CC BY
42БІОФІЗИКА
BIOPHYSICS
МОЛЕКУЛЯРНА БІОФІЗИКА
Фізика живого, Т. 18, No 3, 2010. С.5-13. © Каніболоцький Д. С.
MOLECULAR BIOPHYSICS
УДК 577.322.53
ВПЛИВ ОКИСНЕННЯ ЗАЛИШКІВ ЦИСТЕЇНУ НА КОНФОРМАЦІЙНУ РУХЛИВІСТЬ СУБФРАГМЕНТУ S1 МІОЗИНУ ІІ
Каніболоцький Д.С.
ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка, Київ, Україна
e-mail: kanibolotsky@univ.kiev.ua
Надійшла до редакції 11.02.2010
Побудована тривимірна модель субфрагменту 81 міозину ІІ скелетних м’язів кроля у пост-рігорній конформації. В якості шаблону застосовували файл з Протеїн дата банку 2шу8, що є кристалографічною структурою голівки міозину ІІ скелетних м’язів курчати. В каталітичний центр моделі розміщено MgАТФ. За допомогою пакету програм Огошас8 4.0.7 у часовому інтервалі 7 нс здійснено моделювання молекулярної динаміки субфрагменту 81 міозину ІІ з нативними залишками цистеїну та з залишками цистеїну окисненими до цистеїнової кислоти. Встановлено, що окиснений міозин має більшу конформаційну рухливість, ніж нативний. Проаналізовано вплив окиснення окремих залишків цистеїну на конформаційну рухливість субфрагменту 81 міозину.
Ключові слова: міозин ІІ, скелетні м’язи, огусію^ш сипісиїш, моделювання за гомологією, моделювання молекулярної динаміки, окиснення, тіольні групи.
ВСТУП
Значна кількість м’язових патологій, таких як алкогольна міопатія, м’язові травми, деякі форми м’язових дистрофій, викликають активацію вільнорадикального окиснення. Вільні радикали, окрім участі в регуляції запальної відповіді, через свою високу патогенну активність можуть безпосередньо пошкоджувати м’язові волокна та м’язові білки. Було показано, що вільнорадикальне окиснення впливає на фунціонування мязів, основою чого є модифікація скоротливих білків [1 - 3]. Однак детальний механізм впливу окиснення міозину на його функціональні характеристики і скоротливу здатність залишається остаточно не вивчений. Тому ціллю даної роботи було з’ясувати вплив окиснення залишків цистеїну у субфрагменті 81 міозину скелетних м’язів ссавців на конформаційну рухливість міозину.
Оскільки прямі експериментальні методи поки що не дозволяють безпосередньо прослідкувати вплив окиснення окремих амінокислотних залишків білка на його конформацію та рухливість у водному розчині, в нашій роботі використовували метод комп’ютерного моделювання молекулярної динаміки у пакеті програм вгошас8 4.0.7 [4]. На даний час не
закристалізовано голівки міозину ІІ ссавців. Тому на першому етапі роботи була побудова тривимірна
модель субфрагменту S1 міозину ІІ скелетних м’язів кроля. З усіх закристалізованих білків найбільш гомологічним до міозину ІІ скелетних м’язів кроля є міозин ІІ скелетних м’язів курчати: 93% подібності та 87 % ідентичності відповідно алгоритму BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi . Міозин ІІ скелетних м’язів кроля має всього дві вставки відносно міозину ІІ скелетних м’язів курчати: Ala629 та Ser637. Тому для побудови моделі міозину ІІ кроля в якості шаблону використовували файл з Протеїн дата банку (PDB) 2mys [5], що є тривимірною кристалографічною структурою голівки міозину ІІ скелетних м’язів курчати.
В субфрагменті S1 традиційно виділяють [6,7] N-кінцевий субдомен (в нашому випадку Met1-Gln28, Lys84-Ile199, His670-Cys699), субдомен SH3 (Lys36-Phe78), верхній субдомен вагою 50 кДа, скорочено «верхній субдомен 50k» (Leu218-Asp463, Glu605-Phe621), нижній субдомен 50k (Leu475-Lys600,
Ser652-Leu666) та конвертерний домен (Ser715-Leu785) (рис. 1). Інколи субдомен SH3 розглядають як частину N-кінцевого субдомену [6]. Крім власне субдоменів розглядають також з’єднувачі між ними [6]. Так, N-кінцевий субдомен та верхній субдомен 50k з’єднує петля 1 (Ala200-Thr217), верхній та нижній субдомени 50k з’єднують петля 2 (Leu622-Val651), так звана підпірка (Asp601-Asn604) та перемикач 2 (Ile464-Ser474). N-кінцевий субдомен та
конвертерний домен з’єднує а-спіраль SH1 (Leu703-Arg710). Центральною частиною голівки міозину є Р-складчастиій шар з сьоми Р-тяжів (1 - Ile115-Thr117,
2 - Cys123-Asn127, 3 - His670-Leu677, 4 - Asn172-Thr178, 5 - Tyr457-Asp463, 6 - Gly247-Gly255, 7 -Lys259-Tyr268). Перші 4 Р-тяжі відносять до N-кінцевого субдомену, останні три - до верхнього субдомену 50k. У зв’язуванні АТФ та його гідролізі беруть участь петля Р (Gly179-Lys185), перемикач 1 (Gly233-Phe246) і перемикач 2. Хімічна енергія гідролізу АТФ передається у механічну роботу руху міозину через перемикач 2, релейну спіраль (Leu475-Glu506) та конвертерний домен. За зв’язування з актином відповідають петля кардіоміопатії (Cys402-Asn418), петля 4 (Met364-Glu381) та петля 2. Зв'язок між АТФ-зв’язуючим та актин-зв’язуючим сайтами здійснюється за допомогою спіралей HO (Val419-Gln448), W (Ser652-Arg667) і HR (Ile532-Cys540).
