CC BY
20
ЭКСПЕРИМЕНТАЛДЫК ЖЭНЕ КЛИНИКАЛЬЩ ЗЕРТТЕУЛЕР
УДК 575-056.2
В.И. КОНЕНКОВ
ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА ЦИТОКИНОВЫХ ПОЛИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ У ЗДОРОВЫХ ЛИЦ И ПАЦИЕНТОВ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук,
Новосибирск, Россия
Цитокиновая сеть человека представляет собой сложно организованную систему гуморальных регуля-торных сигналов и акцепторных мест. В ее полноценном функционировании принимают участие механизмы обратной связи, конкуренции за мембранные рецепторы, связывания с растворимыми рецепторами, взаимодействия с агонистами и антагонистами и т.п. Однако количественные параметры этого молекулярного механизма изучены до сих пор явно недостаточно. Между тем, очевидно, что интенсивность синтетических процессов в клетках-продуцентах цитокинов, как и в клетках- акцепторах, играет значительную роль в результирующем эффекте межклеточного дистантного взаимодействия. Не менее очевидно, что интенсивность продукции цитокинов или плотность рецепторов на поверхностной мембране клетки, помимо процессов внутриклеточного транспорта и мембранного перехода, регулируется на генетическом уровне. Как известно генетический контроль синтеза белка заключается не только в кодировании аминокислотной последовательности полипептидных цепей экзонными участками, но и в механизмах организации белковой молекулы, в контроле над интенсивностью продукции белковых макромолекул. За последние механизмы отвечают, как правило, нетранс-лируемые участки генов в их промоторных областях.
К примеру, ген IL10 состоит из 5 экзонов, длиной около 5200 пн, расположен на первой хромосоме в регионе 1q31-1q32. В гене IL10 выявлено 49 полиморфизмов, из которых 46 представляют собой мононуклеотидные полиморфизмы, 2 являются полиморфизмами микросателлитов и одна трехнуклеотидная делеция. 28 полиморфизмов находятся в промоторной зоне гена. 20 полиморфизмов выявлены в некодирующих интронных участках и представляют собой синонимические замены (из которых один полиморфизм вызывает изменение аминокислотной последовательности в белке) и одна точка полиморфизма находится в З'-некодирующем регионе. В роли кандидатов регуляции транскрипции рассматриваются 13 моно-нуклеотидных полиморфизмов, из которых наиболее исследованными являются G-1082A, T-819C и C-592A. Доказано, что гаплотип -1082, -819 и -592 GCC - увеличивает продукцию IL-10, а гаплотип АТА уменьшает продукцию в культурах мононуклеаров периферической крови.
Следовательно, генетическая структура
промоторных зон генов цитокинов во многом определяет количественные параметры уровня продукции цитокинов, присущие данному индивиду. При этом, в едином геноме человека могут сочетаться генотипы, определяющие высокий уровень продукции одних цитокинов, при наличии генотипов в других генах, определяющие низкий уровень других цитокинов. Баланс уровня продукции различных цитокинов, определяющий эффективность
14
функционирования цитокиновой сети, конституционально присущ индивиду и задает параметры колебаний реакции системы на антигенные воздействия и на развитие иммунопатологических процессов. Естественно, эти параметры не носят абсолютный характер и позволяют колебаться уровню цитокинов индивида в определенных пределах, однако границы предела этих колебаний имеют генетически заданный характер. Кроме того, хорошо известно, как высок уровень колеблемости концентрации цитокинов в крови и других биологических жидкостях организма, и попытки использовать определения концентраций цитокинов при различных заболеваниях в диагностических целях до сих пор не привели к положительным результатам. Определение же генотипа цитокиновой сети позволяет наметить пути разработки стабильной типологии индивидов для перехода к персонализированной медицине.
За последние 10 лет опубликовано большое количество работ, описывающих как наличие полиморфных участков в различных областях генов цитокинов, так и связь ряда из них с уровнем экспрессии тРНК, интенсивностью продукции в клеточных культурах или с концентрацией в сыворотке крови. Описаны изменения в частоте встречаемости отдельных аллельных вариантов в этих полиморфных участках генов при различных заболеваниях. Журнал Genes and Immunity и другие базы данных регулярно обобщают эти данные в виде табличных сводок. Анализ представленных в различных базах данных выявил два существенных момента.
