CC BY
51
20. Титов А.Ф., Таланова В.В., Казнина Н.М., Лайдинен Г.Ф. Устойчивость растений к тяжелым металлам // Институт биологии КарНЦ Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007, 156 с.
21. Pen Е. Bonanza for Plant Genomics // Science, 1998, v. 282, p. 652-654.
22. Madlung A., Comai L. The effect of stress on genome regulation and structure // Annals of Botany, 2004, v. 94, p. 481-495.
Оценка фитотоксичности меди и получение стресс-устойчивых
двудольных растений
Седов К.А., Литвинова ИИ, к.б.н. доц. Гладков Е.А.
Университет машиностроения, ИФР РАН 8 (499) 231-83-34, ilina-15@ya.ru
Аннотация. Оценена фитотоксичность меди для целых растений и каллусных культур льна многолетнего (Linum perenne L.) и хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum L.). Определена селективная концентрация меди для этих растений, а также разработаны схемы селекции для получения устойчивых к меди растений-регенерантов.
Ключевые слова: медь, фитотоксичность, клеточная селекция, каллус, регенерация, хризантема, лен.
Высокий уровень загрязненности почв тяжелыми металлами (ТМ) в мегаполисах негативно сказывается на городских растениях, в частности на травянистых, декоративных, кра-сивоцветущих растениях, вызывает повреждение тканей, вытянутость клеток корней. При прямом попадании высоких концентраций данного металла на надземные органы растений, наблюдается скручивание и опадание листьев, молодые листья приобретают темно-зеленую окраску [1]. Наиболее восприимчивы к избытку меди молодые ткани и органы [2]. Повышенные концентрации меди в почве не только существенно снижают декоративные качества декоративных растений, но и могут приводить к гибели растений [3].
Среди способов решения данной проблемы - получение растений [4], устойчивых к солям меди, с помощью биотехнологических методов.
Цель работы - оценка влияния меди в условиях in vivo и in vitro для льна многолетнего (linum perenne L.) и хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum L.) и получение растений, толерантных к повышенному содержанию меди в окружающей среде.
Материалы и методы В работе использованы семена льна многолетнего (Linum perenne L.), сорт Синий Шелк и хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum L.), сорт Эльдорадо.
В качестве эксплантов использовали семена растений. Для получения устойчивых клонов каллусы культивировали на жидких питательных средах Мурасиге-Скуга (MC) и Гам-борга (В5) [5-6], содержащих медь в различных концентрациях. В питательную среду вносили токсикант в концентрациях от 10 до 100 мг/л (в пересчете на чистый металл) и культивировали в течение 14-30 суток, в зависимости от вида растения.
Оценку фитотоксичности меди in vivo проводили в нестерильных условиях, путем проращивания семян в растворах с медью на чашках Петри. Измеряли длину проростков, через 7 и 14 суток от начала опыта.
Результаты и обсуждения
Оценка фитотоксичности меди в условиях in vivo. Большинство декоративных травянистых растений не устойчивы к действию меди [4], как одному из самых токсичных ТМ. Была определена чувствительность к меди льна многолетнего и хризантемы килеватой.
Для оценки фитотоксичности меди, семена растений проращивали в растворе с токси-
кантом в течение 14 суток, токсическое действие данного металла существенно проявлялось при прорастании семян и было заметно уже через 7 суток. Ингибирование роста растений наблюдалось при концентрации меди 20 мг/л (в пересчете на чистый металл), а при концентрация 50 мг/л прирост составлял менее 40% у хризантемы килеватой, при концентрации 100 мг/л меди у растений не образовывались корни (рисунок 1).
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
Хризантема Эльдорадо Лен С иний Шелк
Г
Си 20 Си 30 Си 50 Си 100
Рисунок 1 - Влияние меди на рост побегов в водном растворе через 14 суток
Данные растения продемонстрировали очень высокую чувствительность к меди, по сравнению с рядом ранее исследуемых травянистых растений (представителями семейств злаковые, крестоцветные, бобовые и др.), наибольшей чувствительностью обладал лен многолетний.