Рис. 1. Субдоменна будова субфрагменту S1 міозину ІІ скелетних м’язів кроля.
У субфрагменті S1 міозину 2 скелетних м’язів кроля є 10 залишків цистеїну. Cys38 знаходиться в субдомені SH3, Cys123 та 676 - на другому і третьому Р-тяжах центрального Р-складчастого шару, Cys402 і 403 - на петлі кардіоміопатії, Cys479 - на N-кінці релейної спіралі, Cys522 - на спіралі 516-527 за релейною петлею, Cys540 - на спіралі HR (Ile532-Cys540), Cys699 - на С-кінці спіралі SH2 (His690-Cys699) перед спіраллю SH1, Cys709 - на спіралі SH1.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Для побудови моделі міозину ІІ кроля використовували сервер Swiss-Model [8] http://swissmodel.expasy.org/. До N кінця моделі добудовували три амінокислотні залишки: Met1, Ser2 та Ser3. С-кінець обрізали після залишку Leu785. Модель суміщали з тривимірною структурою міозину ІІ слизовика dictyostelium discoideum з MgАТФ у активному центі (файл PDB 1fmw) шляхом мінімізації суми квадратів відстаней між відповідними Ca атомами. Координати атомів Mg АТФ та 14 кристалографічних молекул води, що знаходяться на відстані не більше 0,5 нм від MgАТФ («залишки» 1113, 1157, 1172, 1226, 1227, 1273, 1274, 1275, 1276,
1278, 1306, 1372, 1375 і 1441) перенесено з файлу lfmw.pdb до файлу моделі міозину ІІ скелетних м’язів кроля.
Моделювання молекулярної динаміки проводилося на обчислювальному кластері Київського національного університету імені Тараса Шевченка http://cluster.univ.kiev.ua/ukr/. Методика проведення моделювання детально описана в роботах [9,10].
Для підтримки силовим полем 53 а6 [11] топології залишків цистеїнової кислоти (Cya), у файли ffG53a6.rtp, ffG53a6.hdb та aminoacids.dat внесені додаткові дані.
Моделі білка розміщували у віртуальних боксах у формі зрізаного октаедру. Мінімальна відстань від моделі білка до стінок боксу складала 1 нм, що дозволяло білку вільно рухатися та мінімізувало артефактну періодичність [12]. Розмір боксу для обох моделей (нативної та з окисненими залишками цистеїну) був однаковий: 2067,54 нм. Кожен бокс у відповідності до умов періодичної границі з усіх боків був оточений аналогічними боксами з такими ж самими молекулами білку. Розрахунок проводився лише для одного боксу, дані для інших боксів тієї ж системи транслювалися від першого боксу.
Для того, щоб прибрати грубі порушення структури білка, що могли виникнути при добудові перших трьох амінокислотних залишків та при перенесенні MgATФ і 14 молекул води з файлу 1fmw до моделі міозину ІІ скелетних м’ язів кроля, першу мінімізацію енергії білка проводили у вакуумі до додавання нових молекул води та іонів. Цю мінімізацію енергії здійснювали досить грубо, за алгоритмом «скоріший спуск» з початковим кроком 0,02 нм та без врахування далеких електростатичних взаємодій на відстані більше 1 нм.
Потім бокси з моделями голівок міозину заповнювали моделями молекул води SPC (Single Point Charge) [13]: у комірку з нативною структурою міозину до вже існуючих 14 кристалографічних молекул води додано ще 64643 молекули H2O, а у бокс з модифікованим білком - 64634 нових молекул розчинника. Для нейтралізації заряду системи та для моделювання іонної сили 0,09, у боксі з нативною структурою міозину ІІ кроля 104 не кристалографічні молекули води були замінені на іони натрію і 102 молекули H2O - на іони хлору, тоді як у боксі з окисненим білком 109 молекул води замінено на іони натрію та 97 молекул H2O - на іони хлору.
