Вплив глутамату мангану на репродуктивну функцію та ембріогенез щурів Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 591.33:546.711:613.63

О.В. Штапенко, I.I. Гевкан, Ю.1. Сливчук, В.Я. Сирватка, С.В. Федорова

ВПЛИВ ГЛУТАМАТУ МАНГАНУ НА РЕПРОДУКТИВНУ ФУНКЦ1Ю

ТА ЕМБР1ОГЕНЕЗ ЩУР1В

1нститут бюлоги тварин HAAH, м. Льв1в Email: [email protected]

Дос^джували вплив шдширного введения препарату глутамату мангану у формi лiпосомальноï емульсп на репродуктивну систему та ембрюгенез самок шурiв. Результати досшджень показали, що введення препарату глутамату мангану за 7 дшв до заплЦнення та при заплЦненш призводить до вiрогiдного збiльшения илькосп жовтих тiл вагiтностi (р<0,001), илькосп живих плодiв (р<0,001) та зменшення загальноï i передiмплантащйноï смертносп у порiвняннi з контрольною групою. Досладженнями встановлено пiдвищения основних показникiв ембрюнального розвитку у дослiдних групах. Так, виявлено тдвищення кiлькостi мiсць iмплантацiй на 1 самку 10,7±0,26 та 11,3±0,21 (р<0,001) у 1-й та 2-й дослЦних групах, якi отримували препарат глутамату мангану, проти 9,4±0,16 у контрольнiй групi, а також вЦповЦне зниження кiлькостi мiсць резорбцн плодiв у самок щурiв. Отримаш результати вказують на позитивний вплив препарату глутамату мангану у формi лiпосомальноï емульсïï на ембрiогенез самок.

Ключов1 слова: глутамат мангану, вагттсть, ембрюгенез, лтосомальт препарати

О.В. Штапенко, И.И. Гевкан, Ю.И. Слывчук, В.Я. Сырватка, С.В. Федорова ВЛИЯНИЕ ГЛУТАМАТА МАРГАНЦА НА РЕПРОДУКТИВНУЮ ФУНКЦИЮ

И ЭМБРИОГЕНЕЗ КРЫС

Институт биологии животных НААН, г. Львов Email: [email protected]

Исследовали влияние подкожного введения препарата глутамата марганца в форме липосомальной эмульсии на репродуктивную систему и эмбриогенез самок крыс. Результаты исследований показали, что введение препарата глутамата марганца за 7 дней до оплодотворения и при оплодотворении приводит к достоверному увеличению количества желтых тел беременности (р<0,001), количества живых плодов (р<0,001) и уменьшение общей и предимплантационной смертности по сравнению с контрольной группой. Исследованиями установлено улучшение основных показателей эмбрионального развития в опытных группах. Так, выявлено достоверное повышение количества мест имплантаций на 1 самку 10,7±0,26 и 11,3±0,21 (р<0,001) в 1-й и 2-й опытных группах, получавших препарат глутамата марганца, против 9,4±0,16 в контрольной группе, а также снижение количества мест резорбции плодов у самок крыс. Полученные результаты указывают на положительное влияние препарата глутамата марганца в форме липосомальной эмульсии на эмбриогенез самок.

Ключевые слова: глутамат марганца, беременность, эмбриогенез, липосомальные препараты

-А

Biological Bulletin 9

St

O. V. Shtapenko, I. I. Hevkan, Yu. I. Slyvchuk, V. Y. Syrvatka, S.V. Fyodorova EFFECT OF GLUTAMATE MANGANESE ON THE REPRODUCTIVE FUNCTION AND EMBRYOGENESIS OF FEMALE RATS Institute of Animal Biology of NAAS, Lviv Email: [email protected]

Pregnancy is associated with increased nutritional needs due to the physiologic changes of the female and the metabolic demands of the embryo/fetus. The use of chelating compounds with high biological activity increased the fertility of female rats by stimulation metabolism and functional activity of the reproductive system. Manganese is an essential element utilized by antioxidants, including superoxide dismutase (MnSOD), and others metalloenzymes that take part in reduction reactions, in multiple physiological processes including reproductive system. The aim of the research was to determine the effect of subcutaneous injections of Mn glutamate in liposomal forms on the reproductive system and the process of embryogenesis of experimental female rat.

