CC BY
322
23. Patel R. MALDI-TOF-mass-spectrometry: transformative proteomics for clinical microbiologi. Clin. Chem. 2013; 59 (2): 340—2.
24. Gaillot O., Blondiaux N., Loiez C., Wallet F., Lemaitre N., Herwegh S. et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 2011; 49 (12): 4412.
25. Sivolodskiy E.P., Zueva E.V., Kunilova E.S., Bogumil'chik E.A., Doma-kova T. V. Identification of strains Pseudomonas Fulva clinical techniques
microbiology
MALDI-ToF mass spectrometry and conventional studies. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2015; (1): 46—9. (in Russian) 26. Kawasaki Y., Matsubara K., Ishihara H., Nigami H., Iwata A., Kawa-guchi K. et al. Corynebacterium propinquum as the first cause of infective endocarditis in childhood. J. Infect. Chemother. 2014; 20 (5): 317—9.
Received 14.12.15
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2016 УДК 616.3-022.7-073.524.325
Бочарова Ю.А., Чеботарь И.в., Маянский Н.А.
ВОЗМОЖНОСТИ, ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ В МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
ФГБУ «Научный центр здоровья детей» Минздрава России, 119991 Москва, Российская Федерация
Обзор литературы посвящен анализу возможностей, недостатков и перспектив важной прикладной технологии, которая стремительно внедряется в медицинскую микробиологию, — масс-спектрометрии (МС). Главным достижениемМС является быстрая и надежная идентификация большинства актуальных для медицины видов микробов, производимая не только из чистых культур, но и из биологического материала. Существуют лишь единичные таксономические группы, представители которых недостоверно идентифицируются при помощи МС. Приводятся примеры методов внутривидового определения клинически/эпидемиологически значимых штаммов и оценки их свойств, включая вирулентность и резистентность. Перспективы МС связаны с внедрением в микробиологическую практику способов оценки вирулентности, резистентности и типирования. Главные проблемы микробиологической МС заключаются в несовершенстве идентификации микроорганизмов в смешанных культурах (включая биологический материал) и отсутствии стандартных критериев в оценке антибиотикорезистентности микробов.
Ключевые слова: масс-спектрометрия; микробиологическая диагностика; идентификация; резистентность; ти-пирование; вирулентность.
Для цитирования: Бочарова Ю.А., Чеботарь И.В., Маянский Н.А. Возможности, проблемы и перспективы масс-спектрометрических технологий в медицинской микробиологии (обзор литературы). Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61 (4): 249-256 DOI 10.18821/0869-2084-2016-61-4-249-256 Bocharova Yu.A., Chebotar I.V., Mayanskii N.A.
THE POSSIBILITIES, PROBLEMS AND PERSPECTIVES OF MASS-SPECTROMETRY IN MEDICAL MICROBIOLOGY: PUBLICATIONS REVIEW
The research center of children health of Minzdrav of Russia, 119991 Moscow, Russia
The publications review deals with analysis of possibilities, shortcomings and perspectives of mass-spectrometry - important applied technology that is headlong introduced in medical microbiology. The main achievement of mass-spectrometry is fast and valid identification of most species of microbes actual for medicine both in pure growths and biologic samples. There are only single taxonomic which representatives are identified unreliably in case of using of mass-spectrometry. The examples are given concerning methods of intraspecific identification of clinically/epidemiologically significant strains and evaluation of their characteristics, including virulence and resistance. The perspectives of mass-spectrometry are related to implementation into microbiological practice the modes of evaluation of virulence, resistance and identification of microorganisms in mixed cultures (including biological samples) and absence of standard criteria in evaluation of antibiotic resistance of microbes.
Keywords: mass-spectrometry; microbiological diagnostic; identification; typing; virulence
For citation: Bocharova Yu.A., Chebotar I.V., Mayanskii N.A. The possibilities, problems and perspectives of mass-spectrometry in medical microbiology: publications review. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2016; 61 (4): 249-256. (in Russ.) DOI: 10.18821/0869-2084-2016-61-4-249-256
For correspondence: ChebotarI.V., doctor of medical sciences, leading researcher of laboratory of microbiology. e-mail: nizarnn@yandex.ru
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests.
