CC BY
52
Возможности прогнозирования инсулинзависимого сахарного диабета в семьях больных на основе исследования генетических маркеров_________________________________________________
Т.Л. Кураева. В.А. Петеркова. ::В.В. Носиков. ' Л.С. Сергеев. II.И. Дедов
Эндокринологический научный центр (дир.-акад. РАМН И.И.Дедов), Москва
* Государственный научный центр “Гос НИИ Генетика” (дир. - член-корр. РАН В.Г. Дебабов), Москва
В основе ИЗСД лежит абсолютная инсулиновая недостаточность, развивающаяся в результате аутоиммунного разрушения островко-вых Р-клеток у генетически предрасположенных индивидуумов. В настоящее время ИЗСД рассматривается как многофакторное заболевание, причинами развития которого являются как факторы внешней среды, так и генетическая предрасположенность.
В геноме человека были идентифицированы два локуса, связанные с предрасположенностью к развитию ИЗСД: локус НЬА. расположенный на хромосоме 6р21.3, и область, расположенная на хромосоме 11 р 15.5, в которую входит ген инсулина. Эти два локуса получили обозначения ГОВМ1 и ГОБМ2 соответственно. и они определяют около 40гг от общего генетического риска развития ИЗСД [2].
Хорошо известна связь ИЗСД с Б!?. БР и БО-антигенами системы НЬА. В последние годы обнаружена ассоциация этого заболевания с различными аллелями генов НЬА-ООА1/В1. Предпринимаются попытки прогнозирования развития сахарного диабета на основании комплексных иммунологических, имму-ногенетических и гормональных исследований. Однако значение генетических факторов в повышении прогностической ценности этих исследований пока изучено недостаточно. Кроме того, принимая во внимание популяционные различия в частоте встречаемости антигенов НЬА-системы, оценка риска должна быть уточнена для каждой популяции. Для русской популяции эти исследования проведены впервые.
Целью настоящей работы было изучение возможности генетического прогнозирования ИЗСД в семьях русской популяции на основе исследования генетических маркеров, ассоциирующихся с сахарным диабетом.
Определение НЬА-антигенов классов I. II (А. В и БЫ) и полиморфных аллелей генов НЬА-БО проведено у 480 человек русской национальности: больных случайной выборки (145 человек), здоровых (121 человек) и в 26 ядерных семьях, конкордантных по ИЗСД, с двумя и более больными сносами, и в 20 семьях с дис-кордантными по ИЗСД сносами. Возраст больных колебался от 2 до 43 лет. Возраст манифестации диабета был от 1 года до 32 лет.
Для выявления антигенов НЬА - А. В и БИ использовались сыворотки из коллекции Санкт-Петербургского НИИ гематологии и переливания крови М3 РФ с включением коммерческих сывороток фирм "ВоегЫг^" и "Ре1-Ггеег" и сывороток из коллекции XI заседания международной Рабочей группы по гистосовместимости. Полная или обогащенная суспензия лимфоцитов получена методом, основанным на элиминации Е-розеткообразующих клеток с использованием эритроцитов барана, обработанных нейроаминида-зой.
Типирование аллельных вариантов генов НЬА БОА1 и БОВ1 проводилось методом полимеразной цепной реакции с последующей гибридизацией фрагментов с олигонуклеотидными зондами, специфичными к определенным аллелям.
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью компьютерных программ, разработанных А.С. Сергеевым (Медико-генетический научный центр РАМН). Сравнение частот маркерных генов проводили с помощью ^критерия Стьюдента или по критерию X. При малочисленных выборках использовался критерий X с коррекцией Йетса на непрерывность выборки либо применялся “точный" метод Фишера для четырехпольных таблиц. Относительный риск (ИЮ рассчитывали по формуле:
(а+0,5) (гі+0,5)
КИ=---------------------,
(Ь+0.5) (с+0,5)
где а — число лиц с наличием и Ь— с отсутствием данного маркера среди больных: с и сі - число лиц с наличием и отсутствием соответственно данного марке-с-а среди здоровых, параметр 0.5 использовался как “оправка на малочисленность выборки.
Абсолютный риск. т.е. условную вероятность раз-зития заболевания у лиц. носителей данного генетического маркера или их комбинаций, рассчитывали по методу Байеса:
. _ ОР (Оі/БКР/Б)
Аі (Б/Оі)
где Аг (Б / О і) - вероятность развития заболевания, условная по носительству данного гена (генотипа), т.е. абсолютный риск;
ОР (Оі/Б) - частота генотипа Сі по данным опыта;
Р(Сі/Б) - частота генотипа Оі у здоровых;
Р(Б) - риск развития заболевания в популяции (безусловный).
