CC BY
41
Физико-химическая биология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 236-240
УДК 575.113.2 + 578.825.1 + 616-006.66
ВСТРЕЧАЕМОСТЬ ОДНОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОЛИМОРФИЗМОВ -670A/G FAS, -1377G/A FAS И 564A/G DR3 ПРИ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ И РАКЕ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА
© 2012 г. О.В. Уткин1’2, Н.А. Сахарное2, И.Е. Шубинцееа2, В.Д. Старикова1,
Д.В. Новиков2, А.В. Алясова3, В.В. Новиков1,2
Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной 2Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского ^Нижегородская государственная медицинская академия
utkino2004@mail.ru
Поступила в редакцию 24.11.2011
Выполнен анализ встречаемости аллелей «А» и «G» в составе однонуклеотидных полиморфизмов -670A/G и -1377G/A, локализованных в промоторе гена Fas/CD95, а также 564A/G, идентифицированного в кодирующем сайт связывания с лигандом участке гена DR3/LARD, определяемых в крови здоровых волонтеров, при герпесвирусной инфекции и раке толстого кишечника. Полученные результаты носят предварительный характер и указывают на возможность существования связи между аллельными вариациями в составе однонуклеотидных полиморфизмов промоторного участка гена Fas/CD95 и развитием герпесвирусной инфекции и рака толстого кишечника. В отношении однонуклеотидного полиморфизма в кодирующем участке гена DR3/LARD такая взаимосвязь обнаружена не была.
Ключевые слова: герпесвирусы, рак толстого кишечника, апоптоз, однонуклеотидные полиморфизмы, Fas/CD95, DR3/LARD.
Введение
Одной из актуальных проблем современной медицины является высокая заболеваемость герпесвирусными инфекциями, приводящими к развитию иммунодефицитных состояний разной степени тяжести, а также возникновение рака толстого кишечника (РТК), занимающего одно из лидирующих мест в структуре онкологических заболеваний среди мужчин и женщин [1, 2]. В этой связи на первый план выходят мероприятия, направленные на выявление маркеров, вносящих вклад в предрасположенность к развитию заболевания, тяжести его течения, а также эффективности проводимой терапии. Перспективным направлением исследований в данной области является скрининг и характеристика однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), детектируемых в структуре генов, участвующих в реализации иммунного ответа
[3].
Одним из механизмов реализации иммунного ответа на вирусную инфекцию и опухолевый процесс является генетически программируемая гибель клетки (апоптоз). В регуляции иммунного ответа и апоптоза принимают участие трансмембранные рецепторы Fas/CD95 и DR3/LARD. Они экспрессируются на мембране иммуноком-петентных и других типов клеток и участвуют в
передаче цитотоксического сигнала [4, 5]. В структуре генов данных рецепторов идентифицированы ОНП, вносящие вклад в предрасположенность к развитию заболеваний разного генеза. Так, в промоторной области гена Fas/CD95 идентифицированы ОНП -670A/G и -1377G/A, аллельные транзиции в которых изменяют транскрипционную активность гена, что оказывает влияние на предрасположенность к развитию аутоиммунных воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта [6], плоскоклеточного рака головы и шеи [7], рака носоглотки [8], рака шейки матки [9] или на снижение предрасположенности к нему, как при инфицировании вирусом простого герпеса 2 типа [10]. Их наличие также определяет тяжесть и исход заболевания, например при немелкоклеточном раке легкого [11] и раке молочной железы [12]. В кодирующих участках генов также идентифицированы ОНП, как в случае гена DR3/LARD. Установлено, что ОНП 564A/G обнаружен в кодирующей последовательности 5 экзона гена DR3/LARD, что приводит к замене аспарагиновой кислоты на глицин в позиции 159 четвертого цистеинобогащенного домена. Такая аминокислотная замена нарушает структуру сайта взаимодействия рецептора с лигандом, что ограничивает активацию DR3/LARD и способствует развитию ревмато-
идного артрита [13]. Таким образом, наиболее широко в литературе представлена информация о взаимосвязи однонуклеотидных полиморфизмов -670A/G Fas, -1377G/A Fas и 564A/G DR3 с развитием аутоиммунных и онкологических заболеваний. Функциональная значимость данных полиморфизмов в отношении герпесвирусной инфекции, инициированной вирусом ветряной оспы, цитомегаловирусом и вирусом Эпштейна-Барр, а также рака толстого кишечника изучена недостаточно.
