CC BY
15
МЕДИЧНА ГЕНЕТИКА
© Барвшська О. Ю., Ольхович Н. В., Горовенко Н. Г.
УДК 575.07:616-053.2-008.9:612.015.348]-056.7-076
1,2Барв'шська О. Ю., 1Ольхович Н. В., 2Горовенко Н. Г.
ВСТАНОВЛЕННЯ РЕФЕРЕНТНИХ ЗНАЧЕНЬ КОНЦЕНТРАЦИ
СУКЦИН1ЛАЦЕТОНУ В СУХИХ ПЛЯМАХ КРОВ1 Д1ТЕЙ
1Лабораторiя медичноГ генетики НДСЛ «ОХМАТДИТ» МОЗ УкраГни (м. КиГв) 2Кафедра медичноГ та лабораторноГ генетики НМАПО iM. П. Л. Шупика (м. КиГв)
Дослiдження проведенi в рамках науково! теми кафедри медично! та лабораторно! генетики НМАПО iменi П.Л. Шупика «Визначення генетичних основ ризику розвитку патолопчних станiв на рiзних етапах онтогенезу», № державно! реестраци 0114и002215.
Вступ. Сукцинiлацетон - це промiжний метабол^ тирозину, який накопичуеться в кровi та сечi у хворих зi спадковим орфанним захворюванням тирозинемiя тип 1 внаслщок дефекту ферменту фумарилацетоацетат гщролази, який спричинений перебудовами в ген РАИ [13]. Даний маркер е специфiчним для тирозинемп тип 1, тому його використовують для пщтвердження цього дiагнозу при виявленн у пацiента пщвищено! концентраци тирозину в кровi [5,13]. У багатьох розвинених кра!нах свiту дiагностику тирозинемп тип 1 проводять в рамках масового неонатального скриншгу методом тандемно! мас-спектрометрп, вимiрюючи концентрацiю тирозину та сукцинтацетону в сухих плямах кровг Згiдно з даними лiтератури, критерiями бiохiмiчно! дiагностики тирозинемi! е концентра^я тирозину в сухих плямах кровi бiльше 180 мкмоль/л, а концентра^я сукцинiлацетону бiльше 5 мкмоль/л [11]. Однак використання в дiагностичнiй практик конкретно! лабораторi! референтних значень з лтературних джерел мае низку сво!х недолiкiв. Зазвичай, автори в публка^ях не вказують деталi аналiтичних та преаналiтичних етапiв при встановленнi нормативних показниюв. Серед таких, що впливають на кiнцевi результати визначення концентраци зазначених метаболiтiв, е метод i час забору матерiалу, особливостi аналогичного методу, умови зберiгання зразкiв до аналiзу та iншi. Окрiм того, вщмЫнють показникiв може бути зумовлена певними популяцмними особливостями, якi пови-ннi враховуватись при встановленнi референтних значень. Також бтьшють наявних у втьному доступi референтних значень е неповними, тобто розроблен тiльки для певного вку чи статi. Саме тому, вщповщно до рекомендацiй по встановленню референтних значень, якi були затверджен Мiжнародною федерацiею клiнiчно! хiмi! в 1987 роцi (!Р00), а по™ вдосконаленi в 2013 1нститутом клiнiчних та лабораторних стандартiв (01_Б!), кожна
д1агностична лаборатор1я повинна встановлювати сво! власн1 референтн1 значення показниюв, або ж проводити вал1дац1ю або адаптацю запозичених нормативних показник1в до нацюнальних [9].
Метою дослiдження було визначення референтних значень концентраци сукцинтацетону в сухих плямах кров1 дггей вком в1д 7 дн1в до 18 роюв з Укра!ни.
Об'ект i методи дослiдження. В досл1дженн1 були використан1 зразки сухих плям кров1 150 д1тей (в1ком вщ 7 дн1в до 18 роюв), серед них 90 хлопчиюв та 60 д1вчаток. У виб1рку були включен! д1ти з р1зних вщдтень Нац1онально! дитячо! спец1ал1зовано! л1карн1 «ОХМАТДИТ» (НДСЛ «ОХМАТДИТ») у яких було виключено д1агноз спадкового метабол1чного захворювання. Також в досл1дженн1 були проанал1зован1 сух1 плями кров1 трьох пац1ент1в з тирозинем1ею та трьох пац1ент1в з галактозем1ею. Досл1дження проводились в лабораторп медично! генетики НДСЛ «ОХМАТДИТ». Для роботи були отриман сформован згоди пац1ент1в, як1 були схвален Етичним ком1тетом НДСЛ «ОХМАТДИТ».
