CC BY
12
УДК 619: 616. 98: 619: 615
Соболта А.Г., к. вет.н., асистент © Лье1еський нацюнальний утеерситет еетеринарног медицины та бютехнологш ¡мет С.З.Гжицького
ВПЛИВ ФАСЦ1ОЛОЦИД1В НА СПЕРМАТОГЕНЕЗ FASCIOLA HEPATICA IN VITRO
Виечали еплие фасщолоцидге бронтелу 10 %, комбтрему, як ймоегрних джерел цитолог1чних змт у клтинах сперматогенного циклу Fasciola hepatica, що еажлиео ерахоеуеати при еиеченш мехатзм1е еиникнення у фасцюл резистентност1 до фасщолоцидних антигельмттиюе.
Ключовi слова: Fasciola hepatica, сперматогенез, резистентшсть, фасщолоциди, бронтел 10 %, комбтрем.
Вступ. Резистентшсть фасцюли пов'язана з гаметогенезом та ценогенезом фасцюл [6]. Гаметогенез у фасцюл - перший етап розвитку, на якому вщбуваеться найбшьш висока (для всьго онтогенезу) селекщя гамет (статевих кл^ин) через штенсивну загибель бшьшосп з них на вах етапах !х розвитку внаслщок порушень в них тсля ендогенних або екзогенних впливiв.
На нашу думку, було доцшьно визначити, яю цитоструктури бшьш чутливi до ди фасцiолоцидiв, яю бшьш стшю до пошкоджуючо! ди, до визначення класу антигельмштиюв тощо; адже цитолопчш дослщження ди фасцiолоцидiв на статевi клiтини фасцюл до тепершнього часу не проводились. Це може мати певне значення, тому що дозволяе визначити загальну резистентшсть фасцюл до цитотоксично! i мутагенно!, допустимо! i порогово! дози для проявлення нею цитопатичного, мутагенного та шших ефекив i розробити заходи проти лжоотрност^
Нами проведена серiя експериментiв з метою визначення комплексу критерив оцiнки i вщпрацювання схеми проведення експериментiв для виявлення гаметотропно! (гаметотоксично!) ди фасцiолоцидiв.
Для цього в експериментах in vitro на фасцюл дiяли фасцiолоцидами комбггрем та бронтел 10 %, враховуючи певнi етапи сперматогенезу гельмiнта.
Матер1ал i методи. Для вивчення цитотоксично! ди фасцiолоцидних препаратiв на сперматогенез, статевозрших паразитiв пiсля вiдбору з жовчних ходiв, вiд забитих на бойш тварин, помiщали у термос, в лаборатори промивали в розчиш Хедон-Флейга декiлька разiв та помщали по 20 екз. фасцiол у стерильш посудини емнiстю 500 мл з розчинами рiзних концентрацiй комбтрему та бронтелу 10 % на 24 години. Антигельмштики вносили у розчин Хедон-Флейга вщповщно до терапевтичних доз [10] та наближених рiвнiв у кров1 Комбiтрем розводили у концентращях 0,1; 0,05; 0,025; 0,012; 0,006; 0,003; 0,0015 мг/см3; бронтел 10 % вщповщно - 1,2; 0,6; 0,3; 0,1; 0,07, 0,03 i 0,017 мг/см3. Нерозчинний у водi фасцюлоцид - комбтрем розводили етиловим спиртом: до 10-ти мг препарату додавали 0,16 мл етилового спирту [3]. Одна
© Соболта А.Г., 2010
288
посудина без антигельмштиюв була контролем. Шсля чого, гшотошзацш, фшсацш та виготовлення тимчасових тиснених тотальних препарата проводили згщно методам [1, 5, 6, 9] у деяких модифкащях (Соболта А.Г., 2004) [8]. Оцшку результата з вивчення кл^ин на стадiях сперматогенного циклу F.hepatica проводили шляхом виявлення та диференщаци первинних, вторинних та третинних сперматогонив, сперматоцитiв першого та другого порядив, а також сперматид i спермив [8, 11]. Препарати ощнювали методом порiвняння, кожнi 6, 12 та 24 год, нормальних та змшених клiтин сперматогенного циклу у кожно! фасцiоли, змiни у яких були викликаш дieю фасцiолоцидiв.
Фотографування здшснювали за допомогою цифрово! фотокамери "SONY W5" та свiтлового мкроскопа марки "Jenamed 2" (Carl Zeiss Jena) iз цифровим та оптичним збшьшенням до 1100 разiв.