Следовательно, данные красивоцветущие растения чувствительны к относительно низкому уровню загрязнения почв медью.
Оценка фитотоксичности меди в условиях in vitro. Для проведения клеточной селекции нужно было определить чувствительность каллусных культур льна многолетнего сорт Синий Шелк и хризантемы килеватой сорт Эльдорадо к токсиканту и выбрать селективную концентрацию для получения устойчивых растений.
Для оценки фитотоксичности меди в культуре клеток каллусы помещали на питательную среду с медью. Действие ионов меди было заметно через 14 суток, часть каллусов приобретало желтую или коричневую окраску. Ингибирующие действие меди проявилась для всех растений уже при концентрации 10 мг/л, а на среде с 40 мг/л значительная часть каллусов желтела и становилась менее плотной, в отличие от контроля. На высоких концентрациях меди (50 мг/л и 100 мг/л) каллус темнел через несколько дней и терял морфогенную активность, лишь у незначительной части каллуса наблюдался небольшой прирост биомассы (рисунок 2). Несмотря на большую чувствительность целых растений льна многолетнего (рисунок 1), культивируемые ткани льна были более устойчивы к меди, чем каллусы хризантемы килеватой. Например, при концентрации меди 30 мг/л процент выживших каллусов составлял 59,1%. Концентрация меди 100 мг/л была летальной для каллусов хризантемы килеватой. В следующем пассаже процент гибели каллусов резко возрастал у всех растений (рисунок 3).
Затем выжившие каллусы отбирали и вновь помещали на среду с медью.
Таким образом, при концентрации 20 мг/л меди у хризантемы килеватой и у льна многолетнего, после культивирования в течение 2 пассажей, выживала и сохраняла регенераци-онную способность только небольшая часть каллусов. При концентрации меди 30 мг/л, процент выживших каллусов и регенерационная способность, после 2 пассажей, был незначительный, концентрация меди 50 мг/л была летальной для обоих растений (рисунок 3). Таким
до so 70
образом, каллусные ткани льна многолетнего и хризантемы килеватой продемонстрировали очень высокую чувствительность к ионам меди, большую, чем у каллусов АгаЫ(1ор$\$ ¿ИаНапа и яЫот/ега.
1 оо
-Хрнэам юма кил cea юн
Леи многолетий
CulO CuZO СиЗО Cu¿0 Си50 CulOO ком цс> грация хсау, mfn
Рисунок 2 - Влияние меди на выживаемость каллусов (процент от контроля)
80 70 60 50 40 30 20 10 О
CulO CuZO СиЗО Си40
концентрация меди, мг/л
Рисунок 3 - Влияние меди на выживаемость каллусов исследуемых растений, во 2-м
пассаже (процент от контроля)
В качестве селективной была выбрана концентрация меди 20 мг/л для льна многолетнего и хризантемы килеватой. Полученные данные позволили нам разработать схемы клеточной селекции для исследуемых растений.
Получение клонов и растений, устойчивых к меди. Для отбора резистентных линий была использована прямая схема селекции.
Схема клеточной селекции для льна многолетнего включает в себя получение эксплан-тов из семян на среде для каллусообразования В5 с 6 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты; культивирование первичного каллуса на среде МС с 20 мг/л меди в течение 2 пассажей; затем, культивирование и регенерация каллусов на питательной среде В 5 с 1 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и 0,1 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК), в течение 3 пассажей, и укоренение на среде У2 МС с 0,1 мг/л НУК без токсиканта.