Процедура забору кров1 виглядала наступним чином: насамперед протирали 70% спиртом мюце проколу, витирали надлишки спирту сухою стерильною серветкою, щоб уникнути гемол1зу, проколювали подушечку пальця одноразовим скарифкатором, першу краплю кров1 зн1мали сухим стерильним тампоном, а до друго! перпендикулярно прикладали пап1р Whatman № 903, який повинен на-скр1зь просочитись кров'ю з обох сторш, щоб вигляд плям був однаковий з обох сторш. Пюля цього пляма кров1 повинна висохнути впродовж 4-ох годин в горизонтальному положены на чистм поверхн1, без стороннього впливу сонячних промеыв або тепла. До анал1зу зразки збер1гались при температур! +4 °С. В дослщження були взят1 сух1 плями кров1, як1 були набран! та збер1гались за вс1х належних умов.
Сукцинтацетон в сухих плямах кров1 визначався методом тандемно! мас-спектрометр!! з деривати-зац1ею на прилад1 API SCIEX 2000. Для визначення сукцинтацетону було використано наб1р реагент1в MassChrom® Amino Acids and Acylcarnitines from Dried Blood - LC-MS/MS виробництва Chromsystems (Н1-
меччина). Подготовка зразюв та вимфю-вання показникiв здiйснювалась зпдно з протоколом виробника реактивiв. З огля-ду на нестiйкiсть сукцинтацетону, аналiз сухих плям кровi проводився не тзнше, нiж через тиждень пiсля забору кровi [6].
Для аналiзу результатiв використо-вували статистичн методи, серед них: О критерм Дiксона, и критерiй Манна-УУты, метод 2,5 та 97,5 персентилей, критерм Шапiро-УIлка.
Результати дослiджень та Ух обговорення. Насамперед в цм робот було проведено розподiл загально! кiлькостi дiтей на вiковi пщгрупи (по 30 осiб): 0-2 мюяц^ 2 мiсяцi-1 рiк, 1-5 роюв, 5-10 рокiв та 10-18 роюв вiдповiдно до рекомендацiй МiжнародноI федераци клiнiчноI хiмiI (!РОО) та 1нституту клiнiчних та лабораторних стандартiв (О1_Б!) [9]. Такий розподiл на групи обумовлений визнаними в педiатричнiй практик вiковими змiнами метаболiзму. Зазвичай, особливо яскравi вiдмiнностi обмiну речовин спостертаються у новонароджених дiтей (група 0-2 мюяц^ та дiтей, якi знаходяться на грудному вигодовуванн (2 мюящ - 1 рiк). 1ншим особливим перюдом е статеве дозрiвання (10-18 роюв) [9]. Видiлення вiкових груп 1-5 роюв та 5-10 роюв пов'язане зi змЫою стввщно-шення вуглеводноУ i протешово! складово! рацюну харчування дiтей [10].
Розподiл значень рiвня сукцинiлацетону в сухих плямах кровi у всiх вiкових групах був перевiрений на нормальнiсть за критерiем Шапiро-УIлка, i було виявлено, що у всiх групах розподт не вiдповiдав розподiлу Гауса. Пюля цього в кожнiй групi був проведений аналiз на наявнiсть грубих похибок за критерiем Дiксона та виключення !х з загально! юлькост спостережень [4]. Було виключено ттьки одне значення з групи 10-18 роюв, де О становило 0,518, а Ост. =0,340 при р<0,05 (табл. 1).
Таблиця 1.
Значення р1вня сукцинтацетону у сухих плямах кров1 у в1кових групах д1тей
В1к Сукцинтацетон"^^^^ 7 дшв -2 м1с. 2 мю. -1 р1к 1 - 5 роюв 5 - 10 роюв 10 - 18 роюв
Мед1ана, мкмоль/л 2,04 1,82 1,76 1,24 1,38
Мш. - макс. значення, мкмоль/л 0,234,01 0,993,77 0,693,90 0,782,70 0,791,99
Ы-юльюсть ос1б в груп1 30 30 30 30 29
Аналiз отриманих результатiв визначення рiвня сукцинтацетону показав, що спостеркаеться тенденцiя до зменшення медiани концентрацп цього показника у кровi дiтей з вком. Але при порiвняннi областей значень за критерiем Манна-УУт^ було визначено, що мiж ними немае статистично достовiрно! рiзницi (р>0,05).