Учитывая вышеизложенное, цель настоящей работы - анализ взаимосвязи частоты выявления аллелей в составе однонуклеотидных полиморфизмов -670A/G Fas, -1377G/A Fas и 564A/G DR3 в крови при герпесвирусной инфекции и раке толстого кишечника.
Экспериментальная часть
Материалом исследования явилась периферическая кровь здоровых волонтеров, пациентов с герпесвирусной инфекцией разной этиологии, проходивших лечение на базе городской инфекционной больницы № 2 г. Нижнего Новгорода, а также больных РТК, поступивших на лечение в областной онкологический диспансер г. Нижнего Новгорода.
Выделение тотальной нуклеиновой кислоты из образцов периферической крови проводили с использованием фенол-хлороформенной экстракции [14]. Анализ аллельных вариаций в составе ОНП -670A/G Fas, -1377G/A Fas и 564A/G DR3 проводили с помощью разработанного нами метода аллель-специфической ПЦР. Продукты реакции детектировали с помощью электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле, содержащем флуоресцентный краситель бромид эти-дия.
Определение аллелей в составе изучаемых ОНП проводили в разных пробирках. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл. Реакционная смесь содержала 2.5 мкл 10Х ПЦР-буфера с содержанием ионов Mg2+ 1.5 мM («Силекс», Москва), 2 мкл раствора дНТФ («Силекс», Москва), 0.5 мкл Taq-полимеразы (ООО «ИнтерЛабСервис», Москва), по 0.5 мкл прямого и обратного праймеров для каждого ОНП (ЗАО «Синтол», Москва) и 16 мкл Н2О, свободной от нуклеаз. В дальнейшем к 22 мкл реакционной смеси добавляли 3 мкл суммарной нуклеиновой кислоты, каплю минерального масла и помещали в амплификатор «Терцик» (ЗАО НПФ «ДНК-технология», Москва).
Для выявления аллелей А и G в составе ОНП -670A/G и -1377 G/A гена Fas/CD95, а также
564A/G гена DR3/LARD были сконструированы праймеры, отличающиеся на один нуклеотид на З’-конце. Генотипирование по ОНП -670A/G и -1377G/А гена Fas/CD95, а также 564A/G гена DR3/LARD проводили с использованием прямых Fas670FA (5’-ggTTAACTgTCCATTC CAgA-3’) и Fas670FG (5’-ggTTAACTgTCCA TTCCAgg-3’), Fas1377FA (5’-TgTgTgCACAAgg CTggCACg-3’) и Fas1377FG (5’-TgTgTgCACA AggCTggCACA-3’), DR3FA (5’-CTACTCTgTT CCCgCAgAgA-3’) и DR3FG ^’-СТАСГС^ГГ CCCgCAgAgg-3’), а также обратных праймеров Fas670R (5’-TggCATgCTCACTTCAggTg-3’), Fas1377R (5 ’-TCTgCACCTCACTCTgCAACCT-3 ’) и DR3R6 (5’-CAgCgCTTgAgCATCTCgTA-3’) соответственно. Алгоритм амплификации искомых фрагментов включал: первоначальный прогрев смеси в течение 1 минуты при 94С, денатурацию ДНК в течение 30 сек при 94°С, температуру отжига праймеров при 67°С в течение 30 секунд, 67.5°С в течение 40 секунд, 61°С в течение 35 секунд для ОНП -670А^, -1377G/A и 564А^ соответственно, а также элонгацию в течение 40 сек при 72С. Количество циклов для одного раунда ПЦР составило 40.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ БХаИхИса V. 8.0. Данные представляли в виде относительных и абсолютных частот. Анализ различий частот признаков в группах проводили с использованием критерия различия частот (критерия %) и двустороннего теста точного критерия Фишера. Различия считали статистически значимыми прир < 0.05.