Во-первых: выявленные ассоциации между аллель-ным полиморфизмом промоторных участков генов цитокинов и уровнем продукции клетками самих цитокинов носят выраженный этнический характер. В ряде случаев выявлена полная инверсия характера такой ассоциации у представителей различных расовых групп. Например, ал-лельный вариант А в точке полиморфизма -863 гена TNFA ассоциирован с более низким уровнем продукции TNF-a у представителей европеоидной расы, но с более высоким уровнем продукции фактора у монголоидов.
Во-вторых: выраженность ассоциированности отдельных аллельных вариантов промоторов генов цитокинов с заболеваниями, выражаемая, как правило, в числовых коэффициентах показателя отношения шансов (OR), оказывается статистически значимой, но слабо выраженной, что затрудняет использование полученных значений в качестве биомаркеров с реальной клинической прогностической значимостью.
Исходя из этого, нами разработан принципиально новый подход к анализу характера ассоциированности полиморфных участков в промоторных зонах генов цитокинов с заболеваниями, который прошел апробацию
Батые Цазацстан медицина журналы №4 (36) 2012 ж.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
на больших выборках здоровых лиц и пациентов с такими распространенными заболеваниями, как сахарный диабет 2 типа, стенокардия и острый инфаркт миокарда, первичный и вторичный остеопороз, ревматоидный артрит, рак молочной железы, хронический вирусный гепатит В и С и т.д. Все эти исследования проведены на популяции жителей России европеоидного происхождения, что делает полученные высокоинформативные критерии пригодными для использования в нашей стране. Во весь цикл исследования включены образцы ДНК более 2000 здоровых и больных человек, что повышает достоверность полученных данных. Этот подход разработан путем сопоставления частот встречаемости не отдельных аллельных вариантов отдельных генов цитокинов, а на анализе встречаемости у здоровых и больных людей комбинаций генотипов целого ряда генов цитокинов по большому числу точек полиморфизма. В исследование включен анализ полиморфизмов промоторных регионов генов цитокинов: IL1B -31 CT, -511 CT; IL2 -330 CT; IL4 -590 CT; IL5 -703 CT; IL6 -174 GC; IL10 -592 AC, -1082 AG; TNFA -308 AG, -238 AG, -863 AC; VEGF +936 CT, -2578 AC. Ввиду большого числа комбинаций из генотипов, теоретически и практически встречающихся в группах здоровых и больных лиц, разработано соответствующее программное обеспечение, которое последовательно анализирует частоту встречаемости каждого аллеля, генотипа, комбинаций из 2-х, 3-х, 4-х, 5-ти, 6-ти и так далее генотипов. Одновременно анализируется достоверность различий между группами по каждому параметру по двустороннему критерию Фишера, соответствие их распределения закону Харди-Вайнберга, нахождение показателя OR в зоне CI 95%, чувствительности, специфичности и информативности признака для диагностической процедуры. Все параметры, не соответствующие заданным условиям, автоматически исключаются из дальнейшего анализа.
Тщательный клинико-генетический анализ полученных данных выявил ряд фундаментальных закономерностей.
Во-первых: лишь небольшая часть теоретически возможных комбинаций генотипов цитокинов выявляется в группах как здоровых, так и больных лиц. Их значительная часть является, очевидно, «запрещенной» и не совместима с существованием организма в современной окружающей среде. По всей вероятности, эта закономерность отражает наличие эволюционно селективных процессов в популяции Homo sapiens, сохранивших лишь во времени лишь эволюционно адаптированные цитокино-вые генотипы. Так из возможных по расчету 268 435 455 комбинаций генотипов 14 цитокинов в группе из более 500 здоровых лиц, нами реально установлено наличие лишь 1 036 928 комбинаций, что составляет менее 0,5%.