Анализ семейного материала по гаплоидентичнос-т:: сибсов проводился методом пораженных сибсовых пар с использованием условно вероятностного подхо--а [1]. “
Повторный риск развития СД для пар сибсов в зависимости от их конкордантности по генетическим маркерам (гаплотипам) рассчитан на основании метода эмпирической оценки, разработанного Сергеевым А.С.
Метод основан на комбинаторном анализе распределения гаплотипов с помощью "конвертирующих" коэффициентов, с использованием условно-вероятностного подхода. При этом на основе данных по общему повторному риску (не дифференцированному по гаплотипам) проводится коррекция соотношения объемов выборок конкордантных и дискордантых по заболеванию семей.
При анализе полученных данных выявлены существенные отклонения в распределении НЬА-антиге-
нов при ИЗСД. Обнаружено статистически достоверное повышение частоты В16 (25,09 против 5,7Тс, р<0,01). DR4 (51,7гг против 19,1гг, р<0,01) и гетерозиготы DR3/DR4 (24,1Г( против 2Г<, р<0,01). Обнаружена также отчетливая тенденция к снижению DR2 у больных ИЗСД (0.7Г( против 35.6гг.).
Однако антигены DR3 и DR4 не являются сильными генетическими маркерами, поскольку более 50сс здоровых людей имеют один или другой антиген или их комбинацию. В современной научной литературе имеются сообщения о том. что ассоциации с DR-антигенами могут быть вторичными по отношению к DQ-антигенам. Оказалось, что гены подлокуса HLA-DQ более тесно сцеплены с ИЗСД, чем гены DR. Кроме того, в отличие от других подлокусов гены DQA1 и DQB1 оказались полиморфными. У гена DQA1 было идентифицировано 8 аллелей, которые были условно разделены на 2 группы: кодирующие остаток аргинина в 52 положении (Arg 52 ) и некодирующие его в этом положении (A.i'g 52'). У гена DQB1 идентифицировано 14 аллелей, которые условно могут быть разделены на аллели, содержащие остаток аспарагиновой кислоты в 57 положении (Asp 57") и не содержащие его (Asp 57").
Распределение носительства аллелей генов DQA1 и DQB1 у больных сахарным диабетом и в контрольной группе представлено в табл. 1, 2.
У больных ИЗСД достоверно чаще встречались аллели DQA1*0301 и 0401. DQB1!:0201 и 0302 и реже по сравнению с контрольной группой встречались аллели DQA1*0101 и 0201, DQBl-'‘0503, *0602, *0603, "0301.
Полученные результаты позволяют условно обозначить аллели, кодирующие остатки Arg 52" А- цепи и Asp 57‘В-цепи, как предрасполагающие (S) к развитию ИЗСД, а аллели, кодирующие Arg 52‘ и Asp 57", как протекторные (Р). Предрасполагающие аллели гена HLA- DQA1 обнаружены у 839г больных, а гена DQB1 - у 87%. Для здоровых эти величины равны соответственно 45 и 47гг. Наибольший риск развития диабета имеют носители аллелей DQA1S'0301 и DQB1 0302.
Существенно более надежные оценки риска могут быть получены, если в качестве маркеров рассматриваются не отдельные аллели генов HLA-DQA1 и DQB1, а их комбинации.
Таблица 1
Распределение носительства аллелей гена Н1.А-РОА1 среди больных ИЗСД и здоровы» индивидуумов
Аллели гена Остаток Агд в Больные Контроль, % RR Р
HLA-DQAI положении 52 ИЗСД, %
DQA1 ”0101 . 26 66 0,19 <0,001
DQA1 *0201 - 7 24 0,25 <0,001
DQA1 *0301 + 86 32 12,34 <0,001
DQA1 *0401 + 67 50 1,93 <0,002
Таблица 2
* I
Распределение носительства аллелей гена Н1.А- РОВ1 среди больных ИЗСД и здоровых индивидуумов
Аллели гена HLA-DQAI Остаток Arg в положении 52 Больные ИЗСД, % Контроль, % RR Р
DQB1 *0501 - 17 24 >0,5
DQB1 *0502 - 2 2 - >0,5
DQB1 *0503 + 0 11 0,03 <0,001
DQB 1*0601 + 3 3 - >0,5
DQB 1*0602 + 0 14 0,03 <0,001
DQB 1*0603 + 0 20 0,02 <0,001
DQB 1*0604 - 4 6 - >0,5
DQB1 *0201 - 64 36 3,15 <0,001
DQB1 *0301 + 17 36 0,37 <0,005
DQB1 *0302 - 71 17 11,40 <0,001
DQB1 *0303 + 7 9 - >0,5
DQB1 *04* + 4 7 - >0,5
Примечание: RR, р-достоверные различия между группами; здесь и в табл. 2, 3.