The study was conducted on female rats aged 2.5-3 months with body weight of 180-200 g. Rats with dated gestation were divided into three groups: two experimental and control. Female rabbits of the 1th experimental group were subcutaneous injected of 2 mg/ml for Mn glutamate in liposomal form one week before fertilization and the animals of the 2th group were obtained the same preparation during fertilization. Rats were euthanized on the twentieth day, ovariens were singled out of fiber, visual inspection and counting the number of yellow bodies were performed, absolute and relative mass indexes were determined, Mn glutamate influence index was calculated.

Experimental results showed that the administration of Mn glutamate 7 days before fertilization and during fertilization significant increased the number of corpora lutea of pregnancy (p<0,001), number of live fetuses (p<0,001) due to the decrease in general and pre-implantation embryonic mortality compared with the control group. The experimental results showed improvement in key indicators of embryonic development. We observed significant increase in the number of implanted embryos on 1 female at 10,7±0,26 and 11,3±0,21 (p<0,001) (9,4±0,16 vs. control group) and decrease of the number of resorption in the female rats treated with Mn glutamate as compared with the control group. The results suggest a beneficial effect on the course of Mn glutamate embryogenesis of experimental animals.

Key words: glutamate manganese, pregnancy, embryogenesis, liposomal preparation

Серед чинниюв, як1 впливають на вЦтворювальну функщю, важливе значення мають макро- та мшроелементи (Kumar, 2011). Нестача м1кроелемент1в викликае порушення вЦтворювально! функцп, зокрема, розлади i порушення генеративно!" функцп яечниюв тд час статевого циклу, що призводить до ембршнально! смертносл та зниження заплЦненосл.

Одним i3 важливих м1кроелемент1в, який забезпечуе нормальну репродуктивну функщю тварин, е манган (Скальный, 2004; Пр1мова, 2014). Вш впливае на овогенез, виношування плода, вигодовування новонароджених, запобпае дегенеративним змшам статевих залоз (Kim, 2012). Манган бере ISSN 2225-5486 (Print), ISSN 2226-9010 (Online). Бiологiчний eicHUKМДПУ. 2015. №3

активну участь в окисно-в1дновних процесах у тканинах (Agarwal, 2005), впливае на р1ст i розмноження тварин, а також на процеси кровотворення, регулюе функц1ю ендокринних залоз, посилюе д1ю в1там1н1в, входить до складу ряду фермент1в та е 1х активатором (Gunter, 2006). Дефщит цього м1кроелемента впливае на передню долю г1поф1за, гальмуючи ii здатн1сть продукувати i вив1льняти лютешзуючий та фол1кулостимулюючий гормони, як1 регулюють функц1ю яечник1в (Pine, 2005).

У тдвищенш бюлопчно! доступност1 м1кроелемент1в i забезпеченн1 ними тварин важливу роль в1д1грають б1окоординац1йн1, хелатн1 сполуки, в яких метали утворюють комплекси з бшлкандами, природн1ми нос1ями м1кроелемент1в (Бшкевич, 2012). Ведомо, що хелати е найбьльш оптимальною для орган1зму формою сполук бшгенних метал1в з л1гандами/оргашчними речовинами (Ильин, 2012). Б1олог1чна актившсть металу в цих комплексах зростае у сотш раз1в пор1вняно з актившстю його в 1ншому сташ (Кебец, 2006).

Тому значна увага придыяеться орган1чним сполукам б1огенних елемент1в, отриманих шляхом синтезу м1кроелемент1в з амшокислотами. Однак, б1олог1чна д1я бюкоординацшних сполук на репродуктивну здатн1сть самок залишаеться мало вивченою. Метою дослЦжень було з'ясувати вплив введення глутамату мангану у форм1 л1посомального препарату на заплЦнення та 1мплантац1йну здатшсть самок щур1в.

МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ

Для проведення досл1джень в1дбирали самиць б1лих нел1н1йних лабораторних щур1в вшом 2,5-3 м1сяц1 та живою масою 180-200 г. На пЦготовчому етат перед проведенням експерименту досл1джували естральний цикл самиць методом вагшальних мазюв (Шаторна, 2013). Для досл1джень самок 1з ст1йким ритмом естрального циклу роздыяли на 3 групи по 10 гол1в тварин у кожнш: 1 - контрольна (самиц1 з ф1зшлог1чним переб1гом ваг1тност1), 2 - дослана, тваринам яко! п1дшк1рно вводили глутамат мангану у форм1 лшосомально! емульсп у доз1 550 мкг/гол за 7 дшв до заплЦнення; 3 група -препарат вводили при заплЦненш.

