CC BY
46
УДК 612.017.582.284.
Макаренко О.М., Рудик М.П., Позур В.В., Святецька В.М., Довгий Р.С. ВПЛИВ ПРЕПАРАТУ «КОРД1ЦЕПС I Л1НЧЖ1» НА КИСЕНЬ-ЗАЛЕЖНИЙ МЕТАБОЛ1ЗМ ФАГОЦИТ1В Р1ЗНИХ ПОПУЛЯЦ1Й.
Кш'вський нацiональний уыверситет iM. Тараса Шевченка, м. Кшв
Досл'джували вплив засобу «Кордцепс i Лiнчжi» на кисень-залежний метабол'зм перитонеальних макрофагiв мишей i мононуклеарiв кровi людини. Показано, що засб стимулював показники кисень-залежного метаболзму досл'джуваних фагоцитуючих клтин. Найбльше «Кордцепс i Лiнчжi» впливав на моноцити кровi людини, а саме внесення засобу в концентраци 200 мкг/мл стимулювало кисень-залежний метабол'зм в 50 раз у пор!внянн!' з контролем. Ключовi слова: «Кордщепс i ЛЫчжЬ>, мононуклеари KpoBi, перитонеальн макрофаги, кисень-залежний метаболiзм.
Вступ
1нтерес медицини саме до препара^в лiкувальних грибiв пов'язаний з появою наукових даних про 1хню ушкальну iмуномодулюючу дiю [1]. Протягом тривалого перюду вивчення лкувальних грибiв (50 рокiв вивчали дш гриба лiнчжi i 30 рош - дiю гриба кордiцепс) науковцями i3 них були видiленi окремi речовини, якi володiють важливими властивостями. Гриби кордщепс китайський (Cordyceps sinensis) i лiнчжi (трутовик лакований, Ganoderma lucidum) е потужними бiоенергетичними iмуномодуляторами швидко''' дй, володiють загальною змщнюючою дiею, сприяють пригнiченню розвитку пухлини i запобiгають поширенню метастазiв [1]. Вважаеться, що протипухлинна активнiсть Кордщепса реалiзуеться не внаслiдок прямо'' цитотоксично'' дй' на пухлиннi клiтини, а в результат iмуномодулюючо''' дй [2]. Тодi як протипухлинна активнiсть Лшчж1 реалiзуеться внаслiдок як iмуномодулюючо''' дй', так i прямо' цитотоксично' дй' на пухпинш клiтини [3].
Широкому спектру кштин органiзму властива цитотоксична дiя, що реалiзуеться за рахунок продукцп активних форм кисню. Серед таких клiтин особливе значення належить макрофагам, що локалiзованi переважно в тканинах [4-6]. У вщповщь на фагоцитоз патогешв або на контакт з розчинними патоген-асоцшованими молекулами, а також прозапальними цитокшами, у макрофапв розвиваеться система реакцiй, яка мае загальну назву «кисневий вибух» i в результатi яко''' утворюеться моновалентна похщна молекулярного кисню - супероксид-анюн. Наслiдком наступних реакцiй е поява шших токсичних метаболiтiв, таких як перекис водню, ппохлориста кислота (НОС1), гiдроксил-радикал та синглетний кисень [7,8].
Метою нашо''' роботи було дослщити вплив препарату «Кордiцепс i ЛшчжЬ> на кисень-залежний метаболiзм перитонеальних макрофапв мишей та мононуклеарiв кровi людини.
Матерiали та методи
Отримання мононуклеарiв периферично'' кровi людини проводили методом центрифугування в градiентi щiльностi [9]. Кров донора розводили вдвiчi забуференим розчином Хенкса (pH 7,2). Розведену кров нашаровували на сумiш фкол-верографшу (р = 1,078) i центрифугували 40 хвилин при 400g. Бте кшьце в iнтерфазi мiж плазмою та градiентом збирали, тричi вщмивали забуференим розчином Хенкса по 5 хвилин при 200g.
Для того, щоб отримати перитонеальн макрофаги з мишей, тваринам у черевну порожнину вводили по 5 мл середовища Хенкса та проводили масаж передньо' стшки черевно'' порожнини. По™ вщбирали суспензш клiтин, що утворилася, та вщмивали кпп~ини (1500 об/хв, 10 хв) [9]. Осад ресуспендували у 1 мл середовища Хенкса та доводили кшцеву концентрацш кттин до 3х10 клiтин/мл. Кiлькiсть життездатних кттин пiдраховували за стандартною методикою, використовуючи суправ^альне фарбування трипановим синiм.