За рекоменда^ями !РОО та С1_Б! було також проведено розподт загально! юлькост дггей за статевою ознакою, дiвчаток було 59 оЫб, а хлоп-чиюв - 90 осiб. Розподiл значень концентрацм сукцинiлацетону в цих двох групах не вщповщав нормальному за критерiем Шатро-УУлка, тому для опису даних використовувались непараметричн критери. Медiана концентрацп сукцинiлацетону у вибiрцi дiвчаток становила 1,44 мкмоль/л, а у вибiрцi хлопчикiв 1,86 мкмоль/л. Однак при порiвняннi цих вибiрок значень рiвня сукцинiлацетону за критерiем Манна-УУтн було показано, що мiж ними не мае статистично достовiрно! рiзницi р>0,05. З огляду на отриман результати було вирiшено звести дан рiвня сукцинiлацетону усiх вiкових та статевих груп в одну, яка нараховувала 149 оЫб, а референты значення розраховувати без урахування вково! та статево! характеристики.
В цьому дослщженн було проведено визначення референтних значень на основi вибiрки в 149 оЫб
Таблиця 2.
Пор1вняльна характеристика референтних значень сукцин1лацетону за р1зними
показниками
Кража В1к референт1в Ктьюсть ос!б Мед!ана мкмоль/л Р1 (2,5-97,5 персентилО мкмоль/л Ои!^ мкмоль/л Л!м!т детекцп, мкмоль/л Джерело ¡нформацп
УкраУна 7 дн1в -18 роюв 149 1,81 0,77 - 3,87 0,56 Власш дослщження, 2017
Австрал1я 2-3 дж 104 0-0,3 0,5 ^ЬШБОП,2007 [2]
США 2 дн! 3199 -* <1-1,6 (99,5 персентиль) <2 1 Д11агс1, 2004 [1]
Сауд1вська Арав1я Новонароджен1 500 0,75 (99 персентиль) 0,2 ОБата У. Д1-01гЬазИ1, 2006 [8]
ОША 2 дн! 500 1,71 (95 персентиль) <5 3 Мадега, 2006 [11]
Канада 2 дн! 13 521 1,21 2,65 (95 персентиль) <5 Оо1етап, 2008 [3]
Австр1я 2-3 дн! 4683 0,66 <1,29 Ме!2, 2012 [6]
Примггка. * — Дан не представлен!.
вщповщно до рекомендацм IFCC та CLSI, за якими мЫмальна кшьюсть oci6 в rpyni повинна становити 120 oci6 [9]. nepeBipra на нормальнiсть за критерieм Шатро-У'шка показала, що pозподiл у данм вибipцi значень концeнтpацií сукцинiлацeтону не вщповщае нормальному, оскiльки p<0,0001. Тому були визначен нeпаpамeтpичнi показники, мeдiана, що становила 1,81 мкмоль/л, а також 2,5 та 97,5 персентилю якi окреслюють мeжi в яких знаходяться нормативы показники з достовipнiстю в 95% (табл. 2). Персентилю 2,5 вщповщало значення 0,77 мкмоль/л, а персентилю 97,5 вщповщало значення 3,87 мкмоль/л. Поpiвнюючи отримаш результати з наявними в лiтepатуpi варто сказати, що, на раз^ мiж референтними iнтepвалами piзних дослщниюв та значеннями верхньо' погранично'' мeжi (cutoff) iснують вагомi pозбiжностi (табл. 2). Насамперед це пов'язано з використанням piзних методик з piзною чутливютю, якi застосовували тi чи iншi автори. Зокрема, Magera та iншi зазначають, що íхнiй метод не чутливий в дiапазонi до 3 мкмоль/л сукциншацетону [11]. В той час, як Allard визначае, що лiмiт дeтeкцií за Тхшм методом становить 1 мкмоль/л, а за методом Osama Y Al-Dirbashi 0,2 мкмоль/л, а метод запропонований Johnson може вимipювати концeнтpацiю менше 0,5 мкмоль/л [1,2,8] (табл. 2). Лiмiт дeтeкцií методу, що застосовуеться в нашм лабоpатоpií становить 0,56 мкмоль/л. Окpiм того, при визначенш верхньо' погранично' мeжi автори використовують piзнi пiдходи, що також може бути одшею з причин таких pозбiжностeй. Тож з огляду на отримаш результати можна сказати, що референты значення сукциншацетону у сухих плямах кpовi д^ей з Укра'ни значно вiдpiзняються вiд зазначених у л^ератур^ оскiльки вони в 2 [1,11], а в деяких випад-ках i в 10 pазiв вищi [2]. Такi вiдмiнностi у референт-них значеннях можуть бути пов'язаш з особливостя-ми методу проведення самого аналiзу, пiдготовки, збер^ання матepiалу до аналiзу та його обрахунку.