Самиць ус1х груп на стадшх проеструс-еструс п1дсажували до самщв за схемою 2:1. Перший день ваптноси визначали за наявшстю сперматозо'1д1в у ваг1нальних мазках. Евтаназ1ю ваг1тних самиць щур1в проводили методом декаттацп п1д еф1рним наркозом на 20-й день ваптносл. П1сля лапаротомп вилучали роги матки з яечниками, тдраховували к1льк1сть жовтих т1л у яечниках, м1сць 1мплантац1й у матщ, к1льк1сть живих плод1в та таких, що були в стадп резорбцп для визначення показник1в до1мплантац1йно'1 та тсля1мплантацшно! загибел1 зг1дно 1з загальноприйнятими методами (Бессалова, 2006). Для виявлення морфолопчних змш визначили абсолютну масу яечник1в та розраховували в1дносну масу яечник1в за формулою:

vfe

I^T Biological Bulletin 11

St

М идн — М абс / М тварА 100%,

де: М в1дн - вЦносна маса яечника, мг; М абс - абсолютна маса яечника, мг;

М твар - маса тварин, мг.

Також розраховували 1ндекс впливу (I) дослЦжуваних металïв на масометричш показники яечниюв зпдно (Онул, 2013) за формулою

I — М досл /М контр,.

Утримання тварин та експерименти проводилися вЦповЦно до положень «6вропейсько'1 конвенцп про захист хребетних тварин, як використовуються для експерименив та шших наукових щлей» (Страсбург, 1985), «Загальних етичних принцитв експерименлв на тваринах», ухвалених Першим нащональним конгресом з бшетики (Кт'в, 2001). Уа отримаш в робот цифровï дат обробляли комп'ютерними програмами Microsoft Excel, Statistica 10. Вïрогïднïсть вЦмшностей визначали за t-критерïeм Стьюдента.

Результати й Обговорення

Аналïз морфолопчних показниюв репродуктивно'1 здатносл самиць щурïв дослЦних груп, яким вводили препарат глутамату мангану у формï лшосомально'1 емульсп до та при заплЦненш показав вïроriдне зростання кыькоси жовтих тiл ваптноси в яечниках та юлькосл ïмплантацïй на одну самку порïвняно з контрольною групою (p< 0,001, табл. 1). Так, у 1-й дослЦнш грут, самицям яко'1 глутамат мангану вводили до заплЦнення кiлькLсть жовтих тл ваптност становила 12,1±0,1 та у 2-й дослЦнш груп, яким вводили препарат пЦ час заплЦнення 12,9±0,23 проти 9,4±0,16 у контрольнш грут. Кыьккть мкць ïмплантацïй складала 10,7±0,26 та 11,3±0,21 проти 9,4±0,16 вЦповЦно (p<0,001).

Введення глутамату мангану сприяе ембрюнальному розвитку, що пЦтверджуеться вïроriдним пЦвищенням юлькосл живих плодïв на одну самицю на 17,2 % (10,2±0,20; p< 0,001) та 26,4% (11,0±0,21; p< 0,001) у 1-й та 2-й дослЦних групах проти 8,7± 0,15 у контрольнш грут. Подïбнï вЦмшносл виявлеш також стосовно юлькосл резорбцш плодïв мïж дослЦними та контрольною групами. Очевидно, це пов'язано з посиленням метаболïчних процеав у зв'язку зï здаттстю мангану активувати ферменти та регуляторш медïатори, як впливають на обмшш процеси в репродуктивних органах i гïпоталамо-гïпофïзарнïй ендокриннш системï самок, що пЦвищуе репродуктивну функщю яечниюв, ïмплатацüйиу здаттсть та приживлюватсть ембрштв.

При порïвняннï показниюв ембрюнального розвитку за дп глутамату мангану встановлено значне зниження загальноï ембрюнально"! смертносл, а

також летальностi в передiмплантацiйний та постiмплантацiйний перiоди в обох дослгдних групах порiвняно з контролем (табл. 1).