Результаты и их обсуждение
На первом этапе настоящего исследования проводилось генотипирование образцов периферической крови здоровых волонтеров, проживающих на территории Нижегородской области, по ОНП, локализованным в промоторной области гена Fas/CD95 и кодирующем участке гена DR3/LARD. Показано, что в образцах периферической крови здоровых волонтеров частота выявления генотипа -670АG статистически значимо в 15.3 раза и в 1.7 раза была выше, чем генотипа -670АА и генотипа -670GG (р < 0.001 и р = 0.009 соответственно) (таблица). В отношении генотипа -670GG частота выявления была статистически значимо в 8.8 раза выше, чем частота выявления генотипа -670АА (р < 0.001). Распределение генотипов по ОНП -1377G/A напоминало таковое по ОНП -670А^. Т.е. генотип -1377AG статистически значимо в
Таблица
Частота выявления аллелей А и G в составе ОНП -670A/G Fas, -1377G/A Fas и 564A/G DR3
Выявляемый генотип Здоровые волонтеры Пациенты с раком толстого кишечника Пациенты с герпесвирусной инфекцией
-670АА Fas 4% (2/51) G% (G/46) 9% (3/35)
-67GGG Fas 35% (18/51)* G% (G/46) 14% (5/35)**
-67GAG Fas 61% (31/51)* 1GG% (46/46)* 77% (27/35)*
-1З77АА Fas 2% (1/46) 22% (8/36) 14% (4/29)
-1377GG Fas 31% (14/46)* 3б% (13/36) бб% (19/29)*,**
-1377AG Fas 67% (31/46)* 42% (15/36) 2G% (6/29)**
564АА DR3 28% (16/57) 34% (13/38) 28% (17/61)
564GG DR3 2б% (15/57) 16% (6/38) 28% (17/61)
564AG DR3 4б% (26/57)* 5G% (19/38)* 44% (27/61)
* Статистически значимые различия внутри исследуемых групп (р < 0.05);
** статистически значимые различия по сравнению со здоровыми волонтерами (р < 0.05); точные значения уровня значимости (р) приведены в тексте статьи.
33.5 раза и в 2.2 раза превалировал над генотипами -1377АА и -137700 (р < 0.001 и р = 0.008 соответственно). Частота обнаружения генотипа -137700 статистически значимо в 15.5 раза была выше таковой для генотипа -1377АА (р = 0.003). По отношению к ОНП 564А/0 частота детекции генотипа 564АО статистически значимо в 1.6 раза и в 1.8 раза была выше, чем у генотипов 564АА и 56400 (р = 0.028 и
р = 0.049 соответственно). Таким образом, у здоровых волонтеров в составе ОНП -670А/0 и -1377 0/А гена Ра8/СБ95 частота выявления аллеля 0 была выше, чем аллеля А (-6700>А и -13770>А), а в составе ОНП 564А/0 гена БЮ/БАКО аллельные варианты А и 0 определялись приблизительно с одинаковой частотой (564А=0). При этом доминировал гетерозиготный вариант генотипа.
На следующем этапе работы проводился анализ встречаемости аллелей А и 0 в составе исследуемых ОНП у пациентов с герпесвирусной инфекцией, инициированной вирусом ветряной оспы, цитомегаловирусом и вирусом Эпштейна-Барр. У лиц, инфицированных гер-песвирусами, так же как и у здоровых волонтеров, превалировал гетерозиготный вариант генотипа -670А0 (таблица). Частота его выявления статистически значимо в 8.6 раза и в 5.5 раза превышала таковую для генотипов -670АА и -67000 (р < 0.001 для обоих сравнений). В отличие от здоровых волонтеров у пациентов с герпесвирусной инфекцией превалировал генотип -137700. Частота его обнаружения статистически значимо в 4.7 раза и в 3.3 раза была выше по отношению к генотипам -1377АА и -1377А0 (р = 0.002 и р = 0.008 соответственно). Так же как и у здоровых волонтеров, при герпесвирусной инфекции не выявлено различий в частоте выявления генотипов по ОНП 564А/0
гена DR3/LARD. Таким образом, в противоположность здоровым волонтерам, при герпесвирусной инфекции в составе ОHП -670А/G и ОHП 564A/G аллели А и G выявлялись приблизительно с одинаковой частотой, а в составе ОHП -1377G/A аллель G доминировал над аллелем А (-67GA=G, 564A=G, -1377G>A).