Функцюнальну активнiсть клiтин визначали по вщновленню нiтросинього тетразолiю (НСТ). НСТ-тест проводили зпдно методики Передерiй В.Г. та ш. [10]. 100 мкл кл^ин перитонеального ексудату вносили в плоскодонний планшет в концентраци 3х105 в лунку. В дослщах використовували препарат «Кордщепс i Лiнчжi» (виробництва компани McAster, Укра'на, Сертифiкати UA1.003.X7862-13 вщ 17.07.2013 р.; иА.1.003.Х001638-13 от 15.02.2013 г.; иА.1.003.Х001637-13 от 15.02.2013 г.), в рщкому виглядi. Готували воды розчини засобу в трьох концентра^ях: 50 мкг/мл, 100 мкг/мл та 200 мкг/мл. В дослщш лунки вносили по 20 мкл розчину препарату. Для стимуляцй кисень-залежного метаболiзму використовували зимозан. 1нкубували впродовж 30 хв при 37°С для забезпечення адгезп макрофапв до поверхы пластику. У проби додавали 0,01 мл НСТ у концентраци 5 мкг/мл, та шкубували 15 хв при 37°С. Пюля чого осаджували штини центрифугуванням при 1500 об/хв протягом 10 хв. Супернатант вщбирали. Реакцш вщновлення нСт зупиняли додаванням 0,1 мл 2М КОН + 0,1 мл 50 % р-ну диметилсульфоксиду. Оптичну густину диформазану визначали на мiкроплейтфотометрi типу "Reader" при довжиш хвилi 630 нм. Для визначення вiрогiдностi вщмшносл показникiв мiж дослщом та контролем використовували t-критерiй Ст'юдента [11].
Результати та ïx обговорен ня
Додавання препарату в ycix концентра^ях призводило до значного пщвищення кисень-залежного метаболiзму мононуклеарiв периферично!' кровi людини у порiвняннi з контролем (рис.1).
1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
11Г
12 3
Вартнти доел¡ду
il
□ нестим О стимул
Рис. 1. Вплив препарату «Кордцепс \ Лiнчжi» на кисень-залежний метабол\зм мононуклеарiв периферичноI кров\ людини. 1 - контроль; 2 - препарат «Кордцепс i Лiнчжi» у концентраци 50 мкг/мл; 3 - препарат «Кордцепс i Лiнчжi» у концентраци 100 мкг/мл; 4 - препарат «Кордцепс i Лiнчжi» у концентраци 200 мкг/мл;
Примiтка: * - р<0,05 у пор!внянн!' з показниками контрольноI групи.
При додаванн препарату у концентраци 50 мкг/мл спостер^алося пщвищення спонтанного кисень-залежного метаболiзму у 20 разiв у порiвняннi з контролем. Додавання препарату у концентраци 100 мкг/мл призводило збтьшення показниюв у 22 рази, але мiж собою вплив цих концентрацм достовiрно не в^знявся. Максимально ефективною для активаци «кисневого вибуху» виявилася концентрацiя препарату 200 мкг/мл - в 50 разiв у порiвняннi з контролем та у 2 рази у порiвняннi з шшими концентрацiями препарату.
Препарат «Кордщепс i ЛшчжЬ> в поеднанн з класичним активатором кисень-залежного метаболiзму - зимозаном чинив також активуючий вплив на макрофаги в порiвняннi зi стимульованим контролем. Додавання препарату у концентра^ях 50 мкг/мл та 100 мкг/мл стимулювало д^ зимозана у 2,3 рази. Однак, достовiрноT рiзницi мiж стимульованими та не стимульованими зразками дослщжених концентрацм не було. Препарат у концентраци 200 мкг/мл посилював дiю зимозану у 4,4 рази в порiвняннi зi стимульованим контролем. Однак, в порiвняннi з показниками не стимульованих проб ^ет ж концентрацiT, показники були достовiрно нижчi.
Реакцiя макрофапв мишей на додавання препарату була подiбною до такоТ у мононуклеарiв периферичноТ кров1 людини (рис.2).
н С
* 2 -I 1.5 -
И У
С' 1
а
Е 0,5 -
и
о
Вариант дослщу
Рис. 1. Вплив препарату «Кордцепс i Лiнчжи» на кисень-залежний метабол\зм перитонеальних макрофаге мишей.
1 - контроль; 2 - препарат «Кордцепс i Лiнчжi» у концентраци 50 мкг/мл; 3 - препарат «Кордцепс i Лiнчжi» у концентраци 100 мкг/мл; 4 - препарат «Кордцепс i Лiнчжi» у концентраци 200 мкг/мл;
Примiтка: р<0,05.
Введення препарату у концентраци 50 мкг/мл призводило до пщвищення кисень-залежного метаболiзму в 14 разiв у порiвняннi з контролем. Найефективышими виявилися концентраци 100 та 200 мкг/мл, при додаванн котрих спостер^алося пщвищення метаболiзму макрофапв у 19 та 18 разiв, вщповщно, у порiвняннi з контролем та достовiрне пщвищення у порiвняннi з введенням препарату у концентраци 50 мкг/мл.