Таблиця 1. Морфолопчш дослЦженнями яeчникiв щурiв за дп глутамату мангану (М±т, п=10)

-А

и п

у р

1-4

а н

.5

н

х и т в о

ь т с

'2

ь

.5

ку

м а с

ун

д

о

ь ц

с

ь т с

'2

ь

.5

у;

В

а т н а л п

д

о л п х и в и

ь т с

'2

ь

.5

у;

В

б р

о

з

е р

ь ц

с

ь

т

и

а н

>5

В

а т н а л п

о

н

ь

а л-

н -а н

В О

а т н а 'о, б

ь, ь, м ь,

т л т е т

и п и а и

'й м В н В

ь ь ь ь

л л л л

а 5 а а а

т т г т

е е а е

л П л З л

Контроль 10.7±0.3 9.4±0.16 8.7± 0.15 0.8±0.16 18.69 10.34 27.10

I 12.1±0.1*** 10.7±0.26*** 10.2±0.20*** 0.5±0.35 11.57 4.67 15.70

II 12.9±0.23*** 11.3±0.21*** 11.0±0.21*** 0.4±0.24 11.63 3.51 14.73

Примтка: у цш та наступнш таблиц1 статистично в1ропдш р1зниц1 показник1в зразк1в

досл1дних груп пор1вняно з контрольними:

-р< 0,001.

Порiвняння результатiв морфологiчних дослГджень яечник1в контрольно! та досл1дних груп виявило певш вiдмiнностi абсолютних та вГдносних показникiв маси яeчникiв самиць. Зокрема, сумарна маса яeчникiв у 2-й дослГднш групi, тваринам яко! вводили препарат глутамату мангану у формi лiпосомальноí емульсГ! при заплГдненш була у 1,1 рази вищою в порiвнянi з 1-ою дослгдною групою, тварини яко! отримували глутамат мангану за 7 дшв до заплГднення (табл. 2).

Аналопчна тенденц1я також спостерiгалось щодо пГдвищення вГдносно! маси яечникгв в обох дослгдних групах порГвняно з контрольною. Введення глутамату мангану позитивно впливае на масометричш показники яечниюв, що пГдтверджено iндексом стимуляцп, який складае 1,06 та 1,14 у 1-й та 2-й дослгдних групах вГдповГдно.

НашГ результати узгоджуються з даними шших авторГв (Фофанова, 2005; Фавье, 2002; Кишат, 2005), як пов'язують пГдвищення заплГднюючо! здатностГ та репродуктивно! функцГ! самок з Гндукуючим впливом мГкроелементГв на метаболГчнГ процеси та використанням оргашчних сполук мГкроелементГв.

Вю^1еа! БыНеПп 13

Групи Абсолютна В1дносна 1ндекс

маса яечник1в, маса

впливу,

мг

яечник1в, % ум. од.

Контроль

74,77±0,68

0,0402

185,99±1,55

I

79,14±0,61*** 0,0418

1,06

189,51±0,81

II

85,51±0,73*** 0,0451

1,14

189,64±0,88

Структура б1окоординац1йних хелатних сполук сприяе зб1льшенню 1х проникносл через кл1тинн1 мембрани та модулюе доступн1сть для р1зних кл1тинних рецептор1в, а глутам1нова кислота, за рахунок включення в енергетичн1 та пластичт обм1нн1 процеси, впливае на функщональний стан тканин та орган1в при ваптноси, а також стимулюе гшоталамо-гшоф1зарну систему.

Висновки

Встановлено, що введення оргашчно! сполуки глутамату мангану у форм1 л1посомального препарату за 7 дшв до запл1днення та при заплЦнент проявляе стимулюючу д1ю на репродуктивну систему самиць та ембрюгенез, сприяе п1двищенню морфофункц1онального стану яечниюв при ваг1тност1 щур1в, зокрема, зб1льшуеться число жовтих т1л ваг1тност1, масометричш параметри яечник1в ваг1тних самиць шур1в, а також к1льк1сть живих плод1в за рахунок зниження до- та посимплантацшно!' смертност1.

ПЕРЕЛ1К ВИКОРИСТАНО1 Л1ТЕРАТУРИ

Бессалова Е.Ю. Физиологические и структурне методы оценки морфофункционального статуса яичников млекопитающих /Е.Ю. Бессалова // Клшчна анатом1я та оперативна х1рург1я. — 2006. - Т. 5,№ 3. — С. 85-90.