Варто наголосити, що в основному в опублко-ваних дослщженнях для встановлення референтних значень аналiзували кров новонароджених дiтeй, оскiльки в бшьшост розвинутих кра'н свiту цей тест проводиться в рамках масового неонатально-го скриншгу. Оскiльки в Укра'ш на сьогоднi проводиться лише селективний скриншг спадкових порушень обмiну амшо-кислот, тобто piвeнь цього мета-болiту визначаеться у д^ей piзно-го вiку, нами було пpоаналiзовано значення piвня сукциншацетону у д^ей piзних вiкових груп вщ 7 днiв до 18 роюв. Зважаючи на отpиманi нами дан про вiдсутнiсть статис-тично достовipноí piзницi мiж piв-нем сукциншацетону в piзних в^ кових групах д^ей, отpиманi нами референты значення можна ви-користовувати, як для новонароджених, так i для старших дтей, а також для осiб з тиpозинeмiею, як лiкуються i проходять монiтоpинг.
Референты значення, отримаш в ходi цього дослщження, можуть бути екстрапольованi на всю Украшу, оскшьки були проаналiзованi зразки кровi дiтей з рiзних регiонiв Укра'ни.
Для дiагностики тирозинемп надзвичайно важливою е верхня межа референтного штервалу, тобто 97,5 персентиль, оскшьки саме пщвищення концентрацп сукциншацетону в сухих плямах кровi е пщтвердженням дiагнозу тирозинемiя. Якщо брати до уваги розраховаш нами референты значення, то концентра^я сукцинiлацетону у трьох па^ен^в з тирозинемiею, як ранiше були обстеженi в ла-бораторп медично' генетики НДСЛ «ОХМАТДИТ» була пiдвищена в 2-4 рази (табл. 3). Порiвняння референтного штервалу значень сукциншацетону з областю значень цього показника у па^ен^в з пщтвердженим дiагнозом тирозинемiя 1 типу показало, що вони не мають зон перекривання (рис.). Таким чином, використання розрахованих нами референтних значень дозволяе уникнути хибнопозитивно' або хибнонегативно' дiагностики тирозинемп 1 типу.
На сьогодшшнм день пщвищення концентрацп сукциншацетону в кровi та сечi вважаеться патогномошчним бiомаркером тирозинемп, однак в 2016 роц автори Yang, Al-Hertani та iншi показали, що сукциншацетон може зростати також при дефект ферменту мале'лацетоацетат iзомерази, хоча пщвищення рiвня цього метаболiту не таке виражене [7]. Використання розрахованих в цьому дослщженш референтних iнтервалiв при штерпретацп результатiв селективного скриншгу спадкових метаболiчних порушень показало, що схоже незначне зростання або знаходження на рiвнi верхньо' межi референтних значень було помiчено при обстеженш трьох дiтей з галактоземiею. У двох д^ей з галактоземiею спостер^алось також пiдвищення концентрацп тирозину, а в одного патента з галактоземiею сукцинiлацетон перевищував верхнiй лiмiт в 3 рази (табл. 3). Таю факти говорять про те, що тирозинемiя та галактоземiя потребують особливо уважно' диференцiйноí дiагностики.
На сьогодшшнм день, невiдомо об'ективних причин пщвищення концентрацп сукциншацетону
Рис. Розкид значень концентрацп сукциншацетону у сухих плямах кров1 в ос1б-референт1в, пац1ент1в з тирозинем1ею та галактозем1ею.
при галактоземи. Однак варто вщмггити, що пiд час nepe6iry галактоземiI та тирозинемiI виникае цта низка схожих симптомiв (нефромегалiя та гепатомегалiя), зв'язуючою ланкою патогенезу яких може бути порушення метаболiзму низки амшокислот, в тому числi тирозину, внаслщок чого i може пщвищуватись рiвень сукцинiлацетону. Зокрема автори Roth та Spencer показали, що сукцинтацетон здатен пригычувати транспорт глюкози та амшокислот в нирках щурiв, що ставало причиною глюкозури та амшоацидурп [5,12]. Данi симптоми спостерiгаються при обох патолопях, та такi твердження е лише припущеннями i вимагають експериментального пiдтвердження.