Наступний етап мінімізації енергії системи здійснювали почерговим використанням алгоритмів «скоріший спуск» та «кон’югований градієнт». Спочатку проводили 10000 кроків мінімізації енергії за алгоритмом «скоріший спуск» з початковим кроком 0,01 нм та обчисленням електростатичних взаємодій на відстані більше 0,9 нм за методом PME (Particle-Mesh Ewald electrostatics) [14]. Для Ван-дер-Ваальсових взаємодій встановлена відсічка 1,0 нм. Максимальний розмір комірок для розрахунку дальніх електростатичних взаємодій за методом PME дорівнював 0,12 нм, порядок інтерполяції дальніх
електростатичних взаємодій - кубічний. Потім здійснювали наступні 10000 кроків мінімізації, але так, що кожні 9 кроків мінімізація проводилася за алгоритмом «кон’югований градієнт», а кожний десятий крок - за алгоритмом «скоріший спуск». Інші параметри були такими ж, як і у попередній мінімізації енергії лише за алгоритмом «скоріший спуск».
Після цього на протязі 500 пс проводили врівноваження молекул розчинника. Важкі (не водневі) атоми білку та М§АТФ були прив’язані до своїх вихідних координат за допомогою додаткового гармонійного потенціалу. Вихідні швидкості атомів генерували з розподілу Максвела. Інтегрування рівняння руху здійснювали за допомогою алгоритму почергового випередження з кроком 10-15 с. Список ближніх атомів оновлювали на кожному кроці інтегрування. Для ближніх електростатичних
взаємодій встановлена границя відсічки 0,9 нм, тоді як для ван-дер-ваальсових взаємодій - 1,0 нм.
Електростатичні взаємодії за межами встановленої границі враховували згідно алгоритму PME. Максимальний розмір комірок у методі PME - 0,12 нм, порядок інтерполяції - 6. Температуру
підтримували рівною 293 К за допомогою термостату швидкостей змінного масштабу [15] з часом релаксації 0,1 пс. Тиск на рівні 1 атм. контролювали за методом Берендсена [16] з часом релаксації 0,3 пс. Координати атомів системи, швидкості та енергії записували у вихідні файли траєкторії кожну
пікосекунду.
Після врівноваження молекул розчинника проводили додаткову мінімізацію енергії системи на протязі восьми етапів, чергуючи мінімізацію за алгоритмом «скоріший спуск» та змішану мінімізацію з кожними дев’ятьма кроками за алгоритмом «кон’югований градієнт» та кожним десятим кроком -за методом «скоріший спуск».
Глибока мінімізація енергії дозволила проводити основне моделювання молекулярної динаміки без використання констрейнів, тобто будь-яких
додаткових обмежень відстаней між валентними атомами та валентних кутів, окрім безпосередньо передбачених силовим полем. Моделювання
молекулярної динаміки без констрейнів вимагає значно більшого машинного часу, але дає результати з більшим фізичним сенсом. Для того, щоб не вносити додаткові збурення у систему, початкової генерації швидкостей атомів перед основним моделюванням динаміки також не використовували. Для відтворення канонічного статистичного ансамблю NVT (постійні кількість часток, об’ єм і температура) не застосовували контролю тиску. Координати атомів системи та енергії записували у вихідні файли кожні 0,5 пс. Інші параметри були такими ж, як і при врівноваженні розчинника. Час врівноваження системи визначали як час досягнення плато на графіку середньоквадратичного відхилення поточної конформації відносно початкової.
Для візуалізації траєкторій та графічного аналізу конформацій міозину використовувалися програми VMD 1.8.7 [17] та Swiss-PDB Viewer [18].
В даній роботі з одержаних траєкторій розраховували наступні показники:
середньоквадратичне відхилення білку відносно вихідної конформації перед молекулярною динамікою за Са атомами (програма g_rms з пакету програм Gromacs), середньоквадратичні флуктуації Са атомів відносно їх середнього положення у часі (програма g_rmsf), площу поверхні, що доступна для розчинника, для SH груп залишків цистеїну (програма g_sas), відстані між двома атомами (програма g_dist), мінімальна відстань між двома групами атомів (програма g_mindist), кількість водневих зв’язків (програма g_hbond), енергія взаємодії між окремими групами атомів (програма g_energy) та кількість амінокислотних залишків у а-спіралі (програма g_helix).
Для розрахунку середньоквадратичного відхилення поточної конформації по відношенню до початкової структури, спершу поточні конформації накладали на початкову шляхом мінімізації суми квадратів відстаней між відповідними Са атомами, після чого вираховували власне середньоквадратичне відхилення для Са атомів за формулою [19]:
RMSD (t ) =
і(t )-r (t 0 )2
(1)
де t - час, mt - маса /'-того атома, M - загальна маса всіх атомів, за якими проводиться розрахунок середньоквадратичного відхилення, N - загальна кількість атомів, для яких розраховується середньоквадратичне відхилення.
Середньоквадратичне відхилення дозволяє визначити степінь змін, які потерпає макромолекула під час моделювання молекулярної динаміки, оцінити час досягнення рівноважного стану і загальну якість траєкторії.