Бшкевич В.Я. Бюх1м1чт функщ'1 хелатних з'еднань м1кроелемент1в у орган1зм1 тварин / В.Я. Бшкевич, Б.В. Гутий, Л.£. Микитин, Ф. Новотш, Б. Лешо // Науковий вкник ЛНУВМБТ 1мен1 С.З. Гжицького. — 2012. — Т. 14 № 2 (3). — С. 3-7.

Ильин Д.В. Разработка технолгий получения аспарагинатов металлов -субстанций для производства БАД / Д.В. Ильин, Р.В. Краснова, И.З. Ахметов,

B.В. Судоков // Микроэлементы в медицине. — 2012. — 13(4). — С. 49-51. Кебец Н. М. Синтез смешаннолигандных комплексов металлов с

витаминами и аминокислотами и изучение их биологических свойств на животных : Автореф. дис. докт. биол. наук. /Н. М. Кебец. — М., 2006. — 35 с.

Онул Н.М. Вплив важких металiв на морфолопчш особливосл яечниюв щурiв / Н.М. Онул // Вкник ВДНЗУ Украшська медична стоматолопчна академ1я Актуальш проблеми сучасно'1 медицини. - 2013. — Т. 13, Вип. 4 (44). —

C. 154-158.

Прiмова Л.О. Метаболiзм вiтамiнiв i мiнеральних речовин: навчальний поабник / Л.О. Прiмовa, 1.Ю. Висоцький - Суми: Сумський державний ушверситет, 2014. - 256 с.

Скальный А.В. Биоэлементы в медицине / А.В. Скальный, И.А. Рудаков -М.: Издательский дом «ОНИКС 21 век». Мир, 2004. - 10 с.

Фавье M. Микроэлементы и беременность / M. Фавье // Микроэлементы в медицине. - 2002. - Т. 3. - № 4. - С. 2-6.

Фофанова И.Ю. Роль витаминов и микроэлементов в сохранении репродуктивного здоровья / И.Ю. Фофанова // Гинекология. - 2005. -№ 4. - С. 244-249.

Шаторна В.Ф. ДослЦження впливу нaномaтерiaлiв на стан репродуктивно'1 функцп в експеримеш! / В.Ф. Шаторна, В.1. Гарець, О.О. Савенкова, I.I. Колосова // Таврический медико-биологический весник. — 2013. — Т. 16, №1, ч. 1 (61). — С. 246-250.

Agarwal A Role of oxidative stress in female reproduction / A. Agarwal, S. Gupta, R. K Sharma // Reprod Biol Endocrinol. - 2005. - Vol. 3 (28). - Р. 1-21.

Gunter T.E. Speciation of manganese in cells and mitochondria: a search for the proximal cause of manganese neurotoxicity / T.E. Gunter, C.E. Gavin, M. Aschner, K.K. Gunter // Neurotoxicology. - 2006. - Vol. 27 (5). - P. 765-776.

Kim S. I. Effect of manganese exposure on the reproductive organs in immature female rats / S. I. Kim, Y. S. Jang, S.H. Han, M. J. Choi, E. H. Go, Y. P. Cheon, J.S. Lee, S.H. Lee // Development and Reproduction - 2012. - Vol. 16(4). - P. 295-300.

Kumar S. Importance of micro minerals in reproductive performance of livestock / S. Kumar, A. K. Pandey, A. W. AbdulRazzaque, D. K. Dwivedi // Veterinary Word. - 2011. - Vol. 4(5). - P. 230-233.

Pine M. Manganese acts centrally to stimulate luteinizing hormone secretion: a potential influence on female pubertal development / M. Pine, B. Lee, R. K. Dearth, J.K. Hiney, W. Les Dees // Toxicol Sci. - 2005. - Vol. 85. - P. 880-885.

-A

I^T Biological Bulletin 15

%

References

Bessalova, E.Yu. (2006). Fyzyolohycheskye y strukturne metodbi otsenky morfofunktsyonal'noho statusa yaychnykov mlekopytayushchykh. Klinichna anatomiya ta operatyvna khirurhiya. 5(3), 85-90.

