CC BY
33Фізика живого, Т. 16, N01, 2008. С.34-38.
© Мединська К. О., Омельянюк В.С., Грибова М.І., Давидовська Т.Л., Нурищенко Н.Є., Пелюх Л.І., Черноморець П.М.
УДК 577.3
ВПЛИВ КАЛЬЦІЮ НА ВЛАСНУ ФЛУОРЕСЦЕНЦІЮ АКТОМІОЗИНУ ПРИ ДІЇ УЛЬТРАЗВУКУ РІЗНИХ РЕЖИМІВ
Мединська К.О., Омельянюк В.С., Грибова М.І., Давидовська Т.Л.,
Нурищенко Н.Є., Пелюх Л.І., Черноморець П.М.
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Україна
біологічний факультет,
01022, Київ, вул. Володимирська, 64.
Надійшла до редакції 07.03.2008
Досліджено вплив ультразвуку (УЗ) різних режимів на спектральні показники актоміозину (АМ) скелетних м’язів в залежності від концентрації Са2+. Показано, що неперервний УЗ і імпульсний УЗ 2 мс при інтенсивностях 0,2 Вт/см2 і 0,4 Вт/см2 діють майже однаково і механізм їх специфічного впливу на АМ не пов’язаний з тепловою дією УЗ. В механізмі впливу УЗ з інтенсивностями 0,7 Вт/см2 і 1,0 Вт/см2 переважає теплова дія. Цим можна пояснити відсутність значної різниці параметра В від концентрації Са2+ в середовищі. Значний вплив УЗ на параметр В в безкальцієвому середовищі вказує на вирішальне значення Са2+ в механізмі впливу УЗ на АМ скелетних м’язів. В той же час невеликі зміни параметра В свідчать про незначні перебудови в конформаційній структурі актоміозину.
Ключові слова: актоміозин, ультразвук, параметр В, кальцій.
ВСТУП
Використання ультразвуку (УЗ) з діагностичними та лікувальними цілями є загальновідомим. Серед робіт, присвячених вивченню впливу ультразвуку на органи і тканини, найбільший інтерес представляють роботи про вивчення дії УЗ терапевтичних інтенсивностей [1, 2]. Результати таких досліджень свідчать про багатосторонній вплив УЗ, який проявляється на органному, клітинному,
субклітинному і молекулярному рівнях [3]. Показано, що озвучення впливає на процес скорочення м’язів. Дія УЗ проявляється в зниженні м’язового спазму, покращенні розтягування колагенових волокон. Терапевтичні ультразвукові коливання регулюють тонус м’язів, викликають рефлекторне розширення судин, посилення капілярного кровозабезпечення. Однак, незважаючи на обширний експериментальний матеріал, механізм впливу цього фізичного фактора на м’язи не встановлений [4].
Як відомо, актоміозин являється головним компонентом скоротливої системи м’язів і є зручною моделлю для вивчення механізму м’язового скорочення [5, 6]. Вирішальне значення при скороченні належить іонам Са2+ [7]. Тому метою роботи було вивчення впливу ультразвуку різних режимів на спектральні характеристики актоміозину скелетних м’язів в залежності від різної концентрації Са2+.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Дослідження проводили на актоміозині скелетних м’язів кроля. Виділення актоміозину проводили за методикою Перрі, описаною в роботі Тартаковського [8] з модифікаціями, розробленими у відділі біофізики НДІ фізіології. Для визначення впливу ультразвуку на спектральні характеристики білка, зразки актоміозину з концентрацією 0,2 мг/мл озвучували протягом 5 хвилин. Через 2 хвилини після впливу ультразвуку проводили визначення параметра В.
Озвучення актоміозину скоротливих м’ язів кроля проводили УЗ-приладом УЗТ-3.04С з частотою ультразвукового сигналу 0,88 МГц. Використовували наступні режими ультразвукового впливу:
1) неперервний з інтенсивностями 0,2; 0,4; 0,7 і
1.0 Вт/см2;
2) імпульсний 2 мс з інтенсивностями 0,2; 0,4; 0,7 і
1.0 Вт/см2.