Financing. The study was carried out with financial support of Minobrnauka of Russia (agreement № 14.607.21.0064, unique identifier of applied scientific studies RFMEFI 60714x0064)
Received 10.12.2015 Accepted 15.12.2015
Для корреспонденции: Чеботарь Игорь Викторович, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии ФГБУ «Научный центр здоровья детей» Минздрава России, электронная почта: nizarnn@yandex.ru
микробиология
Согласно мировой статистике, болезни, ассоциированные с инфекционным процессом, составляют значительную часть в структуре заболеваемости и смертности [1]. Основой эффективных лечебно-профилактических мероприятий является быстрая и качественная идентификация возбудителя инфекции. Существующие способы микробиологической диагностики, основанные на культивировании микробов на питательных средах, не всегда отвечают запросам современной клинической медицины и эпидемиологии. Они достаточно информативны, но обладают серьезным недостатком — длительностью выполнения, которая может приводить к несвоевременной постановке диагноза и задержке назначения антибактериальной терапии. Это увеличивает вероятность негативных исходов заболевания. Возникает необходимость внедрения новых диагностических технологий, которые могли бы обеспечить высокую скорость (не более нескольких часов), большую производительность, достаточную чувствительность и экономическую доступность клинико-микробиологического анализа. Важным требованием к технологии является возможность получения достоверных результатов при работе с полимикробными биологическими образцами, содержащими смесь различных микробов.
Основные технологии идентификации, отвечающие перечисленным требованиям, реализуются на основе нескольких подходов — иммунохимических реакций, гибридизации, сек-венирования нового поколения, масс-спектрометрии (МС). У каждого из перечисленных способов есть свои преимущества и недостатки [2].
Цель настоящего обзора — проанализировать возможности, недостатки и перспективы масс-спектрометрических технологий в микробиологической диагностике.
Принципы масс-спектрометрии. Технология МС основана на принципе построения спектров — совокупности числовых характеристик (спектральных сигналов или пиков), отражающих отношение массы к заряду (m/z) ионизированных компонентов анализируемого вещества. Ионизация осуществляется посредством различных методов: химической ионизации, ионизации в электрическом поле, электроспрей-ионизации (ESI, от англ. electrospray ionisation), ионизации вторичными ионами, матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI MS, от англ. matrix-assisted /aser çfesorption ionization mass spectrometry). В зависимости от способа определения отношения m/z для ионов различают следующие масс-анализаторы: квадрупольный, время-пролетный (TOF, от англ. rime of ^ight), ионная ловушка и др. Далеко не каждый из МС-методов может быть применим к задачам клинической микробиологии. Например, в силу «хрупкости» сложных биополимерных молекул и отсутствия у них способности переходить в газовую фазу в неизменном виде их нельзя ионизировать электронным ударом. Именно поэтому в сфере медицины наиболее широкое применение нашли такие виды МС, как MALDI-TOF и ESI-TOF.
Иногда для повышения качества анализа используются системы тандемной МС, где применяются 2 последовательно соединенных в одном приборе масс-спектрометра (например, MALDI-TOF/TOF) или комбинация жидкостной хроматографии и МС (LC-MS — от англ. /iquid çhromatography — mass spectrometry).
МС позволяет анализировать различные биополимеры: протеины, липиды, нуклеиновые кислоты, полисахариды. Многие из них обладают уникальными спектральными характеристиками, позволяющими идентифицировать их в качестве клинически значимых маркеров, что и является причиной интереса медицинской микробиологии к данной технологии. Использование МС возможно по многим направлениям диагностики: идентификация видов возбудителей (в том числе в клинических образцах), внутривидовое типиро-
вание, определение чувствительности к антибактериальным препаратам, выявление факторов патогенности и др.