В табл. 3 представлена частота распределения всех возможных комбинаций у больных и в контрольной группе.
Таблица 3
Распределение комбинаций предрасполагающих (5) и протекторных (Р) аллелей Н1А-[Ю среди больных ИЗСД и в контрольной группе
HLA-DQ А/В Больные ИЗСД, % п=113 Контроль, % п=121 RR Р
SS/SS 52 4 23,12 <,001
SP/SS 23 8 3,21 <,005
SS/SP 16 12 0,1 <,1
SP/SP 7 20 0,02 <,01
PP/SS 1 7
SS/PP 1 8
PP/SP 0 17 0,02 <,001
SP/PP 0 16 0,02 <,001
рр/рр 0 8 0,04 <,001
Частота гаплотипа с 4 предрасполагающими аллелями (SS/SS) у больных СД составила 52с/с против 4Ъ в контрольной группе (RR=23.1. р<0.001). Генотипы, состоящие из трех предрасполагающих и одного протекторного аллеля, можно разделить на две подгруппы. Когда гаплотип S-S представлен у гена DQB1. а S-Р -у DQA1, то соответствующие генотипы встречаются у больных достоверно чаще (RR=3,21. р<0.005), чем в случае ситуации S-S от DQA1 и S-Р от DQB1. Последние генотипы также представлены чаще среди больных. однако не достигают статистически значимых уровней. Можно предположить, что большое значение в развитии заболевания имеют аллели HLA- DQB1, кодирующие Asp 57. Среди больных снижена частота комбинаций из двух предрасполагающих и двух про-
текторных аллелей и не обнаружено индивидуумов с тремя и четырьмя протекторными аллелями, в то время как в контрольной группе частота таких комбинаций (ЕЕ=0.02-0,04. р<0.001) составляла 56г< (рис. 1).
%
40,----------------------------------------------,
Si
SS-SS SP-SS SS-SP SP-PS SS-PP Другие □ Больные с ИЗСД ■ Здоровые
Рис. 1. Частота встречаемости генотипов ООА1/РОВ1 в зависимости от количества предрасполагающих (Б) и протективных (Р) аллелей у больных ИЗСД и здоровых индивидуумов.
Абсолютный риск развития ИЗСД у носителей четырех предрасполагающих аллелей составил 2,549с, что в 13 раз выше популяционного, рассчитанного нами для Москвы. Для носителей трех предрасполагающих аллелей риск составил 0.4*4, а для всех остальных индивидуумов - 0.05гг и ниже (рис. 2).
На рис. 3 представлена сравнительная характеристика исследованных генетических маркеров по показателю относительного риска развития СД. Наиболее слабым из всех значимых маркеров оказался В(ЗВГ:0201. далее по возрастающей следуют Б114, В16, В<ЗВГ!0302, БдАГ!0301, 0113/0114, БЭ/БЗ.
і
С.і
*гс. 2. Абсолютный риск развития ИЗСД в популяции в зависимости от комбинации предрасполагающих (Б) и протекторных (Р) аллелей в ША-ЭО генотипе.
25 20 15 10 5 0
Рис. 3. Относительный риск развития ИЗСД в популяции в зависимости от генетического маркера.
*0201 *0302 *0301
ББ-ББ БР-ББ Другие Популяционный
комбинации риск
Индивидуальные оценки риска развития ИЗСД у здоровых сибсов могут быть получены при исследовании степени их генетической общности с больным про-бандом по генетическим маркерам, ассоциированным с ИЗСД.
Метод определения идентичности по гаплотипам, наследуемым от предков (1ВБ), позволяет проводить сравнение распределения пар сибсов. идентичных по
2. 1 или 0 маркерным гаплотипам. Для выполнения этих исследований потребовались семьи, сгруппированные в подгруппы в зависимости от числа больных индивидуумов. Первая подгруппа включала 26 семей, в которых имелось два или более сибсов, конкордант-ных по наличию ИЗСД. Вторая подгруппа - 20 семей, в которых имелись сибсы, дискордантные по ИЗСД с пробандом. В качестве генетической "метки” использовались А, В и БЕ-антигены системы НЬА и аллели А- и В-цепи НЬА-БСЗ. Сравнение полученных данных проводилось с ожидаемым случайным распределением 1:2:1 или 25:50:25. В первой подгруппе это соотношение составило 62,2:26.9:3.9. Отличие от случайного распределения было высоко достоверно (Х=27.8. р<0,001). Во второй подгруппе соотношение было 21,4:64.3:14.3. что существенно не отличается от случайного распределения 25:50:25 (р<0,05).
