Вплив важких металів на біосинтез, активність літичних ферментів і ростостимулюючого фактора у Streptomyces recifensis var. Lyticus п-29 Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 579.8.+577.152.3.

Т. П. Кшочок, I. G. Соколова, Н. П. Чорногор,

О. А. Тимчук, I. В. Жерносекова Дшпропетровський нацюнальний уюверситет

ВПЛИВ ВАЖКИХ МЕТАЛ1В НА БЮСИНТЕЗ, АКТИВШСТЬ Л1ТИЧНИХ ФЕРМЕНТ1В I РОСТОСТИМУЛЮЮЧОГО ФАКТОРА У STREPTOMYCES RECIFENSIS VAR. LYTICUS П-29

Вивчали вплив важких метал ¡в на pier, бшеинтетичну актившеть, прояв лгтичноУ дп та ростостимулюючу актнвтеть компонентов ферментного комплексу Streptomyces recifensis var. lyticus. Було виявлено, то сол! свинцю позитивно впливають як на бшеинтез гщрол1тичних ензимт - лп-ичних ендопептидаз, протешаз, амьпаз, а також шдвищують ростостимулюючу актившеть по вщношенню до др1ждж1в.

Influence of heavy metals on growth, biosynthesis, lytic action and growthstimulating activity enzymes complex of Streptomyces recifensis var. lyticus was studied. It was showed that salt of plumbum' has positive influence as on biosynthesis hydrolases (lytic endopeptidases, proteinases, amylases) as well increase growthstimulating activity of preparation relatively the yeast.

3 лп-ератури вщомо, що лггичш фермента мжробного походження вщносяться до шдуцибельних, тобто \'х синтез залежить вщ умов культивування (рН-середовища, аерацп, температури та складу живильного середовища). Рашше встановлено, що штам Streptomyces recifensis var. lyticus e синтезатором складного комплексу бактерюл1зишв та стимулятором росту на середовищ1, до складу якого входять соеве борошно, глюкоза, NH4NO3, К2НРО4 та композищя йотв метал1в, як:, як вщомо, виступають в якоеп ¡ндуктор1в синтезу бактерюл1зишв, Для створення промислових технологш актуальним е пошук орипнальних продуцента ензим1в, отримання високоактивних штам1в, розробка та оптимпащя живильних середовищ, а також вивчення законом1рностей та мехашзм1в регуляцп бюсинтезу фермента залежно вщ умов культивування. Метою дано'1 робота було дослщити вплив деяких важких метал ¡в на бюсинтетичну зд1бшсть штаму, акти»исть #нзим1в та ростостимулюючий фактор.

MarepiaJin i методи

Об'ектом дослщження був штам Streptomyces recifensis var. lyticus [5]. Культивування проводили протягом 48-72 год при 28°С на ферментацшному середовищ! наступного складу (%): соеве борошно - 0,475; глюкоза - 0,07; NH4NO3 -0,075; К2НР04 - 0,016; СаСОэ - 0,23; СаС12 - 0,156; MgCl2-6H20 - 0,069; МпС12Н20 -0,1310"2; FeS04-7H20 - 0,76 10'2; ZnS04H20 - 0,19-10^ Об'ем колб - 750 мл, робочий об'ем - 100 мл, швидкють обертання - 220 об/хв. Про бюсинтетичну актившеть продуцента судили за ршнем бактерюл1тично1, протеолггичноУ, амшол1тичноУ дй та зд1бност( шактивованого при кип'ятшш препарату стимул ювати picT др1ждаав Candida guilliermondii.

Л1тичну активнють визначали турбщиметричним методом. За одиницю активносп приймали таку кшьшеть ферменту, що знижувала оптичну щшьшеть суспензн на 0,001 за 1 хв [6]. В якосп субстрата (тест-культур) бактерюлпичних ферменпв використовували вщмит! iHTaKTHi юптини Staphylococcus aureus 209Р, Micrococcus lysodeikticus.

Бшок визначали за методом Lowry, або спектрофотометричним методом.