Во-вторых: даже это реально существующее число комбинаций цитокиновых генотипов среди, можно сказать, условно здоровых лиц с возрастом прогрессивно уменьшается. Нами установлено, что из 10 достаточно широко распространенных среди относительно молодых (моложе 35 лет) здоровых лиц комбинаций цитокиновых генотипов, в более старшей группе (старше 55 лет) ни
одна из этих комбинаций не выявляется ни одного раза. Это может свидетельствовать лишь о том, что эти комбинации генотипов цитокиновых генов характерны для лиц с достаточно низкими резервами состояния здоровья, т.к. они просто не доживают до старшего возраста. Это в лишний раз свидетельствует и о том, что в данном случае мы имеем дело не со случайным явлением, а с одним из фундаментальных явлений, самым существенным образом, связанным с таким жизненно важным показателем состояния здоровья отдельных индивидов, как продолжительность жизни.
В-третьих: квалифицированный клинический анализ данных, полученный при обследовании групп пациентов с различными заболеваниями, среди которых были определены заболевания аутоиммунной, онкологической, аллергической природы, показал, что после решительной выбраковки малоинформативных различий, удается выявить комбинации генотипов цитокинов, частота которых минимальна среди здоровых лиц и максимальна в группе пациентов. Это позволяет рассматривать выявление этих комбинированных генетических цитокиновых параметров в качестве реальных претендентов на включение их в ряд биологических маркеров риска развития различных заболеваний. Величины отношения шансов OR в целом ряде случаев достигают двузначных величин, а показатели «специфичности» признака достигают 100%, что является уникальным для исследований в области медицинской генетики. Выявление таких высоко достоверных факторов риска на ранних этапах жизни человека открывает реальный путь к персонализированной профилактике и персонализированной медицине. Бурное развитие биочиповых технологий в генетических исследованиях позволяет в ближайшее время реализовать эти предположения.
В-четвертых: с цитокиновым генотипом оказались тесно ассоциированы не только развитие самих заболеваний, но и варианты их клинического течения, что позволяет более точно предвидеть пути развития клинически полиморфных мультифакториальных заболеваний и персонализировано определять тактику лечения каждого пациента, отойдя от непродуктивной концепции медицинских «стандартов» лечения. Цитокиновый генотип оказался продуктивным инструментом и в фармакогеномных исследованиях. Нами установлены, в частности, комбинации цитокиновых генотипов, тесно ассоциированные с эффектом от проведенной иммуносупрессивной терапии ревматоидного артрита. Выявлены комбинации генотипов, почти исключительно распространенные среди пациентов с высоким или низким эффектом от проведенной в течение 24 недель терапии. Это позволяет существенно повысить эффективность лечения пациентов со столь тяжелым инвалидизирующим заболеванием за счет целенаправленного подбора пациентов для назначения конкретного вида лечения, что существенно повлияет на фармакоэкономическую составляющую медицины, испытывающей глобальные трудности от все возрастающей стоимости современных препаратов.
Медицинский журнал Западного Казахстана №4 (36) 2012 гГ
15
ЭКСПЕРИМЕНТАЛДЫК ЖЭНЕ КЛИНИКАЛЫК ЗЕРТТЕУЛЕР
ТУЙ1Н
В.И. КОНЕНКОВ
ТАВИГАТЫ ЭРТYРЛI АРУЛАРЫ БАР НАУКАСТАРДА ЖЭНЕ САУ АДАМДАРДА ЦИТОКИНД1 ПОЛИГЕНД1
КЕШЕН1Н1И ЖАСЫНА КАРАЙ ДИНАМИКАСЫ
Ресейлiк медицина гылымдары академиясыныч сiбiрлiк бвлiмшесiнiч «Клиникалык жэне тэжiрибелiк лимфо-логиялар гылыми зерттеу институты» федералдык мемлекеттiк бюджеттiк мекемесi, Новосибирск, Ресей