Висновки. В результат проведених дослiджень було встановлено референты значення в сухих плямах кровi дтей з Укра1ни вiком вщ 7 днiв до 18 роюв, якi вiдповiдають референтному iнтервалу вщ 2,5 до 97,5 персентиля i знаходяться в межах вiд 0,77 до 3,87 мкмоль/л. Дан референты значення дозволяють чiтко вiдрiзняти здорових пащетчв вiд пацiентiв з тирозинемiею, в яких рiвень сукцинiлацетону перевищуе верхню межу в 2-4 рази. У пащетчв з галактоземiею концентра^я сукцинiлацетону зазвичай знаходиться на рiвнi верхньо! межi референтного iнтервалу, але в окремих випадках може II перевищувати, що за-грожуе встановленням хибного дiагнозу. Показана важливiсть встановлення власних референтних значень для кожно! дiагностичноI лаборатори з
Таблиця 3. Концентращя сукцинiлацетону та тирозину в сухих плямах KpoBi пащен^в з тирозинемieю та гaлaктоземieю
№ Дiaгноз Тирозин, мкмоль/л (Р1 19-175) Сукцинтацетон, мкмоль/л (Р1 0,77-3,87)
1 Тирозинемля тип 1 1167 8,8
2 Тирозинемля тип 1 516 15,8
3 Тирозинемля тип 1 424 9,1
4 Галактоземля 266 13,7
5 Галактоземля 794 4,4
6 Галактоземля 72 3,7
урахуванням особливостей аналiтичного методу та бiологiчноI Bapia^i показникiв, оскiльки використання референтних значень, розрахованих для шших етнiчних груп та шших лaбоpaтоpiй може призвести до хибнопозитивних або хибнонегативних результа^в.
Перспективи подальших досл1джень. З огляду на гостру потребу у диференцмнм дiaгностицi тирозинеми та галактоземи плануеться проведення дослiдження для подальшо1 розробки критерив оцiнки pезультaтiв визначення сукцинтацетону та iнших метaболiтiв при цих патолопях.
^iTepaTypa
1. Allard P. Newborn Screening for Hepatorenal Tyrosinemia by Tandem Mass Spectrometry: Analysis of Succinylacetone Extracted from Dried Blood Spots / P. Allard, A. Grenier, M.S. Korson, T.H. Zytkovicz // Clinical Biochemistry. — 2004. — Vol. 37, № 11. — P. 1010-1015.
2. Analysis of Succinylacetone, as a Girard T Derivative, in Urine and Dried Bloodspots by Flow Injection Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry / D.W. Johnson, R. Gerace, E. Ranieri, M. Trinh, R. Fingerhut // Rapid Communications in Mass Spectrometry. — 2006. — Vol. 21, № 1. — P. 59-63.
3. Combined Newborn Screening for Succinylacetone, Amino Acids, and Acylcarnitines in Dried Blood Spots / T. Coleman, M.J. Magera, P. Allard, S. Tortorelli, D. Gavrilov, D. Oglesbee, K. Raymond, P. Rinaldo, D. Matern // Clinical Chemistry. — 2008. — Vol. 54, № 4. — P. 657-664.
4. Dixon W.J. Processing Data for Outliers / W.J. Dixon // Biometrics. — 1953. — Vol. 9, №. 1. — P. 74-89.
5. Effects of succinylacetone on the uptake of sugars and amino acids by brush border vesicles / P.D. Spencer, M.S. Medow, L.C. Moses, K.S. Roth // Kidney Int. — 1988. — Vol. 34, № 5. — P. 671-677.
6. Evaluation of a novel, commercially available mass spectrometry kit for newborn screening including succinylacetone without hydrazine / T.F. Metz, T.P. Mechtler, M. Merk, A. Gottschalk, R. Lukacin, K.R. Herkner, D. C. Kasper // Clinica Chimica Acta. — 2012. — Vol. 413. — P. 1259-1264.