Учитывая очень высокую токсичность меди для хризантемы килеватой, а также для сохранения регенерационной способности клеток, был выбран короткий период культивирования каллусов на питательной среде с токсикантом (3 пассажа по 14-18 суток). Схема селекции включала в себя получение эксплантов из семян на среде для каллусообразования МС с 1 мг/л БАП и 0,1 мг/л индолилуксусной кислоты; культивирование первичного каллуса на среде МС с 20 мг/л меди в течение 3 пассажей; и затем культивирование каллусов, в течение 4 пассажей, на средах для регенерации Уг МС с 0,5 мг/л БАП и укоренение Уг МС с 0,1 мг/л НУК без токсиканта.
-Хризантема килеватая Лсчi многолелпий
Раздел 6. Инженерная экология и смежные вопросы
Использование прямой схемы клеточной селекции и добавление токсиканта в питательную среду только на этапе культивирования каллусов, позволило получит нам растения-регенеранты. Было получено 30 регенерантов льна, толерантных к меди, в условиях in vitro и 21 растение хризантемы килеватой.
Таким образом, нами было показано, что исследуемые объекты очень чувствительны к меди как на уровне целых растений, так и в культуре клеток. Разработаны схемы клеточной селекции для получения декоративных двудольных растений, устойчивых к меди.
Литература
1. Ладонина H.H., Ладонин Д.В. Загрязнение почв юго-восточного административного округа г. Москвы медью и цинком; Экология, 2000, № 1: 61-65.
2. Титов А.Ф., Таланова В.В., Казнина Н.М., Лайдинен Г.Ф. Устойчивость растений к тяжелым металлам; Институт биологии КарНЦ Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007: 156.
3. Гладков Е.А. Оценка фитотоксичности комплексного воздействия тяжелых металлов и определение ориентировочно допустимых концентраций для цинка и меди. Сельскохозяйственная биология, № 6, 33-36, 2010.
4. Гладков Е.А. ,Гладкова О.В. Оценка комплексной фитотоксичности тяжелых металлов и получение растений, обладающих комплексной устойчивостью, Биотехнология, № 1, 81-86, 2007.
5. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassaya with tobacco tissue cultures//Physiologia Plantarum, 1962, V. 15: 473-476.
6. Gambourg O.L., Elevegh D. Culture methods and detection of glucanases in suspension cultures of weat and parleys // Can.J.Biochem, 1968, 46: 417-421.
Введение в культуру клеток и получение растений брахикомы иберисолистной и хризантемы килеватой
Литвинова ИИ, к.б.н. доц. Гладков Е.А.
Университет машиностроения 8 (499) 231-83-34, ilma-15Cdiya.ru Аннотация. Введены в культуру клеток брахикома иберисолистная, хризантема килеватая. Подобраны оптимальные среды для каллусообразования, регенерации и укоренения растений-регенерантов.
Ключевые слова: каллус, регенерация, хризантема, брахикома.
Хризантема килеватая и брахикома иберисолистная широко используются в озеленении города, на клумбах, в миксбордерах, в срезке, обладают удивительной многоликостью красок и продолжительным цветением.
Хризантема килеватая (Chrysanthemum carinatum L.) - однолетнее, обильноцветущее, с конца июня по сентябрь, растение, семейство Сложноцветных (Астровые). Соцветия - корзинки, чаще простые, реже полумахровые или махровые, душистые, довольно крупные, 5-7 см в диаметре, различной окраски. Плод - треугольная или сплюснутая семянка с крыловидными выростами. Семена сохраняют всхожесть 2-3 года. Хризантему килеватую часто выращивают на срезку, поскольку ее привлекательные соцветия могут довольно долго стоять в вазе с водой не увядая. Кроме этого она может быть с успехом использована для украшения клумб и рабаток как в одиночных посадках, так и небольшими компактными группами[1].
Брахикома иберисолистная (Brachycome iberidifolia L) - однолетнее сильноветвистое растение, семейство Сложноцветных, высотой 15-25 см с изящными листьями, расположенными в очередном порядке. Кустики несут многочисленные мелкие соцветия - корзинки 3-3,5 см в диаметре. Применяется для оформления клумб, бордюров, альпийский горок, как