В дальнейшем нами осуществлялась детекция однонуклеотидных замен в составе полиморфизмов -67GA/G Fas, -1377G/A Fas и 564A/G DR в образцах периферической крови больных РТК Показано, что у больных РТ^ так же как у здоровых волонтеров и лиц, инфицированных герпесвирусами, доминировал генотип -67GAG (таблица). При этом гомозиготные генотипы -670АА и -67GGG в образцах крови больных не определялись. Генотипирование по ОHП -1377G/A позволило установить, что у больных РТ^ в противоположность здоровым волонтерам и пациентам с герпесвирусной инфекцией, статистически значимых различий в частоте выявления генотипов обнаружено не было. Показано, что у больных РТK частота выявления генотипа 564AG статистически значимо в З раза превышала таковую в отношении генотипа 564GG (p = G.GG2) и не различалась в отношении генотипа 564АА. Таким образом, у больных РТK доминировали генотипы -67GAG и 564AG. При этом аллельные варианты A и G в составе ОHП -1377G/A выявлялись приблизительно с одинаковой частотой (-1377G=A).
^ заключительном этапе работы нами проводился межгрупповой анализ встречаемости гомозиготных и гетерозиготного генотипов в составе исследуемых ОHП генов Fas/CD95 и DR3/LARD у пациентов с герпесвирусной инфекцией и больных РТK по сравнению со здоровыми волонтерами. ^ми показано, что при герпесвирусной инфекции частота выявления
генотипа -67000 статистически значимо в 2.5 раза снижалась по сравнению со здоровыми волонтерами (р = 0.034) (таблица). В отношении других генотипов статистически значимых различий обнаружено не было. У лиц, инфицированных герпесвирусами, в 3.4 раза снижалась частота выявления генотипа -1377А0 по сравнению со здоровыми волонтерами (р = 0.002). Наряду с этим, при герпесвирусной инфекции генотип -137700 детектировался в 2.1 раза чаще, чем у здоровых волонтеров (р = 0.004). В отношении ОНП 564А/0 статистически значимых различий обнаружено не было. Также не выявлено различий в частоте выявления аллелей «А» и «0» в составе ОНП 564А/0 гена БЮ/БАКО у здоровых волонтеров и больных РТК. В отношении ОНП -670А/0 и -13770/А гена СБ95/Ра8 наблюдалась иная картина. По сравнению со здоровыми волонтерами у больных РТК частота выявления генотипа -670А0 статистически значимо в 1.5 раза была выше (р < 0.001). При этом генотипы -670АА и -67000 в образцах крови онкологических больных не выявлялись. По данным литературы при РТК носители генотипа -670GG характеризовались меньшей выживаемостью по сравнению с больными, обладающими генотипами -670АА/А0 [15]. Распределение генотипов по ОНП -13770/А показало, что у больных РТК генотип -1377А0 статистически значимо в 2.1 раза встречался реже, чем у здоровых волонтеров (р = 0.032). В отношении остальных генотипов статистически значимых различий обнаружено не было.
Заключение
На данном этапе работы полученные результаты носят предварительный характер и свидетельствуют о том, что аллельные транзиции в составе однонуклеотидных полиморфизмов -670А/0 и -13770/А могут вносить вклад в развитие герпесвирусной инфекции и рака толстого кишечника. В отношении однонуклеотидного полиморфизма 564А/0 проведенный анализ не выявил зависимости частоты выявления соответствующих генотипов от развития герпесвирусной инфекции и рака толстого кишечника. Необходимо отметить, что малый объем выборки генотипированных больных обусловливает дальнейшее проведение исследований в данном направлении.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг. и Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 11-04-97088р_поволжье_а).
Список литературы
1. Баринский И.Ф., Шубуладзе А.К., Каспаров А.А., Гребенюк В.И. Герпес (этиология, диагностика, лечение). М.: Наука, 1986. 286 с.