7. Hypersuccinylacetonaemia and Normal Liver Function in Maleylacetoacetate Isomerase Deficiency / H. Yang, Al-H. Walla, D. Cyr, R. Laframboise, G. Parizeault, S.P. Wang, F. Rossignol, M.-T. Berthier, Y Giguure, P.J. Waters, G.A. Mitchell // Journal of Medical Genetics. — 2016. — Vol. 22. — P. 1-7.
8. Improved method to determine succinylacetone in dried blood spots for diagnosis of tyrosinemia type 1 using UPLC-MS/MS / O.Y Al-Dirbashi, M.S. Rashed, M. Jacob, L.Y Al-Ahaideb, M. Al-Amoudi [et al.] // Biomed. Chromatogr. — 2008. — Vol. 22. — P. 1181-1185.
9. Jung B. Clinical Laboratory Reference Intervals in Pediatrics: The CALIPER Initiative / B. Jung, A. Khosrow // Clinical Biochemistry. — 2009. — Vol. 42, № 16-17. — P. 1589-1595.
10. Muscle metabolism changes with age and maturation: How do they relate to youth sport performance? / N. Armstrong, A.R. Barker, A.M. McManus // Br J Sports Med. — 2015. — Vol. 49, № 13. — P. 860-864.
11. Quantitative Determination of Succinylacetone in Dried Blood Spots for Newborn Screening of Tyrosinemia Type I / M.J. Magera, D.G. Nishantha G.S. Houn Hahn, S. Tortorelli, A.M. Grant, S.I. Goodman, P. Rinaldo, D. Matern // Molecular Genetics and Metabolism. — 2006. — Vol. 88, № 1. — P. 16-21.
12. Renal Fanconi syndrome: developmental basis for a new animal model with relevance to human disease / K.S. Roth, M.S. Medow, L.C. Moses, P.D. Spencer, S.M. Schwarz // Biochim Biophys Acta. — 1989. — Vol. 11, № 1. — P. 38-46.
13. Succinylacetone as primary marker to detect tyrosinemia type I in newborns and its measurement by newborn screening programs / V.R. De Jests, B.W. Adam, D. Mandel, C.D. Cuthberth, D. Matern // Mol. Genet. Metab. — 2014. — Vol. 1. — P. 1-9.
УДК 575.07:616-053.2-008.9:612.015.348]-056.7-076
ВСТАНОВЛЕННЯ РЕФЕРЕНТНИХ ЗНАЧЕНЬ КОНЦЕНТРАЦП СУКЦИН1ЛАЦЕТОНУ В СУХИХ ПЛЯМАХ КРОВ1 Д1ТЕЙ
Барвiнська О. Ю., Ольхович Н. В., Горовенко Н. Г.
Резюме. В даному дослщжены було визначено концентрацт сукцинтацетону в сухих плямах KpoBi 149 дггей з рiзних регiонiв Укра1ни вiком вiд 7 днiв до 18 роюв методом тандемно! мас-спектрометрп. В результатi проведеного дослiдження було показано, що не iснуe статистично достовiрно,i рiзницi мiж концентрацieю сукцинтацетону у вкових вибiрках дiтей та вибiрках по статi, за критерieм Манна-УIтнi p>0,05. В ходi роботи було отримано наступи референтнi значення 0,77 та 3,87 мкмоль/л, як вщповщали 2,5 та 97,5 персентилю вiдповiдно. На основi отриманих референтних значень можна стверджувати, що концентра^я сукцинiлацетону в сухих плямах кровi у пацieнтiв з тирозинемieю в^^зняеться в 2-4 рази вiд верхньо! межi референтного iнтервалу (Р1), а у пащен™ з галактоземiею в бтышост випадкiв знаходиться на верхнм межi Р1.
Ключовi слова: сукцинтацетон, референтнi значення, тирозинемiя, дiти, тандемна мас-спектрометрiя.
УДК 575.07:616-053.2-008.9:612.015.348]-056.7-076
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕФЕРЕНТНЫХ ЗНАЧЕНИЙ КОНЦЕНТРАЦИИ СУКЦИНИЛАЦЕТОНА В СУХИХ ПЯТНАХ КРОВИ ДЕТЕЙ
Барвинская О. Ю., Ольхович Н. В., Горовенко Н. Г.