Визначення впливу Са2+ (0 мМ (при додаванні 0,1 мМ ЕГТА), 0,5 мМ, 1,0 мМ, 2,0 мМ) на актоміозин (с=0,2 мг/мл), після озвучення ультразвуком різних режимів, проводили за двохвильовим флуоресцентним методом [9]. Складність білкових молекул вимагає застосування різноманітних біофізичних підходів при
ВПЛИВ КАЛЬЦІЮ НА ВЛАСНУ ФЛУОРЕСЦЕНЦІЮ АКТОМІОЗИНУ ПРИ ДІЇ УЛЬТРАЗВУКУ РІЗНИХ РЕЖИМІВ
дослідженні їх структури і функції. Важливе місце серед цих підходів займають люмінесцентні методи. Білки мають власну люмінесценцію завдяки триптофановим, тирозиновим і фенілаланіновим залишкам. При наявності в білку триптофанілів його люмінесцентні властивості, в основному, визначаються цим хромофором. Параметри триптофанової люмінесценції білків (положення максимуму спектра, та півширина спектра, квантовий вихід, час життя збудженого стану) залежать від умов мікрооточення хромофорів в структурі білкової молекули. Через розмитість максимумів на спектрах триптофанової флуоресценції можна надійно реєструвати тільки спектральні зсуви більше 1-2 нм. Розроблена у відділі біофізики НДІ фізіології флоуресцентна установка [9], дозволяє реєструвати спектральні зсуви до 0,05 нм, використовуючи відношення інтенсивностей на прямолінійних схилах спектра флуоресценції при двох фіксованих довжинах хвиль. Відношення інтенсивностей флуоресценції на цих довжинах хвиль визначається, як двохвильовий показник В=І^1/І^2. У спектро-флуориметрі, який в автоматичному режимі вимірює показник В, використовується
2 монохроматори флуоресценції. Один
монохроматор виділяє І^1 флуоресценції на Я1=320 нм, інший - І^2 на А,2=370 нм, тоді як А,зб = 297 нм. Тобто, показник В=І320/І370.
При достатній тривалості часу ділення двох сигналів (2 хв) установка дозволяє достовірно зареєструвати перебудову конформації білкової молекули, що супроводжується зміною параметра В на 0,005, що відповідає спектральному зсуву~0,05 нм.
Аналіз даних проводили з використанням аналітичних програмних продуктів Origm 7.5 (МісгоСаІ Software). Експериментальні значення подано на графіках як усереднення п’яти вимірів зі стандартна похибка середнього. Статистична вірогідність результатів визначалась за критерієм Стьюдента (р<0,01 вважалось статистично вірогідним).
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Для більшої наочності і зручності порівняння отриманих результатів всі контрольні значення були зведені до одиниці і проведена відповідна корекція отриманих результатів. На рис. 1-4
представлено узагальнюючі графіки впливу неперервного та імпульсного ультразвуку 2 мс на параметр В актоміозину скелетних м’ язів кроля при різній концентрації Са2+ в середовищі.
Як видно з результатів, які наведені на рис. 1 вплив неперервного УЗ з інтенсивністю 0,2 Вт/см2 в
середовищі за наявності Са2+ 0,5 мМ і 2,0 мМ на параметр В був однаковий в межах похибки та незначний і складав 0,012-0,010 у.о., що становить зміщення спектру флуоресценції на 0,12-0,10 нм, відповідно. За наявності Са2+ 1,0 мМ, а також за його відсутності в середовищі, зміна параметра В була більшою, ніж при 0,5 мМ і 2 мМ Са2+. При цьому за відсутності Са2+ параметр В змінювався найбільше - на 0,021 у.о. (0,21 нм), ніж при наявності Са2+. Імпульсний УЗ 2мс однаково впливав на параметр В за наявності 0,5 мМ і 1,0 мМ Са2+ в середовищі і знижувався на 0,009-0,007 у.о. (0,09 нм і 0,07 нм), відповідно. В той же час при наявності в середовищі 2,0 мМ Са2+ значення параметра В знижувалось на 0,011 у.о. (0,11 нм), але залишалось підвищеним відносно значення параметра В за відсутності Са2+ в середовищі.