Binkevych, V.Ya., Hutyy, B.V., Mykytyn, L.Ye., Novotni, F., Lesho, B. (2012). Biokhimichni funktsiyi khelatnykh z"yednan' mikroelementiv u orhanizmi tvaryn. Naukovyy visnyk LNUVMBT imeni S.Z. Hzhyts'koho. 14, 2 (3), 3-7.

Ilin, D.V., Krasnova, R.V., Ahmetov, I.Z., Sudokov, V.V. (2012). Razrabotka tehnolgiy polucheniya asparaginatov metallov - substantsiy dlya proizvodstva BAD. Mikroelementyi v meditsine. 13(4), 49-51.

Kebets, N. M. (2006). Sintez smeshannoligandnyih kompleksov metallov s vitaminami i aminokislotami i izuchenie ih biologicheskih svoystv na zhivotnyih. Thesis of Doctoral Dissertation.

Onul, N.M. (2013). Vplyv vazhkykh metaliv na morfolohichni osoblyvosti yayechnykiv shchuriv. Visnyk VDNZU Ukrayins'ka medychna stomatolohichna akademiya. Aktual'ni problemy suchasnoyi medytsyny. 13, 4 (44), 154-158.

Primova, L.O., Vysots'kyy, I.Yu. (2014). Metabolizm vitaminiv i mineral'nykh rechovyn: navchal'nyy posibnyk. Sumy: Sums'kyy derzhavnyy universytet.

16 Eio^oriHHHH eicHHK

Skalnyiy, A.V., Rudakov, I.A. (2004). Bioelementyi v meditsine. M.: Izdatelskiy dom «ONIKS 21 vek».

Fave, M. (2002). Mikroelementyi i beremennost. Mikroelementyi v meditsine. 3(4), 26.

Fofanova, I.Yu. (2005). Rol vitaminov i mikroelementov v sohranenii reproduktivnogo zdorovya. Ginekologiya. 4, 244-249.

Shatorna, V.F., Harets', V.I., Savenkova, O.O., Kolosova I.I. (2013). Doslidzhennya vplyvu nanomaterialiv na stan reproduktyvnoyi funktsiyi v eksperymenti. Tavrycheskyy medyko-byolohycheskyy vesnyk. 16(1), 246-250.

Agarwal, A., Gupta, S., Sharma, R.K. (2005). Role of oxidative stress in female reproduction._Reprod Biol Endocrinol., 3 (28), 1-21.

Gunter, T.E., Gavin, C.E., Aschner, M., Gunter, K.K. (2006). Speciation of manganese in cells and mitochondria: a search for the proximal cause of manganese neurotoxicity. Neurotoxicology, 27 (5), 765-776.

Kim, S. I., Jang, Y. S., Han,, S.H., Choi, M. J., Go, E. H., Cheon, Y. P., Lee, J.S., Lee, S.H. (2012). Effect of manganese exposure on the reproductive organs in immature female rats. Development and Reproduction, 16(4), 295-300.

Kumar, S., Pandey, A. K., AbdulRazzaque, A. W., Dwivedi, D. K. (2011). Importance of micro minerals in reproductive performance of livestock. Veterinary Word. 4(5), 230-233.

-A

I^T Biological Bulletin 17

St

Pine, M., Lee, B., Dearth, R. K., Hiney, J.K., Les Dees, W. (2005). Manganese acts centrally to stimulate luteinizing hormone secretion: a potential influence on female pubertal development. Toxicol Sci. 85, 880-885.

Поступила в редакцию 20.09.2015

Как цитировать:

Штапенко, О.В., Гевкан, I.I., Сливчук, Ю.1., Сирватка, В.Я., Федорова, С.В. (2015). Вплив глутамату мангану на репродуктивну функцiю та ембршгенез щурiв. Биологический вестник Мелитопольского государственного педагогического университета имени Богдана Хмельницкого, 5 (3), 8-17. cross«* http://dx.doi.org/10.7905/bbmspu.v5i3.982

© Штапенко, Гевкан, Сливчук, Сирватка, Федорова, 2015

Users are permitted to copy, use, distribute, transmit, and display the work publicly and to make and distribute derivative works, in any digital medium for any responsible purpose, subject to proper attribution of authorship.

MH^H

This work is licensed under a Creative Commons Attribution 3.0 License