Розрахунок середньоквадратичних флуктуацій (RMSF) Са атомів відносно їх середнього положення проводили на рівноважних ділянках траєкторій, коли графік середньоквадратичного відхилення
знаходиться на плато. Перед розрахунком RMSF поточні конформації білку накладаються на початкову за тими самими атомами, за якими й рахується RMSF. Власне середньоквадратична флуктуація Са атому на часовому інтервалі t0 - tn визначається за формулою:
RMSF (і ) =
1 tn
11
nt = t0
Ir (t )
n +1
(2)
де п + 1 - кількість моментів часу (фреймів) на ділянці
¿0 — ¿П
Водневі зв’язки в нашій роботі визначалися тоді, коли відстань між донором (електронегативним атомом О, N або 8, що ковалентно з’єднаний з атомом
2
2
2
водню) та акцептором (іншим електронегативним атомом) не перевищує 0,35 нм, а кут між акцептором, донором та атомом водню менше або дорівнює 30°.
Кількість амінокислотних залишків, що входять до а-спіралі, визначали за двогранними кутами ф та у і відповідними водневими зв’язками між карбонільними атомами кисню і NH групами основного ланцюгу протеїну.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Одержана в даній роботі модель міозину ІІ скелетних м’язів кроля з молекулою АТФ у каталітичному центрі показана на рис. 1. Розрахована траєкторія молекулярної динаміки субфрагменту S1 міозину ІІ скелетних м’ язів кроля з нативними залишками цистеїну для часового інтервалу 7000 пс. Розрахована площа, доступна для розчинника, для SH груп залишків цистеїну. Встановлено, що SH групи всіх десяти залишків цистеїну у субфрагменті S1 під час динаміки виявляють більшу за нуль площу поверхні, доступну для розчинника. Тобто всі ці залишки цистеїну можуть окислюватися. У вихідній моделі міозину ІІ кроля всі залишки цистеїну було добудовано до залишків цистеїнової кислоти, тобто атом водню біля атома сірки замінено на кисень та приєднано ще два атоми кисню з сумарним зарядом —1. Після мінімізації енергії та врівноваження розчинника, розрахована траєкторія молекулярної динаміки міозину з окисненими залишками цистеїну для 7000 пс. На рис. 2 співставленні графіки середньоквадратичних відхилень за Са атомами для цих двох траєкторій. З рисунка видно, що середньоквадратичні відхилення для нативного та окисненого міозину близькі. Однак графік для субфрагменту S1 з окисненими залишками цистеїну більш сильно коливається, таким чином окиснений субфрагмент як ціле виявляє трохи більшу конформаційну рухливість, ніж нативний. Графіки середньоквадратичних відхилень для нативного та окисненого білку виходять на плато, тобто система досягає рівноважного стану, при 2550 та 2050 пс, відповідно. Для часового проміжку 2550-7000 пс, що є рівноважним для обох траєкторій, розраховано середньоквадратичні флуктуації кожного Са атому окремо відносно середнього положення цього атома на дослідженій ділянці траєкторії (рис. 3a).
З рис. 3а видно, що у нативному субфрагменті S1 міозину II найбільш рухливими амінокислотними алишками (RMSF > 0,15 нм) є Met1-Ser3, Ala5 (N-кінець), Gln53-Thr61, Lys63, Leu65-Thr69, Thr71, Asn73-Ser74 (субдомен SH3), Asp204-Lys206, Glu208-Gly212 (петля 1), Gln370-Gln374 (петля 4), Lys407-Val413 (петля кардіоміопатії), Glu509-Trp510 (релейна петля Gly507-Phe515), Ala521-Cys/Cya522 (частково розплетена а-спіраль Gly516-Glu527 після релейної петлі), Lys544 (петля Met541-Thr546), Asp556-Gln557, (частково
розплетений С-кінець а-спіралі Asp547-His558), Leu559-Lys561 (петля Leu559-Asn563), Lys567-Ala575 (петля 3 Lys567-His578), Gly586-Thr587 (кінчик ß-шпильки Phe579-Tyr590), Gly628-Gly645 (петля 2), Ser752-
0.30
I 0.25
S
! 0.20-
І0.10
2 0.05-
X
і 0.00-U I
нативний білок окиснений білок
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
Час, пс
Рис. 2. Середньоквадратичні відхилення за Са атомами субфрагменту 81 міозину ІІ скелетних м’язів кроля відносно початкової конформації перед основним моделюванням динаміки.
0.40 Н 0.36-
0.322 0.28-
нативний білок окиснений білок
200 400 600 800
Номер амінокислотного залишку Рис. 3. Середньоквадратичні флуктуації (RMSF) кожного Са атому субфрагменту S1 міозину ІІ скелетних м’язів кроля відносно середнього положення цього атома на ділянці траєкторії 2550-7000 пс. (a) Значення RMSF для нативного (чорна лінія) та окисненого (червона лінія) протеїну. (b)
Різниці між середньоквадратичними флуктуаціями нативного та окисненого білку.