На основании проведенных исследований получена эмпирическая оценка повторного риска для сибсов в зависимости от идентичности их по гаплотипам. В случае идентичности здорового сибса с больным по двум гаплотипам риск развития заболевания у него составляет 17гг. по одному гаплотипу - 39с, у гаплоразлич-ных сибсов - 0,85гс. При этом средний риск развития ИЗСД для сибсов без подразделения на гаплотипы принят на основании наших предыдущих исследований и составляет 6,4гс.
Суммируя данные, полученные при генетическом типировании больных ИЗСД и при изучении гаплои-дентичности сибсов, конкордантных и дискордантных по ИЗСД. можно выделить 3 группы генетического риска развития этого заболевания в семьях больных (табл. 4).
Гэбгчца \
Степень генетического риска в семьях больных ИЗСД в зависимости от комбинаций предрасполагающих (Б) и протекторных (Р) аллелей, носительства конкретных аллелей ША-ОО-генов и гаплоидентичности сибсов
Группа риска Комбинации Б и Р аллелей Носительство конкр.аллелей или НЬА-аг Г аплоидентичность сибсов
Высокий ББ/ББ РОА 1*0301 ,0(2В 1*0302 По 2
йР!3,4 гаплотипам
Средний ББ/БР ОС! А1 *0401 ,йОВ1 *0201 По 1
ОР!4, В16 гаплотипу
Низкий ББ/РР БР/РР Все остальные аллели По 0
РР/РР йР!2 гаплотипов
998
37
С увеличением объема исследований этот риск может быть оценен для родственников больных в цифровом выражении с учетом числа больных и здоровых родственников, возраста консультируемых и возраста манифестации ИЗСД. В дальнейшем могут быть получены суммированные оценки риска, учитывающие все исследуемые показатели.
Исследованные генетические маркеры являются лишь частью генов, определяющих предрасположенность к развитию ИЗСД. Изучение всей совокупности генетических маркеров, определяющих развитие этого заболевания. - задача ближайшего будущего в рамках исследований по Программе "Геном человека".
Кратко резюмируя полученные данные, следует отметить, что у больных ИЗСД русской популяции Москвы имеет место существенное повышение частоты встречаемости антигенов НЬА-В16 и БИ-А, гаплотипа ВЫЗ/БЫ-!. а также аллелей генов НЬА-ВОА1*0301 и 0(361*0302. Относительный риск при этом составил соответственно 5.55; 4,53; 17,58; 12,34; 3.15. Аллели, кодирующие А^52(~) в А-цепи и Аэр57Г) в В-цепи. встречаются чаще среди больных ИЗСД по сравнению с контрольной группой, что говорит об их предрасполагающей роли в развитии ИЗСД. Аллели, кодирующие А^52П и Аэр57П. встречаются реже при ИЗСД, что позволяет отнести их к про-
текторным. Риск развития ИЗСД зависит от комбинации предрасполагающих и протекторных аллелей в генотипе. Для лиц с наличием 4 предрасполагающих аллелей абсолютный риск составил 2.54г<\ что примерно в 13 раз превышает популяционный риск развития заболевания. Для лиц. носителей трех предрасполагающих и одного протекторного аллелей, риск составил 0,4гс. Для всех остальных комбинаций риск был существенно ниже популяционного. Среди пар сносов, больных ИЗСД. отмечено достоверное увеличение частоты идентичности по двум HLA-гаплотипам. У сносов. дискордантных по ИЗСД (один сибс болен, второй здоров), распределение их по степени HLA-идентичности не отличалось от случайного. Риск развития ИЗСД для сносов, идентичных с больным по двум HLA-гаплотипам. составил 17гг. по одному гаплотипу - 3“vr, полностью различных - 0,859г.
Литература
1. Сергеев А.С.//Генетика. - 1991. - Том 27. - № 11. — С.2021-2034.
2. Bennett S., Todd J.//Diabetes Rev. Intern. - 1996. -Vol. 5. - № 2. - P.2-6
3. Joslin's Diabetes Mellitus//Ed. Kahn C.R.. Weir G.C. - Waverly Company: Lea, Febiger, 1994. - 1068 P.