Результати дослщжень. З попереднiх даних морфолопчних дослiджень in vitro виявлено, що спермiй фасцiоли складався з цитоплазматично! голiвки та джгутика [8]. З наших дослщжень, за допомогою св^лово! мкроскопи, за впливу фасцiолоцидних препарата вдалося виявити деякi вiдмiнностi, що полягали в утвореннi дегенеративних форм спермив. Так, комбггрем у концентраци 0,05 мг/см3 викликав скручення джгутиюв спермив через 12 годин за дослщжень in vitro (рис. 1), а через 24 години експерименту у концентраци 0,1 мг/см3 вш сприяв вщриванню !х голiвок, як це видно з рис. 2.
Рис 1. Скучення джгутик1в Рис. 2. Вщрнвн гол1вок спермив п1д спермив п1д вплнвом комб1трему вплнвом комб1трему (24 годннн), (12 годин), ацетокарм1н (10x100). ацетокарм1н (10x100).
Через 12 годин, пщ д1ею бронтелу 10 % у концентраци 0,6 мг/см3, вщбувалися змши у сперм1ях, а саме затримувалось 1х утворення 1з сперматид, так як у контрольнш груш щ змши не спостеркались, а проходив нормальний розвиток уск клггин сперматогенного циклу. Щодо впливу препарата на шш клггини сперматогенного циклу, а саме на сперматоцити (рис. 3), ми виявили досить цкаш вщмшносп. Пд дкю бронтелу 10 % у концентраци 1,2 мг/см3 вони характеризувались зменшенням кщькосп сперматоцита на 12-ту годину експерименту, поршняно з контрольними препаратами та змшами у сперматидах, що проявлялись 1х скрученням (рис.4).
289
Рис. 4. Скручення сперматид шд впливом бронтелу 10 % (12 годин), ацетокармш (10x100).
Рис. 3. Зменшення кшькост сперматоцит1в п1д впливом бронтелу 10 % (12 годин), ацетокарм1н (10x100).
Очевидно, цей антигельмштик досить швидко проявив свою деструктивну дiю, про що свщчило i зменшення кiлькостi клггин сперматоцитiв, порiвняно iз контрольною групою, на 12-ту годину експерименту.
Також спостер^али змiни у сперматидах i за ди комбiтрему. Через 12 годин у концентраци антигельмiнтика 0,05 мг/см3 сперматиди скручувались, вiдзначалось суттеве зменшення !х кiлькостi на 24-ту годину дослiдження у концентраци 0,025 мг/см3 та порушення розвитку стади "трояндочки", яка характеризувалась утворенням восьми первинних сперматоцитiв. Уже через 6 годин у концентраци препарату 0,05 мг/см3 змши на стади "трояндочки" були досить суттевими (рис. 5), порушилась нормальна структура цього утворення та зникла одна кл^ина, а через 24 години впливу комбтрему за ще! ж дози, "трояндочка" взагаш втратила свою структуру, як це видно з рис. 6.
"трояндочки"
Рис. 5. Дегенеращя сперматоцит1в п1д впливом комб1трему (6 годин), ацетокармш (10x100)
Рис. 6. Дегенеращя "трояндочки" сперматоцит1в п1д впливом комбггрему
(24 години), ацетокарм1н (10x100)
Причиною таких руйнувань могла бути фрагментащя i автофагiя центрально! цитоплазми на стади формування "трояндочки".
290
З'ясовано, що комбпрем in vitro у концентраци 0,05 мг/см3 викликав napani4 фасцiоли протягом 2-ох годин, а змiни в сперматогенному ци^ через 6 годин. Порiвнюючи вплив комбiтрему та бронтелу 10 % на сперматогенез фасщоли можна припустити, що in vitro перший е бшьш ефективним вже на раншх стaдiях подiлу клкин (див. табл. 1).
Таблиця 1
Вплив фасцшлоцнд1в на чоловiчу статеву систему F.hepatica in vitro
Антигельмштики
комбирем, мг/см3 бронтел 10 %, мг/см3
Експози-щя, год <о <0 <о 0,05 0,025 0,012 0,006 0,003 0,0015 0, 0, ,2, 6, 0, 3, 0, 0, 0,07 0,03 0,017
6 — + + + +
12 — + + + + + — — — + + + — — — —
24 — + + + + + + + — + + + + + + +
Примггки: "+" - змши в репродуктивнш системц "-" ввдсутт змши
Комбпрем належить до групи бензимiдазолiв, а бензимщазоли, як вiдомо [2, 3, 4] порушують полiмеризацiю тубулiну, який вщповщае за утворення мiкротрубочок (формування цитоскелету клкин), як наслiдок, утворюються цитологiчно дефектнi клiтини, якi не здатш виконувати покладенi на них функци i накопичення такого роду клкин неминуче може призводити до рiзноманiтних патоморфологiчних змiн.
