городском озеленении и на садовых участках [1-2]. Брахикома заслуживает самого широкого использования из-за высокой декоративности и продолжительного цветения.
Обладая высокой декоративностью и неприхотливостью в уходе, эти растения чувствительны к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, что существенно ограничивает использование их в условиях высокого уровня загрязнения. Для того чтобы повысить толерантность этих растений, можно использовать клеточную селекцию, обязательным условием использования которой является введение в культуру клеток растений [3].
Цель работы: введение в культуру клеток и регенерация растений брахикомы иберисо-листной и хризантемы килеватой
Материалы и методы
В работе использованы семена брахикомы иберисолистной (Brachycome iberidifolia L.) сорт Голубая Неженка и хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatam L.) сорт Эльдорадо.
В качестве эксплантов использовали семена растений. Экспланты стерилизовали однократной обработкой спиртом с последующей стерилизацией раствором, содержащим гипо-хлорит натрия в течение 15-30 минут (в зависимости от растения). Затем их три раза промывали стерильной дистиллированной водой. Оптимальное время стерилизации определяли по жизнеспособности первичных эксплантов и зараженности фитопатогенами. Для культивирования in vitro применяли агаризованные питательные среды Мурасиге-Скуга (МС) [4] и Гам-борга (В5) [5] в сочетании с 3% сахарозы. В качестве регуляторов роста в питательные среды добавляли 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), 6-бензиламинопурин (БАЛ) и а-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолилуксусную кислоту (ИУК), кинетин в различных концентрациях и комбинациях
Результаты и обсуждения
Работ по введению культуру клеток брахикомы нет, нами были использованы питательные среды Мурасиге-Скуга и Гамборга. По результатам работы установлено, что каллусы образовывались во всех вариантах опыта, при концентрациях 2,4-Д от 1 до 10 мг/л на средах МС и В5, но на концентрациях 1, 2, 4 мг/л 2,4-Д наблюдалось интенсивное прорастание семян. Процент образования каллусов на среде В5 был больше, чем на среде МС, например на среде МС при концентрации 2 мг/л частота каллусообразования составляла 15,6 %, а на среде В5 - 25,4%. При концентрации 1 мг/л 2,4-Д на питательной среде В5 - интенсивность каллусообразования составляла 11,3%, при концентрации 4 мг/л 2,4-Д - 34,7%, а на среде МС 9,6% и 24,4% соответственно (таблица 1). Каллус образовывался светло-желтого цвета, средней плотности, в течение 10-14 дней.
Добавление в среду 2 мг/л кинетина, в сочетании с различными концентрациями 2,4-Д, увеличивало процент образования каллусов. При добавлении кинетина в среду с 4 мг/л 2,4-Д каллусобразование увеличивалось с 34,7% до 42,1%; при концентрации 8 мг/л 2,4-Д - с 43,3% до 48,1%. Оптимальной средой для каллусообразования брахикомы иберисолистной была среда В5 с 6 мг/л 2,4-Д и 2 мг/л кинетина (56,1%).
Для дальнейшего культивирования и регенерации полученные каллусы брахикомы иберисолистной пересаживали на питательную среду МС с половинным содержанием всех минеральных компонентов (Уг МС). Для стимулирования процесса образования регенерантов в питательную среду добавляли фитогормоны БАП и НУК в различных концентрациях и комбинациях. Наибольший процент образования регенерантов был на среде Уг МС с 0,1 мг/л НУК и 2 мг/л БАП (62,3%). Регенеранты образовывались через 2-3 пассажа, темно-зеленого цвета.
Хризантема оказалась трудоемкой культурой, было рассмотрено большое количество комбинаций питательных сред и фитогормонов для каллусообразования и регенерации растений. К тому же большинство работ по культуре клеток хризантемы связано с микрокло-
Раздел 6. Инженерная экология и смежные вопросы
нальным размножением хризантемы многолетней, другого вида хризантем (дендрантема) [6-7], так как большинство традиционно относимых к роду Chrysanthemum хризантем по современной классификации видов относят к роду Dendranthema.
Таблица 1
Влияние 2,4-Д и Кииетииа в питательной среде на интенсивность каллусообразования
брахикомы иберисолистной (Х±х).