© Кшочок Т. П., Соколова!, €., Чорногор Н. П., Тимчук О. А., Жерносекова I. В., 2005

j Qg Вкник Дншропетровського утверситету. Бюлопя, еколопя.

Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Sena Biologia, ekologia Visnyk of Dnepropetrovsk University. Biology, ecology. Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2005. 13(1). ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua

Протеолптну активнють визначали за методом Ансона в модифшацн Ав1женюа i Савщкайте [1].

Амшолггичну активность визначали за зд1бшстю ферменту а-амшази пдролвувати крохмаль [2].

Ферментш препарата отримували з культуральноТ рщини, звшьненоУ вщ мщелио центрифугуванням. Для видшення та фракцюнування ферменгпв використовували так1 методи, як осаджування б!гшв ацетоном, висолювання с1рчанокислим амошем та гельфшьтращю на сефадекы G-75 (Pharmacia, Швещя).

Ростостимулюючу дпо препарату визначали за його зд1бшстю (шсля термошактивацп ензим1в кип'ятшням протягом 15 хвилин) збшьшувати накопичення бюмаси тест-культури - С. guilliermondii на МПБ з глюкозою (2%).

Результата та ix обговорення

Для з'ясування впливу важких метал i в на биосинтез ферметтв проводили дв]' cepi'i експеримекпв. У першому випадку pÍ3HÍ концентрацп метал i в вносили при культивуванш стрептомщету на твердому середовшщ. В другому - метал вносився безпосередньо в рщке ферментацшне середовище культивування. В hkoctí контролю було взяте оптим1зоване середовище без додавання металле. Пюля проведения ферментацн визначали накопичення бюмаси, а також pi3Hi ферментативш активность Результата дослщжень приведет у табл. 1.

Враховуючи, що метали можуть чинити р1зний вплив на бюсинтез окремих ферменпв комплексу, /птичну актившсть визначали по вщношенню до двох тест-культур S. aureus та М. lysodeikticus, яю вщр1зняються будовою jüiíthhhoi ctíhkh. В Л1зиа стафшокока переважну роль вдограють л1тичш ендопептидази, в Л1зис1 мжрокока - л1тичш гл1козидази, зокрема л1зоцим.

Як видно з табл.1, лпична актившсть ферменпв по вщношенню до обох тест-культур значно знижуеться при внесенш метал1в у рщке ферментацшне середовище, причому найбшьш чутливими до токсично1! ди важких метал i в е, очевидно, глжозидази. Про це свщчить значке зниження лп-ично! активносп у вщношенш мкрокока. При додаванш йошв метал1в до твердого середовища були виявлеш íhidí 3aKOHOMÍpHOCTÍ. Так, виражений стимулюючий ефект йон1в свинцю (0,003 мг/мл) був виявлений по вщношенню до бюсинтезу фермештв, якi розчинюють kjiíthhh М. lysodeikticus, а йони цинку стимулювали синтез стафщолпгичних ензим1в. Щодо впливу метал ¡в на ростов! процеси, то максимальне накопичення бюмаси продуцента спостер!галося при внесенш до твердого середовища йошв РЬ2+ (у 1,5 раза), що корелювало з пщвищенням л1'тичноУ aKTHBHOCTi у вщношенш мпсрокока. Збшылеш показники виходу 6ioMacn були виявлеш також при внесенш у тверде середовище й шших металтв. Культивування продуцента в рщкому середовицц з додаванням йошв метал1в суттево не вщбивалося на накопиченш 6ioMacH, за винятком доомду з внесениям барда, який дектька шдвищував цей показник.

Як видно з табл. 1, внесения в поживш середовища дослщжуемих йошв метал1в по-р1зному впливае на зд1бносп штаму до синтезу шших пдролаз. Так, пpoтeoлiтичнa актившсть була повшстю вщсутня або значно знижена при внесенн1' як у тверде, так i в рщке середовища HgCl2j CdSC>4, Z11SO4, за винятком свинцю, який пщвищував актившсть протешаз у 1,5-1,6 раза (0,003 мг/мл), та барда, що незначно збшьшував протеолггачну актившсть при додаванш в тверде середовище (0,005 мг/мл). Под1бш результата щодо стимулюючоУ дн свинцю i барда були отримаш при вивченш амиолппчноТ активность Цей показник пщ впливом свинцю

Вiсник Днiпропетровського унiверситету. Бiологiя, еколопя.

Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seriä Biologiä, ekologiä . л«

Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology. * ^У

Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol.

2005. 13(1).

ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua

при оптимальних концентращях у рщкому та твердому середовищах збшыыився вщповщно у 2 та 3,2 раза, при додаванш барш в тверде середовище - у 1,5 раза. Також слщ вщзначити, що шгибуючий вплив на синтез даних фермент проявляють йони цинку, ям при внесенн1 в рщке середовище повнютю пригшчують актившсть проте'шаз та амшаз. Виняток складае Zn2+ у концентраци 0,001 мг/мл, який значно шдвшцуе активнють амшаз при внесенш в тверде середовище культивування.

Таблица 1

Вплив метал1В на бюсинтетичну спроможшсть штаму Streptomyces recifensis var. lyticus

Додавання метал!в до твердого середовища

доданий концент-рацш бюмаса, мг/мл Л1тична активность, од/мл±т протеолгеична актившсть, амшолпгична активнють,

елемент мг/мл S. aureus М. lysodeikticus % до К % до К

Контроль - 6,4 2500 ± 10 5 500+ 16 100 100

ВаС12 0,005 6,6 2 000 ± 40 5 333 + 33 111 153

0,05 8,7 1 700 ± 30 4 000 ± 33 6 74

ZnS04 0,001 6,4 2 830 ± 75 4 333 ±33 1Д 297

0,003 4,5 2 700 + 60 4 166±16 3 47

Pb(NO,)2 0,001 9,3 2100± 24 5 000 ±16 118 97

0,003 10,0 2 500± 50 6 500 + 30 151 322

Додавання металт при вирощуванш штаму в рщкому ссредоЕииц

ВаС12 0,005 6,0 1 166 ±46 1 600 + 06 0 19

0,05 8,6 1 100 ±06 1 500 ±21 13 101

Z,nS04 0,001 4,6 1 100+15 1 333 ± 16 0 0

0,003 5,8 1 400± 10 1 166± 15 14,8 0

PbfN03)2 0,001 6,2 1 000+ 16 1 100 + 23 0 148

0,003 7,3 1 500 ±16 2 000 + 33 159 202

HgCi2 0,0005 5,5 1 166 ±32 1 000± И 0 54

0,001 4,6 1 333 + 34 1 166 + 27 V. 0 . 0

CdS04 0,0005 6,5 1 000 ± 34 1 333 ±24 0 32

| 0,001 4,6 1 000 ±25 1 000±18 0 63

Узагальнюючи отримаш дан], слщ вщзначити, що йони Ва2+, Zn2+, Pb2+ мають важливе значения для формувакня фермента, що л^зують клгтини Staphylococcus aureus й Micrococcus lysodeikticus. Особливо велик}' роль вщ1грають йони свинцю, яю забезпечують високий синтез практично Bcix груп ферментов складного комплексу. 3 цим, напевно, пов'язаний i високий вмют бшка в данш культуршгьнш рщиш. Слад в1дм1тити, що дослщжуваний штам-продуцент був видшений з грунта ДшпропетровськоУ облает^ де зареестроваш тдвшцеш концентрацп важких метал ¿в. Це може пояснювати стшкють даного штаму до i'x токсично! да.