Дія імпульсного УЗ 2 мс з інтенсивністю 0,4 Вт/см2 (рис.2) цікава тим, що УЗ цієї інтенсивності викликав однакові зміни параметра В, як за відсутності Са2+ в середовищі, так і при концентрації Са2+ 0,5 мМ (зміна параметра В складала 0,016 у.о., 0,16 нм). За наявності в середовищі 1,0 мМ Са2+ дія УЗ на параметр В була менш вираженою - 0,010 у.о. (0,10 нм) і подалі зменшувалась при наявності Са2+ 2 мМ в
середовищі - 0,006 у.о. (0,06 нм). Параметр В при дії неперервного УЗ з інтенсивністю 0,4 Вт/см2 при додаванні в середовище 0,5 мМ Са2+ знижувався більше - на 0,016 у.о. (0,16 нм), ніж в середовищі з
1,0 мМ і 2,0 мМ Са2+, де значення його зміни становило 0,009-0,008 у.о. (0,09-0,08 нм). В
безкальцієвому розчині значення зміни параметра В складало 0,026 у.о., тобто 0,26 нм, відповідно.
Така ж закономірність, як при дії неперервного УЗ з інтенсивністю 0,4 Вт/см2 зберігалась і при дії неперервного УЗ з інтенсивністю 0,7 Вт/см2, але зміна параметра В була більш вираженою (рис. 3). Як видно з рис. 3 характерні зміни параметра В при інтенсивності 0,7 Вт/см2 для УЗ неперервного і імпульсного 2 мс режимів відрізнялись між собою. Дія неперервного УЗ в середовищі з Са2+ 0,5 мМ викликала більшу зміну параметра В - на 0,029 у.о. (0,29 нм), а при наявності Са2+ 1 мМ і 2 мМ неперервний УЗ однаково в межах похибки впливав на параметр В, який змінювався на 0,021-0,019 у.о. (0,21-0,19 нм), відповідно. При відсутності ж Са2+ параметр В змінювався найбільше, а саме на 0,033 у.о. (0,33 нм). Дія імпульсного УЗ 2 мс в середовищі з Са2+ 0,5 мМ, 1мМ та 2 мМ була майже однаковою і менш вираженою. В безкальцієвому розчині значення зміни параметра В становило 0,022 у.о. (0,22 нм).
Мединська К.О., Омельянюк В. С., Грибова М.І., Давидовська Т.Л., Нурищенко Н.Є., Пелюх Л.І., Черноморець П.М.
Рис. 1. Параметр В актоміозину скелетних м’язів кроля під впливом неперервного та імпульсного ультразвуку 2 мс при інтенсивністі 0,2 Вт/см2 за умов різної концентрації Са2+:
Примітки: 1, 6 - контроль; 2, 7 - 0 мМ Са2+; 3, 8 - 0,5 мМ Са2+; 4, 9 - 1,0 мМ Са2+ ; 5, 10 - 2,0 мМ Са2+.
* - достовірна відміна порівняно з контролем при р<0,01
УЗ неперервний УЗ імпульсний, 2мс УЗ
Рис. 3. Параметр В актоміозину скелетних м’язів кроля під впливом неперервного та імпульсного ультразвуку 2 мс при інтенсивності 0,7 Вт/см2 за умов різної концентрації Са2+:
Примітки: 1, 6 - контроль; 2, 7 - 0 мМ Са2+; 3, 8 - 0,5 мМ Са2+; 4, 9 - 1,0 мМ Са2+; 5, 10 - 2,0 мМ Са2+.
* - достовірна відміна порівняно з контролем при р<0,01
Як видно з результатів, які наведені на рис. 4 при інтенсивності 1,0 Вт/см2 параметр В
знижувався відносно контролю, але його значення не залежало від концентрації Са2+, як при дії УЗ неперервного так і імпульсного 2 мс режимів. Неперервний УЗ змінював параметр В за наявності Са2+ 0,5 мМ, 1,0 мМ і 2,0 мМ майже однаково - на 0,022-0,019 у.о. (0,22 нм-0,19 нм), відповідно. Імпульсний УЗ 2 мс за наявності Са2+ 0,5 мМ, 1,0 мМ і 2,0 мМ також однаково, але менш виражено, впливав на параметр В, зміна якого становила
УЗ неперервний УЗ імпульсний, 2мс УЗ
Рис. 2. Параметр В актоміозину скелетних м’язів кроля під впливом неперервного та імпульсного ультразвуку 2 мс при інтенсивності 0,4 Вт/см2 за умов різної концентрації Са2+:
Примітки: 1, 6 - контроль; 2, 7 - 0 мМ Са2+; 3, 8 - 0,5 мМ Са2+; 4, 9 - 1,0 мМ Са2+; 5, 10 - 2,0 мМ Са2+,
* - достовірна відміна порівняно з контролем при р<0,01
УЗ неперервний УЗ імпульсний, 2мс УЗ
Рис. 4. Параметр В актоміозину скелетних м’язів кроля під впливом неперервного та імпульсного ультразвуку 2 мс при інтенсивності 1,0 Вт/см2 за умов різної концентрації Са2+:
Примітки: 1, 6 - контроль; 2, 7 - 0 мМ Са2+; 3, 8 - 0,5 мМ Са2+; 4, 9 - 1,0 мМ Са2+; 5, 10 - 2,0 мМ Са2+.