-Asp754 (конвертерний домен), Leu785 (C-кінець). У міозині II з окисненими залишками цистеїну найбільш рухливими є такі амінокислотні залишки: Met1-Ser3 (N-кінець), Asp43-Lys44, Asn57-Lys59, Leu65-Asp67 (субдомен SH3), Glu208-Met214 (петля 1), Lys369-Glu373 (петля 4), Lys407-Tyr412 (петля
кардіоміопатії), Glu509 (релейна петля), Gly560-Asn563 (петля His558-Asn563), Asn564 (перший залишок ß-тяжу Asn564-Gln566), Lys569-Lys574
(петля 3), Ala627-Ala629, Ala631-Gly641 (петля 2), Ala731-Asp741, Lys743-Asn744, Asn751-Asp754,
Asp756-Glu758 (конвертерний домен), Lys784-Leu785
(C-кінець). Графік середньоквадратичних флуктуацій для двох модифікацій міозину подібний, тобто практично ті самі ділянки протеїну проявляють високу або низьку рухливість як для міозину II з нативними залишками цистеїну, так і для білку з окисненими цистеїнами. Але є й розбіжності (рис. 3 b та 4). Так, у нативному міозині більш рухливими (різниця між середньоквадратичними флуктуаціями Ca атомів нативного та окисненого міозину II більше або дорівнює 0,04 нм) є залишки Lys22, Glu26 (N-кінцевий домен), Lys36, Gln53-Thr61 (субдомен SH3), Asp204-Lys206, Gln209 (петля 1), Val315-Ser316 (неструктурована ділянка Leu304-Asp326), Asp471
(перемикач 2), Ala520-Cys/Cya522 (частково розплетена а-спіраль Gly516-Glu527 після релейної петлі), Asp556 (а-спіраль Asp547-His558), Gly586-Thr587 (ß-шпилька Phe579-Tyr590), Asp601 (підпірка), Glu630, Gly636-Ser637, Lys643-Lys644 (петля 2). Тоді як у окисненому протеїні більш рухливими, ніж у нативному міозині II (ARMSF < -0,04 nm), є Arg371 (кінчик петлі 4), Lys407-Asn410 (петля
кардіоміопатії), Asn563 (петля Leu559-Asn563),
Asn564 (ß-тяж Asn564-Gln566), Ala627, Asp633 (петля 2), Lys743-Asn744, Glu747, Ile753, Asp756-Gln759 (конвертерний домен) та Leu785 (C-кінець).
Рис. 4. Тривимірна будова окремих фрагментів субфрагменту S1 міозину II скелетних м’ язів кроля, конформаційна рухливість яких залежить від взаємодії з залишками цистеїну. Червоним кольором показані ділянки, на яких різниця між середньоквадратичними флуктуаціями Ca атомів для нативного та окисненого білку (ARMSF) більше або дорівнює 0,04 nm, синім кольором - ділянки з ARMSF < -0,04 nm. Примітка: a,b,c,.. .h - пояснення у тексті.
Sy Cys/Cya38 - O Phe39
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 Ca Cys/Cya540 - Ca Asn599
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
Час. пс
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
N Cys/Cya676 - O Thr178
0 1 000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 Час, пс
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
Рис. 5. Зміна відстані між окремими атомами та групами атомів міозину II під час моделювання молекулярної динаміки. Чорні криві - дані для нативного білку, червоні - для міозину з окисненими залишками цистеїну. a-u,x - відстань між двома вказаними атомами, v,w - мінімальна відстань між двома групами атомів. Примітка: a,b,c,.x - пояснення у тексті.
Різниці між середньоквадратичними
флуктуаціями Са атомів нативного та окисненого міозину пояснюються наступним чином.
Залишок Су838 знаходиться на першому Р-тяжі субдомену 8Н3, який являє собою Р-діжку з 5 Р-тяжів та приєднаний з обох боків до К-кінцевого субдомену. 8Н група залишку Су838 утворює водневий зв’язок з карбонільним киснем залишку РЬе78 (рис. 4а). Заміна тіольної групи на 803- викликає збільшення відстані між у-атомом сірки залишку 38 та карбонільним киснем залишку РЬе78 (рис. 5а). Також у нативному білку 8Н група Су838 спорадично утворює водневий зв'язок з карбонільним киснем РЬе39 (рис. 4Ь). Поява сульфогрупи замість тіольної групи робить утворення цього зв’язку неможливим (рис. 5Ь). Зміна орієнтації бокового ланцюгу залишку 38 призводить до переорієнтації основного ланцюгу та до послаблення водневого зв’язку між карбонільним киснем залишку 38 та КН групою в1у50 (рис. 5с). Одночасно спостерігається підсилення водневого зв’язку між киснем основного ланцюгу 8ег54 та КН групою ТЬгб1 (рис. 5ф.