Резюме. В данном исследовании были проанализированы сухие пятна крови 149 детей из разных регионов Украины в возрасте от 7 дней до 18 лет методом тандемной масс-спектрометрии. В результате проведенного исследования было показано, что не существует статистически достоверной разницы между концентрацией сукцинилацетона в возрастных выборках детей и выборках по полу, по критерию Манна-Уитни p>0,05. В ходе работы были получены следующие референтные значения 0,77 и 3,87 мкмоль/л, соответствующие 2,5 и 97,5 персентилям соответственно. На основе полученных референтных значений можно утверждать, что концентрация сукцинилацетона в сухих пятнах крови у пациентов с тирозинемией отличается в 2-4 раза от верхней границы референтного интервала (РИ), а у пациентов с галактоземией в большинстве случаев находится на верхней границе РИ.
Ключевые слова: сукцинилацетон, референтные значения, тирозинемия, дети, тандемная масс-спектрометрия.
UDC 575.07:616-053.2-008.9:612.015.348]-056.7-076
DETERMINATION OF SUCCINYLACETONE CONCENTRATION REFERENCE VALUES IN CHILDREN DRY BLOOD SPOTS
Barvinska O. I., Olkhovich N. V., Gorovenko N. G.
Abstract. Succinylacetone is an intermediate metabolite of tyrosine and specific biochemical marker for inherited metabolic disorder tyrosinemia type 1. The fastest and the most convenient method for succinylacetone determination in dry blood spots is a method of tandem mass spectrometry, which is used in developed countries for mass neonatal screening of tyrosinemia type 1. For accurate interpretation of tests results it is necessary to use reference values that match the ethnic characteristics of the population, preanalytic and analytic phases of the diagnostics. Most of all available reference values in publications are incomplete because they are set for a specific gender or age. Therefore, it is important to define your own reference values that will match to your method peculiarities and ethnicity.
Purpose of the study. Determination of succinylacetone concentration reference values in dry blood spots of children aged from 7 days to 18 years in Ukraine.
Results and discussion. First of all in this paper was hold partition of the total number of children (150 people) into the age groups (30 people): 0-2 months, 2 months, 1 year, 1-5 years, 5-10 years and 10-18 years according to the recommendations of the International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) and the Institute for Clinical and Laboratory Standards (CLSI). Succinylacetone values in dry blood spots of all age groups were tested for normality by the Shapiro-Wilk criterion, and it was found that distribution in all groups is not consistent with Gaussian distribution. When compared succinylacetone concentration values in these groups by Mann-Whitney, it was determined that there are no statistically significant differences between all groups (p>0.05). After that we separate total number of children into two groups by gender. In our study was shown that between girls and boys there was no statistically significant difference by Mann-Whitney. According to such results it was decided to combine all the data into one group, which consisted of 149 people. Check for normality of combined data was made by Shapiro-Wilk criterion and showed that the distribution of the sample is not normal, p<0,0001. So it allowed to count the median - 1,81 |imol/l and 2,5 and 97,5 persentiles — 0,77 and 3,87 |imol/l that outline the limits with 95% confidence. Comparing the results with the available publications it is obvious that reference intervals and cutoff values of different authors are significantly different. Such differences in reference values can be related to the peculiarities of the method of analysis, preparation, and storage of material and calculations of the results. Reference values of succinylacetone concentration in dry blood spots of Ukrainian children which were determined in our study we observed the significant 2 times difference, and in some cases 10 times from reference values mentioned in the literature.
Increase of succinylacetone concentration in dry blood spots confirms the diagnosis tyrosinemia type 1. If we take into account the reference values calculated by us, the succinylacetone concentration of three patients with tyrosinemia type 1 that were previously examined in the laboratory of medical genetics NDSL «OKHMATDYT» showed
2-4 times increase. And in two children with galactosemia was observed a slight increase of the level or was close to the upper limit of succinylacetone reference values.
Conclusions. In this study succinylacetone concentration was determined in dry blood spots of 149 children from different regions of Ukraine aged from 7 days to 18 years by tandem mass spectrometry. As a result was shown that there was no statistically significant difference between the succinylacetone concentration in the age and gender groups of children by the Mann-Whitney criteria p>0,05. During the research were received the following reference values of 0,77 |imol/l and 3,87 |imol/l, which corresponded to 2,5 and 97,5 percentiles respectively. Based on the determined reference values we could affirm that succinylacetone concentration in dry blood spots of patients with tyrosinemia type 1 2-4 times exceeds the upper limit of the reference interval (RI), and in patients with galactosemia in most cases is at the upper limit of RI.
Keywords: succinylacetone, reference values, tyrosinemia, children, tandem mass spectrometry.