2. Ананьев В.С., Кулушев В.М., Короткова О.В. и др. Иммунологическая коррекция препаратом гала-вит больных колоректальным раком // Рос. биотерап. журн. 2006. Т. 5. № 2. С. 81-84.
3. Zhang W., Wang W., Lu N. et al. FAS and FASLG polymorphisms and susceptibility to idiopathic azoospermia or severe oligozoospermia // Reprod. Bio-med. Online. 2009. V. 18. P. 141-147.
4. Рыжов С.В., Новиков В.В. Молекулярные механизмы апоптотических процессов // Рос. биотерап. журн. 2002. Т. 1. № 3. С. 5-11.
5. Screaton G.R., Xu X.-N., Olsen A.L. et al. LARD: A new lymphoid-specific death domain containing receptor regulated by alternative pre-mRNA splicing // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. V. 94. P. 4615-4619.
6. Ben Aleya W., Sfar I., Mouelhi L. et al. Association of Fas/Apo1 gene promoter (-670 A/G) polymorphism in Tunisian patients with IBD // World J. Gastroenterol. 2009. V. 15. P. 3643-3648.
7. Lei D., Sturgis M., Wang E. et al. FAS and FASLG genetic variants and risk for second primary malignancy in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2010. V. 19. P. 1484-1491.
8. Cao Y., Miao P., Huang Y. et al. Polymorphisms of death pathway genes FAS and FASL and risk of nasopharyngeal carcinoma // Mol. Carcinog. 2010. V. 49. P. 944-950.
9. Tamandani KM., Sobti C., Shekari M. Association of Fas-670 gene polymorphism with risk of cervical cancer in North Indian population // Clin. Exp. Obstet. Gynecol. 2008. V. 3. P. 183-186.
10. Chatterjee K., Dandara C., Gyllensten U. et al. A Fas gene polymorphism influences herpes simplex virus type 2 infection in South African women // J. Med. Virol. 2010. V. 82. P. 2082-2086.
11. Park Y., Lee K., Jung K. et al. Polymorphisms in the FAS and FASL genes and survival of early stage non-small cell lung cancer // Clin. Cancer Res. 2009. V. 15. P. 1794-1800.
12. Knechtel G., Hofmann G., Gerger A. et al. Analysis of common germline polymorphisms as prognostic factors in patients with lymph node-positive breast cancer // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2010. V. 136. P. 18131819.
13. Borysenko W., Furey F., Blair C. Comparative modeling of TNFRSF25 (DR3) predicts receptor destabilization by a mutation linked to rheumatoid arthritis // Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 328. P. 794-799.
14. Chomszynskii P., Sacchi N. Single - step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyonate -phenol-chloroform extraction // Analytical biochem. 1987. V. 162. P. 156-159.
15. Hofmann G., Langsenlehner U., Langsenlehner T. et al. A common hereditary single-nucleotide polymorphism in the gene of FAS and colorectal cancer survival // J. Cell Mol. Med. 2009. V. 9. P. 3699-3702.
FREQUENCY OF OCCURRENCE OF SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS -670A/G FAS, -1377G/A FAS AND 564A/G DR3 AT HERPES VIRAL INFECTION AND COLON CANCER
O. V. Utkin, N.A. Sakharnov, I.E. Shubintseva, V.D. Starikova,
D.V. Novikov, A. V. Alyasova, V. V. Novikov
In this study, we analysed the frequency of occurrence of «A» and «G» alleles in single nucleotide polymorphisms -670A/G and -1377G/A localized in the promoter region of the Fas/CD95 gene, as well as in 564A/G identified in the coding ligand-binding site of DR3/LARD that were detected in the blood of healthy donors, at herpes viral infection and colon cancer. The results obtained are preliminary and indicate the possibility of a link between allelic variations in single nucleotide polymorphisms in the promoter region of the Fas/CD95 gene and the development of herpes viral infection and colon cancer. For single nucleotide polymorphism in the coding region of the DR3/LARD gene, such a correlation has not been revealed.
Keywords: herpes viruses, colon cancer, apoptosis, single nucleotide polymorphism, Fas/CD95, DR3/LARD.