Идентификация. Возможности идентификации зависят от технических параметров масс-спектрометров, свойств изучаемого объекта, пробоподготовки и биоинформатического обеспечения. Современной промышленностью серийно выпускаются приборы, которые нацелены на идентификацию бактерий и микроскопических грибов. Наиболее часто в микробиологии используются масс-спектрометры фирм Bruker (серии Microflex, Autoflex, ultrafleXtreme) и bioMereux (Vitek-MS). На базе времяпролетного масс-спектрометра LaserToF LT2 Plus (производство SAI) НПФ «Литех» создал первую отечественную систему МС-идентификации микроорганизмов MALDI BactoSCREEN [3]. Все перечисленные приборы обладают достаточной чувствительностью и разрешающей способностью, имеют простой и удобный пользовательский интерфейс.
Однако даже при использовании приборов с хорошими техническими показателями требуется пробоподготовка, нацеленная на выделение и концентрацию диагностически значимых компонентов изучаемого образца, которые отражают таксономическое положение возбудителя. Возможны различные варианты пробоподготовки: форетические методы, микрофлюидные технологии, мембранное фракционирование. Даже прямое профилирование бактериальной массы, проводимое в рамках стандартных протоколов MALDI-TOF-идентификации, тоже подразумевает проведение пробопод-готовки — лизис клеток и экстракцию кислотоустойчивых протеинов компонентами раствора (трифторуксусная кислота, ацетонитрил), в котором матрица наносится на мишень. Тщательное разделение компонентов обеспечивают методы классического фореза, но они длительны в исполнении и поэтому неудобны для практики клинической микробиологии. Самыми перспективными являются микрофлюидные и мембранные технологии, которые в сочетании с использованием электромагнитного поля и/или наночастиц позволяют «отфильтровать» молекулярные структуры для МС-анализа. Время обогащения материала на новейших микрофлюидных чипах измеряется минутами [4].
Для получения корректных результатов MALDI-TOF MS исключительно важна матрица, которая обеспечивает получение специфических для аналита спектральных характеристик, а следовательно, его «узнаваемость». Выбор матрицы обусловлен типом анализируемого вещества [5—10]. Для анализа белков чаще применяются а-циано-4-гидроксикоричная, феруловая, синапиновая, 2,5-дигидроксибензойная кислоты (последнюю реже используют для исследования олигону-клеотидов и полисахаридов). 2,5-Дигидроксибензойная, си-напиновая кислоты, норхарман используются и для исследования липидов. Для анализа нуклеотидов чаще выбирают 3-гидроксипиколиновую кислоту.
Программные пакеты, поддерживающие работу масс-спектрометров, обеспечивают статистическую обработку полученных спектров и их сравнение с референтными спектрами известных микробов. На масс-спектрометрах Bruker вероятность принадлежности исследуемого спектра к известному таксону оценивается по шкале Score: для бактерий хорошая видовая идентификация соответствует Score > 2,000, родовая — от 1,700 до 1,999 [11, 12]. Современная МС-система выполняет уверенную идентификацию моновидовых культур нескольких тысяч бактериальных видов и грибов. Для базы данных vitek-MS (bioMereux) — 750 клинически значимых видов (бактерий, дрожжей, плесневых грибов/дерматофитов, микобактерий), для Biotyper (Bruker) — более 2500 видов в основной базе данных, 149 видов микобактерий и более 100 видов мицелиальных грибов — в дополнительных. Имеется положительный опыт МС-идентификации возбудителей
I—II групп патогенности на основе локальных баз данных [13]. Базы постоянно обновляются, и их объем вполне достаточен для того, чтобы соответствовать требованиям типовой клинико-микробиологической лаборатории.
Показано, что МС может быть успешно использована в вирусологической диагностике. Это подтверждается данными J. Majchrzykiewicz-Koehorst и соавт. [14], в которых проанализированы результаты идентификации респираторных вирусов при помощи технологий MALDI-TOF и LC-MS/ MS. Обе технологии обеспечивали верную диагностику, но в случае LC-MS/MS чувствительность была выше. Еще одним преимуществом LC-MS/MS оказалась возможность выявления вирусов непосредственно из клинических образцов.