Рецензент — проф. Мщенко I. В. Стаття надшшла 01.02.2017 року
© Ольхович Н. В., Россоха З. I., ni4Kyp Н. О., Попова О. Ф., Горовенко Н. Г. УДК 616-056.7-07
1Ольхович Н. В., 2Россоха З. I., 34П1чкур Н. О., 2Попова О. Ф., 1,4Горовенко Н. Г.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧН1 ТА Б1ОХ1М1ЧН1 ФАКТОРИ
ФОРМУВАННЯ ФЕНОТИПУ ПАЦ1СНТ1В
З ХВОРОБОЮ ГОШЕ I ТИПУ
1ДУ 1нститут генетичноТ та регенеративно'!' медицини НАМН УкраГни (м. КиГв) 2ДЗ Референс-центр з молекулярноГ д1агностики МОЗ Укра'Гни (м. Ки'Гв) 3Центр орфанних захворювань НДСЛ «ОХМАТДИТ» МОЗ УкраГни (м. КиГв) 4Нацюнальна медична академ1я шслядипломно'Г осв1ти 1мен1 П. Л. Шупика (м. КиГв)
Представлена робота е фрагментом НДР «Оцш-ка ролi генетичних факторiв у формуванн та пере-б^ лiзосомних хвороб накопичення для оптимiзацiI ктмычно! та лабораторно! дiагностики цих захворювань» i виконана на базi ДУ «1ГРМ НАМН Укра!ни», № державно! реестраци 011511003006.
Вступ. Хвороба Гоше (ХГ) - це спадкове ауто-сомно-рецесивне захворювання, яке спричинене порушенням функци одые! з лiзосомних гидролаз -глюкоцереброзидази (ЕС 3.2.1.45) [19]. Недостатня активнють цього ферменту призводить до внутрш ньолiзосомного накопичення глюкозилцерамщу в клмтинах оргаызму, перш за все у вюцеральних макрофагах. Ктычно видтяють 3 типи ХГ на пiдставi наявност та ступеня прогресування невролопчних уражень. Ус три типи зазвичай маыфестують ге-патоспленомегалiею з накопиченням глкозилцера-мiду у макрофагах печшки, селезiнки, лiмфатично,i тканини та юсткового мозку [7].
Хвороба Гоше I типу (ненейронопатична) пред-ставляе собою найпоширеншу форму захворювання, яка не асо^юеться з неврологiчною маыфеста-цiею, але представлена широким спектром клмычно! презентаци, основними ознаками яко! е гепатоспле-номегалiя, цитопенiя та кiстковi ураження. Хвороба Гоше II типу - гостра нейронопатична - е найрщкю-ышою i характеризуемся тяжкими прогресуючими неврологiчними порушеннями, як можуть маыфес-тувати ранiше, ыж ураження вiсцеральних органiв,
i призводять до летального наслщку протягом перших двох роюв життя. До III-го хронiчного нейроно-патичного типу хвороби Гоше вщносять всi випадки захворювання з будь-якими невролопчними про-явами, якi не призвели до ранньо! смертi.
Характерною особливiстю спадкових метаболiч-них захворювань взагалi, i ХГ зокрема, е широкий кгл-нiчний полiморфiзм. Тяжкiсть клiнiчних проявiв симп-томiв та вiк початку захворювання широко варюють вiд практично асимптоматичних випадюв до тяжких Ывалщизуючих станiв, при яких вториннi гематоло-гiчнi та кiстковi змiни призводять до високо! частоти ускладнень, а нерщко i до смертi пащен^в [6]. Така широка варiабельнiсть кглычних проявiв захворювання i тяжкост перебiгу спостерiгаеться навiть серед пащен^в з однаковим генотипом [11]. Бтьше того, ю-нують клiнiчнi дефекти, якi представляють собою вто-ринн ураження, що можуть бути незалежн вiд ступеня внутрiшньолiзосомного накопичення метаболтв [7].
Зважаючи на те, що ктычна картина хвороби Гоше обумовлена цтим каскадом патогенетичних механiзмiв вщпов^ клiтини на накопичення глю-коцереброзиду, ключову роль серед яких в^гра-ють хронiчне запалення та оксидативний стрес, шдивщуальы особливостi тако! вщповд у кожного органiзму рiзнi, що обумовлено як генетичними, так i епкенетичними i середовищними факторами [12]. Так, вщомо, що ферменти родини глютатюн-S-тренсфераз (GST) являються важливою ланкою