Концентрация фитогормонов, мг/л среде Мурас иге-С ку га среда Гамборга
2,4-Д Кинетин процент образованного каллуса (%)
1 - 9,6±1,2 11,3±1,2
2 - 15,6±1,9 25,4±2,2
4 - 24,4+3,7 34,7±3,0
6 - 36,9±4,1 45,5±3,7
8 - 44,1±5,3 42,3+3,1
10 - 45,5±3,9 31,8+4,1
1 2 10,6+1,5 14,0±1,1
2 2 22,7*2,1 34,3±3,9
4 2 28,1*2,3 42,1+5,0
6 2 34,5+3,8 56,1+3,8
8 2 52,3+4,4 48,1 ±3,3
10 2 42,2+3,9 31,4+4,1
11 мг/л БАП+0,1 мг'лИУК 1мг/лБАП+1мюИУК
11 мг/л 2,4-Д + 2 мг/л кинетина
12 мг/л 2,4-Д-2мг/л кшетяна 4мг/л 2,4-Д+2мг/'л кинетина бмг/л 2,4-Д+2мг/л кинетина 8мг/л2,4-Д+2м17л кинетина Юмг/л 2,4-Д+2мг/л кинетина
Рисунок 2 - Частота каллусообразования у хризантемы килеватой в зависимости от вида фитогормонов на среде MC
Рисунок 1 -Регенеранты брахикомы иберисолистной с корнями
Для получения каллусных тканей семена хризантемы высаживали на среды МС содержащие 2,4-Д, кинетин, БАЛ, ИУК в различных комбинациях и концентрациях. Интенсивное каллусообразования наблюдали при добавлении в питательную среду БАЛ и ИУК. Максимальное каллуссобразование (78,2%) было на среде МС с 1 мг/л БАЛ и 0,1 мг/л ИУК. Добав-
Рисунок 3 -Регенеранты хризантемы килеватой с корнями
Раздел 6. Инженерная экология и смежные вопросы, ление в питательную среду 2 мг/л кинетина в сочетание с различными концентрациями 2,4-Д не привело к интенсификации процесса каллусообразования, частота каллусообразования во всех сочетаниях была менее 40% (рисунки 1 и 2).
Для регенерации была подобрана питательная среда '/г МС с 0,5 мг/л БАП, через 2-3 пассажа были получены регенеранты (24,8%). Каллу core нез и регенерация растений осложнялась повышенной чувствительностью каллусов к компонентам среды и рН. При культивировании каллусов более 3 недель происходило потемнение каллуса.
Для укоренения растения-регенеранты брахикомы иберисолистной и хризантемы килеватой пересаживали в пробирки на жидкую питательную среду Уг МС с добавлением 0,1 мг/л НУК, корни образовывались через 1-2 пассажа.
Таким образом, подобраны среды для каллусообразования, регенерации и укоренения для брахикомы иберелисолистной: каллусообразования на среде В5 с 6 мг/л 2,4-Д и 2 мг/л кинетина, регенерация растений на среде 1/2МС с 0,1 мг/л НУК и 2 мг/л БАП, укоренение на среде с Уг МС с 0,1 мг/л НУК; для хризантемы килеватой - каллусообразования на среде 1 мг/л БАП и 0,1 мг/л ИУК, регенерация на Уг МС с 0,5 мг/л БАП и укоренение на Уг МС с 0,1 мг/л НУК.
Литература
1. Колесникова Е.Г. Газоны элементы садового дизайна. КЛАДЕЗЬ-БУКС, М., 2010: 8-9.
2. Ващенко М. Мавританский газон. Цветоводство, 2002, № 2: 9.
3. Гладков Е.А, Долгих Ю.И., Бирюков В.В., Гладкова О.В. Клеточная селекция газонных трав, толерантных к ионам меди, Биотехнология, 2006, № 5, 63
4. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassaya with tobacco tissue cultures//Physiologia Plantarum, 1962, V. 15: 473-476.
5. Gambourg O.L., Elevegh D. Culture methods and detection of glucanases in suspension cultures of weat and parleys // Can.J.Biochem, 1968, 46: 417-421.
6. Матюшкина Т.Ю., Долгов C.B. Разработка методов регенерации и трансформации хризантем (Chrysanthemum morifolium Ramat). В сб.: Новые методы биотехнологии растений. Пущино, 1993: 34.
7. Гранда Р. Микроклональное размножение хризантем. Известие ТСХА, 2009, 1: 146-148.
Повышение устойчивости полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera L.)
к солям кадмия
к.б.н. доц. Гладков Е.А., Гладкова О.Н., Глушецкая Л.С.
Университет машиностроения 8 (499) 231-83-34, [email protected]
Аннотация. Разработан биотехнологический метод для повышения устойчивости городской газонной травы полевицы побегоносной к ионам кадмия в окружающей среде. Была выбрана следующая схема селекции - культивирование каллуса на среде МС с добавлением кадмия 10 мг/л в течение 2 пассажей, регенерация на среде МС с добавлением кадмия 20 мг/л, укоренение на среде МС при концентрации кадмия 30 мг / л. Всего в селективных условиях было получено 130 регенерантов полевицы, из которых 58 укоренились в почве. Устойчивость к кадмию сохранялась у семян одного из проверенных регенерантов в четырех поколениях.
Ключевые слова: кадмии, клеточная селекция, толерантность, полевица по-бегоносная
Город представляет собой экосистему, характерной особенностью которой является загрязнение окружающей среды. Городские растения - важнейший элемент экосистемы мега-