3 метою визчення вплкву свинцю на кшьюсний та ямсний склад ферментного комплексу було отримано 3 ацетонових препарата. Для цього стрептомщет вирохцували без додавання мегалу (контрольний вартнт), з додаванням свинцю (0,003 мг/мл) у тверде середовище з наступним глибинним культивуванням (анашз адаптацшних можливостей продуцента), а також з внесениям металу безпосередньо у рщке середовище (визначення впливу на бюсинтез ензим1в). Культуральну рщину по зак1нч1нн1 ферменташУ звшьняли вщ мщелйо та змшували з охолодженим

BicHHK ^mnponeTpoBctKoro yHiBepcHTeTy. Eionom, eKonoria. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Seria Biologia, ekologia Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology. Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2005. 13(1). ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua

ацетоном (1:2). Отримаш теля центрифугування осади розчиняли у 0,05М ацетатному буфер1 (pH 5,4) та фракцюнували на колонщ з сефадексом G-100.

Як показали результата фракцюнування, при додаванш важких метал ¡в у тверде та рщке середовища основний бшковий шк утворюеться у початкових фракщях (6-10), як i в контрольному зразку. Бшки цих фракцш складають приблизно 70% вщ загально'1 кшькосп елюйованого бшка. Бшков1 профш мають под1бну картину для Bcix трьох препаратов, але вмшт бшка в препаратах, отриманих при додаванш свинцю, в обох випадках перевищуе вмгст його у контроль Основна маса Л1тичних ензим1в зосереджена у фракщях з низькими концентращями бшка, причому Bei три препарата найбшьшу л1тичну актившеть проявляли по вщношенню до юптин мжрокока, але розподш niKiB з лггичною д1ею дещо вщр1знявся. Hi драку вання валового виходу лггичшх ензим1в, як! гщрол1зують icniTHHHi cTiHKH м1крокока, дало наступш результата: при вирощуванш продуцента без додавання металу - 28250 од/мл, при додаванш йошв свинцю у тверде та рщке середовище - 22970 i 37000 од/мл вщповщно. Це корелювало з пщвшценням кшькост! проте'шаз у останньому препарата Отримаш результата можуть евщчити про можливють шдукцй' синтезу лгшчних ендопептидаз при додаванш свинцю у ферментацшне середовище.

Враховуючи те, що екстрацелюлярний комплекс S. recifensis var. lyticus е багатокомпонентною системою, нас зацкавило, як впливають важк1 метали на OKpeMi лпичш фермента комплексу. Для цього була проведена додаткова очистка ензим1в, яка, окр1м перел1чених ранше метод1в, включала ще йонообмшну хроматографию на СМ-сефадексл С-50. У результат! було отриманно 5 окремих лггичних ендопептидаз, ям вщр1знялися молекулярною масою, електричним зарядом та субстратною специф1чшстю [4]. Визначали вплив важких меташв на прояв л1тичноТ дй ендопептидаз по вщношенню до двох тест-культур: S. aureus та М. lysodeiKticus. Як видно з табл. 2, е cyrreBi вщмшносп, з одного боку, мЬк окремими ферментами, з другого - в прояв! бактер1ол1тично\' дн по вщношенню до двох дослщжуваних тест-культур.

Таблиця 2

Залишкова лггична актившеть ендопептидаз шд впливом важких метал ¡в

Xiwi'ma сполука Шзис юитин Staphyl ococcus aureus, % до контролю

1 1 п | III 1 iv | V

Контроль 100 100 100 100 100

l.Pb(N03)2 436 360 448 130 280

2. CdS04 470 340 430 128 300

3. ZnS04 40 270 80 170 30

4. AgN03 20 32 160 30 15

5. CuS04 120 28 48 32 25

| JIi3HC kjiithh Micrococcus lysodeikticus, % до контролю

Контроль 100 100 100 100 100

1. Pb(N03)2 182 319 304 387 700

2. CdS04 104 195 236 60 238

3. ZnS04 104 119 161 253 23

4. AgN03 0 0 30 167 38

5. CuS04 162 287 247 207 613

Однак були вщм1чет деяк1 загальш законом!рност1. Так, ушверсальними активаторами ycix п'яти ендопептидаз були йони свинцю та кадмто, яю пщвищували лггичну актившеть до 130-700% вщносно контролю. Додатковими активаторами фракцп II та IV при nhnci стафшокока були йони цинку, для фракцн

Вiсник Днiпропетровського унiверситету. Бюлопя, еколопя.

Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Sena Biologia, ekologia

Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology. Ill

Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol.

2005. 13(1).

ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua

V - зшиза. При л1зис1 юптин М. lysodeikticus Bei п'ять ендопептидаз активувалися йонами мцц та свинцю (актившеть збшынувалась вщповщно до 162-613% та 182— 700% вщносно контролю). Кадмш пщвищував актившеть фракщй П, Ш i V (до 195-238%). Анал1зуючи отримаш дан!, слщ вщм1тити високий стушнь шдвищення лггичноУ активност1 тд впливом метал1в, що може евщчити про належшеть даноУ групи ензим!В до металопротетаз або про важливу роль металла у формуванш фермент-субстратного комплексу.

Оскшьки до складу ферментного комплексу S. recifensis var. lyticus входить ростостимулюючий фактор глжопротеУдноУ природи [3], було цжаво визначити, як впливають важю метали на його активHicTb. 3 щею метою було поставлено два дослщи. В першому випадку вирощували тест-культуру С. guilliermondii у м'ясо-пептонному бульйош (МПБ) з глюкозою (2%) в присутносп свинцю в ртзних концентращях (0,0001-1%), в другому дослщ до под1бноУ системи додавали ще прогрггий ацетоновий препарат з S. recifensis var. lyticus до кшцевоУ концентраци

0.08. (як джерело ростостимулюючого термостшкого фактора). Встановлено, що додавання у МПБ свинцю у концентращях вщ 0,0001 до 0,1% пригшчуе picT др1ждж1в на 24-35%, а пщвшцення концентраци металу до 1,0% значно знижуе накопичення бюмаси (на 69%>). Внесения в середовище ростостимулюючого компонента призводить до шдвищення показника бюмаси. Додавання ж свинцю у концентращях 0,0001, 0,001 та 0,01% ще бшьше гадвищувало ростостимулюючий ефект (на 23, 27 та 15% вщповщно) i навггь висок) концентращУ йошв свинцю (0,1 i 1,0%) практично не знижували npnpicT б^омаси. Таким чином, можна констатувати не т1льки наявн1сть ростостимулюючоУ дп ферментного препарату з S. recifensis var. lyticus, а ще й позитивний вплив свинцю на актившеть ростостимулюючого фактора.

Б1блшгра(|нчш посилання

1. Авиженис В. Ю. Некоторые свойства протеолитических ферментов препарата «Оризин ПК» / Авиженис В. Ю., Савицкайте И. М. // Труды АН Лит. ССР, £ер. В. - 1969. - Т. 2, №49. -С. 181-191. *

2. Асатиани В. С. Ферментные методы анализа. - М.: Наука, 1969.

3. Бабенко Ю. С. Обнаружение ростстимулирующего фактора в составе комплексного лизоэнзимного препарата / Ю. С. Бабенко, Н. В. Кукушкина, Н. П. Черногор, Д. Д. Жерносеков, В. С. Феденко // Биотехнология, - 1990. - № 4. - С. 26-29.

4. Соколова И. Е. Выделение и очистка логических протеиназ из Streptomyces recifensis var. lyticus 2435 / И. E. Соколова, Ю. С. Бабенко // Прикл. биохим. и микробиология. -1991.-Т. 27, № 1.-С. 53-60.

5. Шинкаренко JI. Н. Литические ферменты Actinomyces recifensis var. lyticus и условия, влияющие на их биосинтез. - Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 1979.

6. Isono М. Bacteriolytic enzymes and process for the production thereof / M. Isono, T. Takahashi, Y. Yamadzaki. - Patent №3649454. - 1972 (USA).

Надшита до редколеги 14.02.05

BicHHK ^HinponeTpoBCLKoro yHiBepcHTeTy. Eionoria, eKonoria. Visnik Dnipropetrovs'kogo universitetu. Sena Biologia, ekologia Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology, ecology. Visn. Dnipropetr. Univ. Ser. Biol. Ekol. 2005. 13(1). ISSN 2310-0842 print ISSN 2312-301X online www.ecology.dp.ua