Залишки Су8402 та Су8403 знаходяться на петлі кардіоміопатії (Су8/Суа402-Л8п418) (рис. 4с). Заміна 8Н групи залишку Су8402 на сульфогрупу призводить до розриву водневого зв’язку з атомом кисню Л1а375, що на петлі 4 (рис. 5е). В нативному міозині час від часу утворюється водневий зв'язок між 8Н групою Су8403 та карбонільним киснем Су8402. При переході залишку 403 від цистеїну до цистеїнової кислоти цей зв'язок утворюватися вже не може (рис. 5£). Крім того, сульфогрупа залишку 403 відштовхується від атому кисню є 01п374 (рис. 5§). Одночасно віддаляються Са атоми цих залишків (рис. 5Ь). Таким чином при окисненні міозину петля кардіоміопатії та петля 4 стають більш рухливими. Оскільки петля 4 та петля кардіоміопатії беруть безпосередню участь у з’єднанні з актином, тому зміна рухливості цих петель може призводити до зміни спорідненості міозину до актину та до змін у м’язовому скороченні.
Су8479 знаходиться на релейній спіралі за перемикачем 2 (рис. 4ф. КН група залишку Су8479 утворює водневий зв’язок з атомом О залишку Ьеи475. Модифікація цистеїну 479 у цистеїнову кислоту призводить до відштовхування сульфогрупи залишку 479 від атому кисню Ьеи475. Таким чином змінюється орієнтація як бокового ланцюга Су8/Суа479, так і основного ланцюга, що призводить до руйнації водневого зв’язку між залишками 479 і 475 (рис. 5і). Це викликає часткове плавлення N кінця релейної спіралі та переорієнтацію перемикача 2. Оскільки перемикач 2 бере участь у розщепленні молекули АТФ, а релейна спіраль - у силовому ході актоміозину, модифікація Су8479 може впливати на обидва процеси.
Залишки Су8522 і Су8540 входять до складу спіралі 01у51б-в1и527 і спіралі НЯ (І1е532-Су8540) відповідно (рис. 4е). Заміна тіольної групи на сульфогрупу у залишку 522 викликає відштовхування
від карбоксильної групи глутамінової кислоти 485 (Ірис. 5_|), яка знаходиться на релейній спіралі. Також збільшується відстань між Са атомами цих залишків (рис. 5к). Перехід Су8540 у цистєїнову кислоту спричиняє відштовхування сульфогрупи від атому кисню 5 залишку Л8п599 (рис. 51). Одночасно має місце розходження Са атомів залишків 540 та 599 (рис. 5т). Це впливає на рухливість спіралей 01у51б-01и527 та Л8р547-НІ8558, петлі Ьеи559-Л8п5б3 та підпірки. Слід зауважити, що підпірка розділяє верхній та нижній субдомени 50к, взаємний рух яких важливий для зв’язування актину, зв’язування АТФ та вивільнення продуктів гідролізу, тому зміна конформації підпірки може впливати на всі ці процеси.
Залишок Су8б7б входить до третього Р-тяжу центрального Р-складчастого шару. Сусідній, четвертий Р-тяж Л8п172-ТЬг178, переходить у петлю Р (01у179-Ьу8185), важливу для зв’язування АТФ та вивільнення продуктів його гідролізу (рис. 4£).
Сульфогрупа цистеїнової кислоти б7б відштовхується від карбонільного кисню залишку 01у184 на петлі Р (рис. 5п). Також при окисненні міозину розривається водневий зв'язок між КН групою залишку Су8б7б та карбонільним киснем ТЬг178 (рис. 5о), що впливає на конформацію центрального Р-складчастого шару.
Залишок Су8б99 розташований на С-кінці а-спіралі 8Н2 (НІ8б90-Су8б99) у безпосередній
близькості до а-спіралі 8Н1 (Ьеи703-Лг§710), яка, в свою чергу, з’єднує конвертерний домен з К-кінцевим субдоменом (рис. 4§). Окиснення цистеїну б99
призводить до розриву водневого зв’язку між гідроксильною групою п Туг584 та карбонільним киснем Су8/Суаб99 (рис. 5р). Одночасно
послаблюється водневий зв'язок між КН групою Су8/Суаб99 та карбонільним киснем НІ8б95 (рис. 5q). Все це призводить до збільшення дифузної рухливості конвертерного домену відносно основної частини субфрагменту 81. Оскільки силове обертання конвертерного домену відносно основної частини голівки міозину забезпечує рух міозину вздовж актинової ниті, збільшення дифузних коливань конвертерного домену може викликати послаблення сили м’ язового скорочення.
Вплив окиснення залишків Су8123 та Су8709 на конформаційну рухливість субфрагменту 81 в даній роботі не виявлено.