Ресейде 2000-га жуык европеоидтык нэстдерге генотиптердiч промоторль аймактарындагы гендер, цитокиндер топтарына белу Yшiн гылыми зерттеулер жYргiзiлдi. Соныч iшiнде 500-ге жуыгы сау, кант диабелшч екi тYрi, ревматоидты артрит, остеопороз, миокард инфакт жэне сYт без^ч катерлi iсiгi, созылмалы вирустык гепатит жэне т.с.с. сол сиякты аурулар наукастарда кездеседк Зерттеуге цитокиндi гендердiч промоторлы аймагында полиморфизмдi анализ косылды: ол МВ-31 СТ, -511 СТ; IL2-330 СТ; ^4-590 СТ; IL5-703 СТ; ^6-174 GС; IL10-592 АС, -1082 АG; TNFA -308 AG, -238 AG, -863 АС; VEGF +936 СТ, -2578 АС. Сау жэне наукас адамдардыч анализiнде генотиптердiч орналасуы квбiнесе полиморфизмдi нYктелер санына сай, бiрге орналаскан аллелдер тYрлерiмен жэне белек орналаскан гендердiч аркасында жача жол табылды. Эр аллелдiч, генотиплч орналасуындагы 2-лiк, 3-лiк, 4-лiк, 5-лт 6-шылык жэне т.с.с генотиптер кездесу житИн кезектесiп талдайтын сэйкес жача жолмен камтамасыз етедi. Цитокиндер генотитшч теориялык мYмкiн орналасуын кiшкене бвлИ гана сау адамдар тобына, ауру адамдардыч тобында да аныкталатындыгы керсеттдк Сау адамдар арасындагы генотиптiк цитогендт комбинациясыныч орналасу саны жасы Yлкейген сайын азаятыны акикат. Сау адамдардагы жиiлiгi минимальды жэне ауру адамдардагы житИ максимальды болатын цитокиндердiч генотиптер^ч комбинацияларын аныктау мYмкiн болды, эртYрлi аурулардыч даму каупiне биологиялык маркер ретшде карауга мYмкiндiк бередi. Цитокиндi генотиптермен аурудыч дамуы гана емес, сонымен катар клиникалык полиморфты мультифакторы аурулардыч даму жолдарын накты квруге жэне эр наукасты жекелей емдеу эдiсiн аныктауга мYмкiндiк беретiн клиникалык агымдардыч тYрлерi де тыгыз байланысты болып шыкты.
Нег'зг'! свздер: генотип, аллел, полиморфизмдi нYктелер.
SUMMARY
V.I. KONENKOV
CYTOKINES POLYGENIC COMPLEXES - MARKERS OF INDIVIDUAL ADJUSTMENT OF A CONDITION CYTOKINE NETWORK OF THE HEALTHY PERSON AND PATIENTS WITH DISEASES OF THE VARIOUS NATURES
Federal state budget institution of "Scientific research institute of the clinical and experimental lymphology" Siberia section of Russian Academy of medical science Novosibirsk, Russia
It has been carried out research of character of genotypes' distribution of promoter areas of cytokines' genes in the group of more than 2000 persons of the Russian Caucasian population. Among them more than 500 healthy persons and patients with a 2nd type's diabetes, a rheumatoid arthritis, a osteoporosis, acute myocardium infarction, a breast cancer, a chronic virus hepatitis, etc.
Research contained the analysis of promoters regions' polymorphism of genes of the following cytokines: IL1B-31 CT,-511 CT; IL2-330 CT; IL4-590 CT; IL5-703 CT; IL6-174 GC; IL10-592 AC,-1082 AG; TNFA-308 AG,-238 AG,-863 AC; VEGF +936 CT,-2578 AC.
The new approach is developed by comparison of frequencies of occurrence not single variants of allelic gene of single genes of cytokines, but on the analysis of occurrence of combinations of genotypes of some cytokines' genes on the big number of points of polymorphism at healthy and sick people.
The developed software consistently analyzes frequency of occurrence of everyone alleles of a genotype, combinations from 2, 3, 4, 5, 6 and so on genotypes. It is shown, that only small part of theoretically possible combinations of cytokines' genotypes comes to light in groups both healthy, and sick persons.
This really existing number of combinations cytokines' genotypes among healthy persons progressively decreases with the aging. It was possible to reveal combinations of cytokines' genotypes which frequency is minimal among healthy persons and it is maximal in group of patients that allows considering revealing of these combined cytokines' genetic parameters as biological markers of risk of development of various diseases.
It has been received, that with cytokines' genotype closely connected not only development of diseases, but also their clinical variants, that allow expecting more precisely ways of development of clinically polymorphic multifactorial diseases, and is personalized to define tactics of treatment of each patient.
Key words: genotype, allele, point of polymorphism.
16
/iБатые Цазацстан медицина журналы №4 (36) 2012 ж.