* - достовірна відміна порівняно з контролем при р<0,01
0,007-0,005 у.о. (0,07-0,05 нм), відповідно. За відсутності Са2+ спостерігалося більш значне зниження параметра В, порівняно з наявністю Са2+ у середовищі. Треба зазначити, що при збереженні такої тенденції, дія імпульсного ультразвуку 2 мс на параметр В при відсутності Са2+ була меншою (зміна параметра В складала 0,013 у.о., 0,13 нм), порівняно з дією неперервного УЗ (зміна параметра В на 0,032 у.о., 0,32 нм). Той факт, що УЗ з інтенсивністю 1,0 Вт/см2 при відсутності Са2+ в середовищі більш значно впливає на конформацію
ВПЛИВ КАЛЬЦІЮ НА ФЛУОРЕСЦЕНТНІ ВЛАСТИВОСТІ АКТОМІОЗИНУ ПРИ ДІЇ УЛЬТРАЗВУКУ РІЗНИХ РЕЖИМІВ
білкового комплексу, свідчить про важливе значення Са2+ для підтримання конформації АМ. Відсутність зміни параметра В від концентрації Са2+ можна пояснити тим, що теплова дія УЗ з інтенсивністю 1,0 Вт/см2 переважає над іншими механізмами ультразвукової дії.
Аналізуючи отримані результати, можна зазначити, що при відсутності Са2+ (0,1 мМ ЕГТА) в середовищі зміна параметра В збільшується при підвищенні інтенсивності неперервного УЗ. Так, УЗ
з інтенсивністю 0,2 Вт/см2 змінював значення параметра В в безкальцієвому розчині на 0,021 у.о. (0,21 нм); при інтенсивності 0,4 Вт/см2 зміна становила 0,026 у.о. (0,26 нм); при 0,7 Вт/см2 -
0,033 у.о. (0,33 нм); при 1,0 Вт/см2 - 0,032 у.о. (0,32 нм). При інтенсивностях 0,7 Вт/см2 і 1,0 Вт/см2 неперервний УЗ діяв майже однаково за відсутності Са2+.
ВИСНОВКИ
Неперервний УЗ і імпульсний УЗ 2 мс при інтенсивностях 0,2 Вт/см2 і 0,4 Вт/см2 діють майже однаково. Враховуючи дані літератури, відносно того, що в цих діапазонах теплова дія не виявляється, можна сказати, що різниці між специфічною дією УЗ на АМ при 0,2 Вт/см2 і 0,4 Вт/см2 не проявлялось. Тобто, механізм
специфічного впливу на АМ однаковий і не пов’язаний з тепловою дією УЗ.
В механізмі впливу УЗ з інтенсивностями 0,7 Вт/см2 і 1,0 Вт/см2 переважає теплова дія. Цим можна пояснити відсутність значної різниці показника В від концентрації Са2+ в середовищі. Значний вплив УЗ на показник В у безкальцієвому середовищі вказує на вирішальне значення Са2+ в механізмі впливу УЗ на АМ скелетних м’язів.
Найбільші зміни параметра В відбувались при застосуванні неперервного УЗ, порівняно з
імпульсним, оскільки неперервний сигнал діє постійно і спричиняє більшу дію, а сигнал імпульсного УЗ діє з проміжками в часі.
Невеликі зміни параметра В свідчать про незначні перебудови в конформаційній структурі актоміозину.
Література
1. Haar ter G. Therapeutic ultrasound // European J. of Ultrasound. - 1999. - Vol. 9. - Р. 3-9.
2. Baker K.G., Robertson V.J., Duck F.A. A Review of therapeutic ultrasound: Biophysical effects // Physical Therapy. - 2001. - Vol. 81, № 7. - P. 1351-1358.