У АТФ-зв’язуючому активному центрі міозину (рис. 4Ь) під час динаміки окисненого білку
розриваються сольові містки між боковими ланцюгами залишків Ьу8190 і 01и230 (рис. 5г) та між залишками Ьу8185 і Л8р4б3 (рис. 58). Також
розривається водневий зв'язок між у гідроксильною групою ТЬг18б та одним з атомів кисню у карбоксильної групи Л8р4б3 (рис. 5і). Це призводить до збільшення відстані між Са атомами залишків ТЬг18б та Л8р4б3 (рис. 5и). Саме амінокислотні залишки Ьу8185, ТЬг18б, Ьу8190, в1и230 і Л8р4б3 закривають каталітичний центр міозину та беруть
участь у зв’язуванні М§АТФ. Так, Lys185 знаходиться на петлі Р, його боковий ланцюг взаємодіє з у-фосфатною групою АТФ, а NH група основного ланцюгу - з Р-фосфатною групою АТФ. При окисненні міозину аміногрупа Z залишку Lys 185 віддаляється від у-фосфатної групи АТФ (рис. 5v) та наближається до Р фосфатної групи (рис. 5w). Амінокислотні залишки Thr186 і Lys190 розташовані на а-спіралі HF (Thr186-Ile199), що безпосередньо з’єднана з петлею Р. При цьому кисень у-гідроксильної групи Thr186 координує іон магнію, а NH група цього залишку утворює водневий зв’язок з киснем Р-фосфатної групи АТФ. Glu230 входить до складу а-спіралі HH (Leu229-Phe232), яка переходить у перемикач 1 (Gly233-Arg245). Asp463 є останнім амінокислотним залишком п’ятого Р-тяжу Tyr457-Asp463 перед перемикачем 2 (Ile464-Ser474). Цей залишок також бере участь у координації іону магнію. У міозині ІІ з окисненими залишками цистеїну відстань між карбоксильною групою залишку Asp463 і іоном магнію більше, ніж у нативному білку (рис. 5x). Таким чином у окисненому міозині спостерігається часткова зміна конформації центру зв’язування АТФ, що може пояснювати зміни функіонування окисненого міозину ІІ, яке виявлене експериментально [2, 3].
ВИСНОВКИ
В даній роботі методом моделювання молекулярної динаміки показано, що окиснення залишків цистеїну 38, 402, 403, 479, 522, 540, 676 та 699 може впливати на конформаційну рухливість субфрагменту S1 міозину ІІ скелетних м’язів кроля, зокрема на АТФ-зв’язуючий каталітичний центр, на сайт зв’ язування актину та на рухливість конвертерного домену. Однак не виявлено впливу окиснення залишків Cys123 та Cys709. Для подальшого вивчення окиснення голівки міозину на його конформацію та динаміку є перспективним як експериментальними методами, так і теоретичним моделюванням, провести модифікацію окремих амінокислотних залишків цистеїну 38, 402, 403, 479, 522, 540, 676 та 699 та дослідити вплив кожного з перерахованих залишків на будову та динаміку голівки міозину.
Література
1. Prochniewicz E., Spakowicz D., Thomas D.D. Changes in actin structural transitions associated with oxidative inhibition of muscle contraction // Biochemistry. - 2008.
- Vol. 47, No 45. - P. 11811-11817.
2. Шелюк О.В., Омельянюк В.С., Мединська К.О. Структурні характеристики актоміозину скелетних м’язів за умов окисної модифікації та під впливом ультразвуку / Матеріали X Українського біохімічного з’їзду. Одеса, 13-17 вересня 2010 р. // Український біохімічний журнал. - Т. 82, № 4, додаток 1. - С. 114115.
3. Шелюк О.В., Мединська К.О., Летюга В.В.,
Омельянюк В.С. Дослідження структурних
характеристик та визначення ступеня пошкодження окисно-модифікованого актоміозину скелетних м’язів кроля за дії // Фізика живого. - 2010. - Т. 18, № 1. - С. 164-167.
4. Hess B., Kutzner C., van der Spoel D., Lindahl E. GROMACS 4: Algorithms for Highly Efficient, Load-Balanced, and Scalable Molecular Simulation // Journal of Chemical Theory and Computation. - 2008. - Vol. 4, No 3. - P. 435-447.
5. Rayment I., Rypniewski W.R., Schmidt-Bäse K., Smith R., Tomchick D.R., Benning M.M., Winkelmann D.A., Wesenberg G., Holden H.M. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor // Science. -1993. - Vol. 61, No 5117. - P. 50-58.
6. Cecchini M., Houdusse A., Karplus M. Allosteric
Communication in Myosin V: From Small
Conformational Changes to Large Directed Movements // PLoS Computational Biology. - 2008. - Vol. 4, No 8. -P. 1-19.
7. Holmes K.C., Schröder R.R., Sweeney H.L., Houdusse A. The structure of the rigor complex and its implications for the power stroke // Phil. Trans. R. Soc. B. - 2004 -Vol. 359. - P. 1819-1828.
8. Bordoli L., Kiefer F., Arnold K., Benkert P., Battey J., Schwede T. Protein structure homology modelling using SWISS-MODEL Workspace // Nature Protocols. - 2009.