Висновок
Препарат «Кордщепс i ЛшчжЬ> здмснював стимулюючий вплив на кисень-залежний метаболiзм перитонеальних макрофапв мишей та мононуклеарних лейкоци^в кровi людини. Для моноци^в кровi людини найефективышою була доза у 200 мкг/мл, що призводила до посилення кисень-залежного метаболiзму у 50 разiв у порiвняннi з контролем. Найефективышими дозами, що
стимулювали «кисневий вибух» перитонеальних макрофагiв мишей, виявилися 100 та 200 мкг/мл, що посилювали кисень-залежного метаболiзму у 19 та 18 разiв вщповщно.
Лiтература
1. Перевозникова Н. И. Роль БАД на основе эффективных травяных формул (из истории тибетской медицины) / Н. И. Перевозникова, Е. М. Крепс, Л. Н. Шерстюк // Вюник ПолтавськоТ державно!' аграрноТ академп. - 2009. - №1. - С. 175 - 178.
2. Antitumor activity of an extract of Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. against murine tumor cell lines / [J. Yoshida, S. Takamura, N. Yamaguchi et al.] // Jpn. J. Exp. Med. - 1989. - 59(4). - P. 157-161.
3. Lin Z. B. Progress of studies on the antitumor activity and immunomodulating effect of Ganoderma / Z. B. Lin // J Peking Univ (Health Sci). -2002. - Vol. 34. - P. 493 - 498.
4. Iles K. E. Macrophage signaling and respiratory burst / K. E. Iles, H. J. Forman // Immunol Res. - 2002. - № 26 (1-3). - P.95 - 105.
5. Вершигора А.Ю. i сшвавт. 1мунолопя - К.: Вища шк., 2005. - 599 С.
6. Macrophages aquie neutrophil granules for antimicrobal activity against intracellular pathogens / [B. H. Tan, C. Meincen, M. Bastian et al.] // J Immunol. - 2006. - № 177. - P. 1864 - 1871.
7. Moilanen E. Nitric oxide in inflammation and immune response / E. Moilanen, H. Vapaatalo // Ann Med. - 1995. - №27 (3). - P.359 - 367.
8. Forman H. J., Torres M. Signaling by the respiratory burst in macrophages / H. J. Forman, M. Torres // IUBMB Life. - 2001. - №51 (6). - P.365 - 371.
9. Иммунологические методы / Под ред. Г.Ф. Фримеля ; пер. с нем. - М. : Медицина. - 1987. - 472 с.
10. Передерш В.Г. Основи внутршньоТ медицини / В.Г. Передерш, С.М. Ткач. - КиТв: Нова Книга. - 2010. - 1006 с.
11. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных / О.Ю. Реброва. - Москва: МедиаСфера. - 2002. - 312 с.
Реферат
ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА «КОРДИЦЕПС И ЛИНЧЖИ» НА КИСЛОРОДЗАВИСИМЫЙ МЕТАБОЛИЗМ ФАГОЦИТОВ РАЗЛИЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ
Макаренко А.Н., Рудик М.П., Позур В.В., Святецкая В.Н., Довгий Р.С.
Ключевые слова: «Кордицепс и Линчжи», мононуклеары крови, перитонеальные макрофаги, кислородзависимый метаболизм.
Исследовали влияние средства «Кордицепс и Линчжи» на кислородзависимый метаболизм перитонеальных макрофагов мышей и мононуклеаров крови человека. Показано, что средство стимулировало показатели кислородзависимого метаболизма исследуемых фагоцитирующих клеток. Наибольший эффект «Кордицепс и Линчжи» оказывал на моноциты крови человека, а именно внесение средства в концентрации 200 мкг/мл стимулировало кислородзависимый метаболизм в 50 раз по сравнению с контролем.
Summary
EFFECT OF "CORDICEPS AND LINCHZHI" ON OXYGEN-DEPENDENT METABOLISM OF PHAGOCYTES OF DIFFERENT POPULATIONS
Makarenko O.M., Rudyk M.P., Pozur V.V., Sviatetska V. N., Dovgiy R.S.
Keywords: "Cordiceps and Linchzhi", blood mononuclear, peritoneal macrophages, oxygen-dependent metabolism.
This paper presents the study aimed to investigate the effects produced by effect of "Cordiceps and Linchzhi" on oxygen-dependent metabolism of human peritoneal macrophages and blood mononuclears. It has been found out this medication stimulates the indices of oxygen0dependent metabolism of phagocytes under the observation. The most marked effect in produced by "Cordiceps and Linchzhi" on the human monocytes. The introduction of the medicine in concentration of 200 ^kg/ml increases the rate of oxygen- dependent metabolism in 50 times compared to the control group.