3. Krekman F.W., Caratenaen E.L., Aldridje W.G. Macromolecular interaction in sound absorption // Interaction of Ultrasound and biological Tissue / (Eds. J.M. Ried and M.R. Sikov) DNEW Publication (FDA) 73-800б BRH/DBE 73.1 1972. - P. 37-42.
4. Barnett S.B., Rott H.D., Haar ter G., Ziskin M.C., Maeda K. The sensitivity of biological tissue to ultrasound // Ultrasound in Med & Biol. - 1997. - Vol. 23, № б. - P. 805-812.
5. Левицкий Д.И. Структура и функции белков сократительных мышц. Л.: Наука. - 1987.
6. Гусев Н. Б. Струкутра и функции тропонина // Структура и функции белков сократительных систем. - Л.:Наука. -1987. - С.91-110.
7. Samal A.B., Adzerikho I.D., Mrochek A.G., Loiko E.N. Platelet aggregation and change in intracellular Ca2+ induced by low frequency ultrasound in vitro // European Journal of Ultrasound. - 2000. - Vol. 11. - Р. 53-59.
8. Тартаковский А.Д. Методы выделения и характеристика миозина и его субъединиц из поперечнополосатых мышц // Биофизические и биохимические методы исследования мышечных белков. - Л. :Наука. - 1987. -С.55-7б.
9. 9. Филенко А.М., Зима В.Л. Двухволновой метод регистрации малых спектральных сдвигов флуорисценции белков // Молекулярная генетика и биофизика.-.К.: Мир. - 1981. - С.12б-135.
ВЛИЯНИЕ КАЛЬЦИЯ НА СОБСТВЕННУЮ ФЛУОРЕСЦЕНЦИЮ АКТОМИОЗИНА ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ УЛЬТРАЗВУКА РАЗНЫХ РЕЖИМОВ
Мединська К.О., Омельянюк В.С., Грибова М.І., Давидовська Т.Л., Нурищенко Н.Є., Пелюх Л.І., Черноморець П.М.
Исследовано влияние ультразвука (УЗ) разных режимов на спектральные показатели актомиозина (АМ) скелетных мышц в зависимости от концентрации Са2+. Показано, что непрерывный УЗ и импульсный УЗ 2 мс при интенсивностях 0,2 Вт/см2 и 0,4 Вт/см2 действуют почти одинаково и механизм их специфического влияния на АМ не связан с тепловым действием УЗ. В механизме влияния УЗ с интенсивностями 0,7 Вт/см2 и 1,0 Вт/см2 преобладает тепловое действие. Этим можно объяснить отсутствие значительной разницы параметра В в зависимости от концентрации Са2+ в среде. Значительное влияние УЗ на параметр В в безкальциевой среде указывает на решающее значение Са2+ в механизме влияния УЗ на АМ скелетных мышц. В то же время небольшие изменения параметра В свидетельствуют про незначительные перестройки в конформационной структуре актомиозина.
Ключевые слова: актомиозин, ультразвук, параметр В, кальций.
Мединська К.О., Омельянюк В. С., Грибова М.І., Давидовська Т.Л., Нурищенко Н.Є., Пелюх Л.І., Черноморець П.М.
INFLUENCE OF CALCIUM ON OWN FLUORESCENSE OF AKTOMYOSIN UNDER ACTION OF ULTRASOUND OF DIFFERENT REGIMES
Medynskaya K.A., Omelyanyuk V.S., Grybova M.I., Davydovska T.L., Nurishcenko N.Ye.,
Pelukh L.I., Chernomorets P.M.
The influence of ultrasound (US) of different regimes on the spectral indices of actomyosin (AM) from skeletal muscles in dependence on concentration of Ca2+was investigated. It was shown, that continuous US and impulsive US of 2 ms at intensities 0,2 Wt/sm2 and 0,4 Wt/sm2 influence almost equally and the mechanism of their specific influence on AM is unconnected with thermal action of US. In the mechanism of influence of US thermal action prevails with intensities 0,7 Wt/sm2 and 1,0 Wt/sm2. These can account for absence of considerable difference of parameter B from concentration Ca2+ in the medium. Significant influence of US on parameter B in a Ca2+ non medium indicates on the deciding value Ca2+ in the mechanism of influence of US on AM of skeletal muscles. At the same time small changes of parameter B testify about insignificant rearrangements in the conformational structure of aktomyosine.
Key words: actomyosine, ultrasound, parameter B, calcium.