- Vol. 4. - P. 1-13.
9. Kanibolotsky D.S., Ivanova O.S., Lisnyak V.V. Comparison of NMR and MD N-H bond order parameters: example of HIV-1 pro tease // Molecular Simulation. - 2006. - Vol. 32, No 14. - P. 1155-1163.
10. Kanibolotsky D.S., Novosyl'na O.V., Abbott C.M., Negrutskii B.S., El'skaya A.V. Multiple molecular dynamics simulation of the isoforms of human translation elongation factor 1A reveals reversible fluctuations between "open" and "closed" conformations and suggests specific for eEF1A1 affinity for Ca2+-calmodulin // BMC Structural Biology. - 2008. - Vol. 8, No 4. - P. 1-16.
11. Oostenbrink C., Villa A., Mark A.E., van Gunsteren W.F. A biomolecular force field based on the free enthalpy of hydration and solvation: The GROMOS force-field parameter sets 53A5 and 53A6 // J. Comput. Chem. -2004. - Vol. 25, No 13. - P. 1656-1676.
12. Weber W., Hunenberger P.H., McCammon J.A. Molecular dynamics simulations of a polyalanine octapeptide under Ewald boundary conditions: influence of artificial periodicity on peptide conformation // J. Phys. Chem. B. - 2000. - Vol. 104. - P. 3668-3675.
13. Berendsen H.J.C., Postma J.P.M., van Gunsteren W.F., Hermans J. Interaction models for water in relation to protein hydration // Intermolecular Forces / Pullman, B. ed. - Dordrecht: D. Reidel Publishing Company, 1981. -P. 331-342.
14. Essmann U., Perera L., Berkowitz M.L., Darden T., Lee H., Pedersen L.G. A smooth particle mesh Ewald potential // J. Chem. Phys. - 1995. - Vol. 103. - P. 85778592.
15. Bussi G., Donadio D., Parrinello M. Canonical sampling through velocity rescaling // J. Chem. Phys. - 2007. -Vol. 126. - P. 14101.
16. Berendsen H.J.C., Postma J.P.M., DiNola A., Haak J.R. Molecular dynamics with coupling to an external bath // J. Chem. Phys. - 1984. - Vol. 81. - P. 3684-3690.
17. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. VMD - Visual Molecular Dynamics // J. Molec. Graphics. - 1996. -Vol. 14. - P. 33-38.
18. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modelling // Electrophoresis. - 1997. - Vol. 18. - P. 2714-2723.
ВЛИЯНИЕ ОКИСЛЕНИЯ ОСТАТКОВ ЦИСТЕИНА НА КОНФОРМАЦИОННУЮ ПОДВИЖНОСТЬ СУБФРАГМЕНТА S1 МИОЗИНА II
Каниболоцкий Д. С.
Построена трехмерная модель субфрагмента S1 миозина II скелетных мышц кроля в пост-ригорной конформации. В качестве шаблона использовали файл Протеин дата банка 2mys, который представляет собой кристаллографическую структуру головки миозина II скелетных мышц цыпленка. В каталитический центр модели размещено MgАТФ. С помощью пакета программ Gromacs 4.0.7 во временном интервале 7 нс проведено моделирование молекулярной динамики субфрагмента S1 миозина II с нативными остатками цистеина и с остатками цистеина, окисленными до цистеиновой кислоты. Установлено, что окисленный миозин проявляет большую конформационную подвижность, чем нативный. Проанализировано влияние окисления отдельных остатков цистеина на конформационную подвижность субфрагмента S1 миозина.
Ключевые слова: миозин II, скелетные мышцы, oryctolagus cuniculus, моделирование по гомологии, моделирование молекулярной динамики, окисление, тиольные группы.
INFLUENCE OF CYSTEINE RESIDUES OXIDATION ON MYOSIN II SUBFRAGMENT S1 CONFORMATIONAL MOBILITY
Kanibolotsky D.S.
3D model of rabbit skeletal muscle myosin II subfragment S1 in post-rigor conformation has been built using PDB structure of chicken myosin II head 2mys as a template. MgATP has been inserted into the catalytic site of the model. Molecular dynamics simulation of native myosin II S1 and S1 with cysteine residues oxidised up to cysteinic acid have been performed in 7 ns time scale using Gromacs 4.0.7 package. Oxidised myosin II demonstrates higher conformational mobility, than the native protein. Influence of individual cysteine residues oxidation upon S1 conformational mobility has been analysed.
Key words: myosin II, skeletal muscles, oryctolagus cuniculus, homology modelling, molecular dynamics simulation, oxidation, thiol groups.
19. van der Spoel D., Lindahl E., Hess B., Kutzner C., van Buuren A.R., Apol E., Meujenhoff P.J., Tieleman D.P., Sijbers A.L.T.M., Feenstra K.A., van Drunen R., Berendsen H.J.C. Gromacs: User Manual, Version 4.0. -Groningen, the Netherlands: University of Groningen, 2006. - XVI, 308 p.