Також, слщ зазначити, що у розведеннях антигельмштиюв у бiльших концентрацiях, було вiдмiчено зменшення загально! кiлькостi клiтин сперматогенного циклу i навпаки.
Проблема цитопатологи гамет фасцiоли, яка виникае тд впливом фасцiолоцидiв, знаходиться на стади накопичення фактiв. Питання про причини та динамжу розвитку патологiчних змш у статевих клiтинах, ступеня вираження, можливост вiдновлення або ступеня зворотност порушень, можливостi вiддалених наслiдкiв, яю вiдбулися на бiльш раннiх етапах розвитку гамет, практично ще не вщображеш у спецiальнiй лiтературi ^ вивчаються.
Висновки. Вплив фасцiолоцидних препарата може бути джерелом цитолопчних змш у гаметах трематоди, яю проявляються дегенеративними формами клiтин сперматогеного циклу, що важливо враховувати при вивченш цитологiчних механiзмiв виникнення у фасщол бюлопчно! резистентностi до фасцiолоцидних антигельмштиюв.
291
Л1тература
1. Астафьев Б.А. Экспериментальные модели паразитозов в биологии и медицине / Астафьев Б.А., Яроцкий Л.С., Лебедева М.Н. - М.: Наука, 1989. - 259 с.
2. Бенедиктов И.И. Ингибирующие действия ароматических сульфидов, сульфоксидов и сульфонов на биохимические системы Fasciola hepatica / И.И. Бенедиктов // Мед.паразитол. и паразитарн. болезни. - М., 1975, Т. XLIV, № 4. -С. 474-477.
3. Бенедиктов И.И. Пути биологического и энергетического обмена у гельминтов и биохимический механизм действия антгельминтиков: автореф. дис. на соиск наук, степени докт. биол. наук : 03.00.20 "Паразитология", 03.00.04 "Биохимия"/ И.И. Бенедиктов. - М, 1982. - 46 с.
4. Бенедиктов И.М. Транспорт электронов в митохондриях трематоды Fasciola hepatica / И.М.Бенедиктов // Тр. Все. Ин-та гельминтол. - М., 1971. - Т. XVII. - С. 57-62.
5. Дыбан А.П. Метод приготовления препаратов мейотических и митотических хромосом из семеников млекопитающих / А.П. Дыбан // Цитология. - М., 1969. - Т. 12, №5. - С. 687-689.
6. Курило Л.Ф. Цитогенетические и цитологические подходы к виявлению нарушений гамет / Л.Ф. Курило // Лабораторное дело. - М.: Медицина, - 1989. - С. 4-8.
7. Пенькова Р.А. Изучение хромосом трихинелл / Р.А. Пенькова, Л.Н. Романенко // Труды всес. ин-та гельминтол., 1973. - Т. 20. - С. 133-142.
8. Соболта А.Г. Цитогенетичш та цитолопчш дослщження сперматогенезу у Fasciola hepatica (Fasciolidae) / А.Г. Соболта // Наук. вкник Львiвськоl нацюнально! академи ветеринарно! медицини iменi С.З. Гжицького. - Львш, 2004. - Т. 6. - Ч. 1. - С. 90-93.
9. Терская Е.Р. Приготовление давленных препаратов из окрашенных ацетокармином яиц тутового шелкопряда / Терская Е.Р.// Методы биологии развития. - М.: Наука, - 1974. - 519 с.
10. Ханбегян Р.А. Изучение действия антгельминтиков на фасциол / Р.А. Ханбегян // Тр. Всес. ин-та гельминтологии. - М., 1975. - Т. 22. - 177-184 с.
11. Stitt A.W. Spermatogenesis and the fine structure of the mature spermatozoon of the liver fluke Fasciola hepatica (Trematoda:Digenea) / A.W. Stitt, I. Fairweather // Parasitology. - 1990. - № 101. - Р. 395-407.
Summary Sobolta A.G.
Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnology named after S.Z. Gzhytskyj FASCIOLOCIDES EFFECT ON SPERMATOGENESIS FASCIOLA HEPATICA IN VITRO
They studied the impact of fasciolocides of brontel 10%, kombitrem as possible sources of cytological changes in Fasciola hepatica spermatogenous cycle cells, which is important to consider when studying the fascioles' mechanisms of developing resistance to fasciolocides antihelmintics.
Стаття надшшла до редакцИ 5.04.2010
292