Начав с идентификации чистых суточных культур, МС преодолела принципиально важный рубеж, достигнув способности определять таксономическую принадлежность микробов в биологическом образце. Существующие протоколы экстракции бактериальных белков из клинических образцов позволяют довольно точно идентифицировать микроорганизм. В мономикробных гемокультурах MALDI-TOF-системы Vitek и Biotyper [15] определяют возбудитель с высокой достоверностью, обеспечивая 92,3 и 97,8% верных результатов соответственно. МС-анализ образцов мочи, инфицированной одним видом микроорганизмов, также демонстрирует высокий процент верно идентифицированных возбудителей (91,8 %) [16]. Внедрение дополнительных этапов подготовки существенно повышает этот показатель. Например, добавление к образцу детергента додецилсульфата натрия улучшает идентификацию в 46,7% случаев [17]. Метод диафильтрации при пробоподготовке позволяет достигать высоких показателей score даже при низкой концентрации возбудителей в образце [18]. Возбудители, локализующиеся в спинномозговой жидкости, также могут быть диагностированы непосредственно из клинического материала [19, 20]. Klebsiella pneumoniae определялась из ликвора с достаточно высокой достоверностью (показатель Score = 2,09). Стрептококки (Streptococcus pneumoniae) и бруцеллы (Brucella me-litensis), находящиеся в спинномозговой жидкости, диагностировались менее надежно: Score составлял соответственно 1,94 и 1,88.
При МС-идентификации микробов приходится сталкиваться с рядом трудностей. Первая и основная из них — недостоверная идентификация возбудителя в биологическом образце, содержащем несколько микроорганизмов. Показано, что среди неидентифицируемых культур из проб крови от 17,3 до 32,3% составляют полимикробные культуры [21— 23]. В образцах мочи, содержащих несколько видов, верная идентификация достигается лишь в единичных случаях [24].
Второй недостаток обусловлен сложностями МС-определения представителей отдельных таксономических групп, которые получили название «трудно идентифицируемые таксоны». Среди представителей рода Nocardia верно идентифицируются до вида лишь 14,9%, рода Kocuria — 26,7 % [25]. Трудно идентифицируемыми являются представители мицелиальных грибов. Коммерческие базы данных, обеспечивающие работу масс-спектрометров, медленно пополняются спектрами этих микроорганизмов, что и служит причиной ошибок идентификации. Так, по данным на 2013 г., верная идентификация до рода регистрировалась лишь у 6,2% изолятов мицелиальных микромицетов [26]. Вместе с тем МС-дифференцировка грибов не ограничена принципиально непреодолимыми барьерами, что подтверждено положительным опытом использования локальных баз данных (достоверность результатов 88,9%) [26, 27].
Третья проблема МС-диагностики связана со сложностью в идентификации близкородственных микроорганизмов, таких как 1) пневмококк и группа зеленящих стреп-
microbiology
тококков, 2) кишечная палочка и различные виды шигелл. Трудности дифференцировки Escherichia coli и Shigella spp. не являются удивительными, если учесть, что некоторые эксперты по таксономии до сих пор говорят о нецелесообразности выделения этих бактерий в самостоятельные виды [28]. В недавних исследованиях предложено решение проблемы МС-распознавания этих видов. Определены особенности масс-спектрограмм, позволяющие различать S. pneumoniae и Streptococcus mitis-group [29]. В частности, наличие двух пиков m/z, численно равных 2937 и 5877, позволило верно идентифицировать значительный процент S. pneumoniae (99,1%). В спектрах непневмококковых штаммов часто встречались пики m/z = 2911, 5824, 6955; благодаря этому были верно определены до вида более 90% изолятов [30]. К настоящему времени системы Biotyper и Vitek MS успешно идентифицируют виды b-гемолитических стрептококков примерно в 95% случаев [31]. Российские исследователи получили несколько иные диагностические показатели: наиболее значимым для распознавания стрептококков был пик m/z = 6949, который присутствовал у изолятов S. mitis, но не встречался у S. pneumoniae [32]. В результате статистического анализа спектров Shigella sonnei, Shigella flexneri, Shigella boydii и E. coli были определены 12 пиков, полезных для дифференци-ровки этих видов (m/z = 2400, 3578, 3673, 5096, 5136, 6668, 8324, 8444, 8455, 9533, 10135, 13601). При использовании указанных значений в алгоритме идентификации перечисленные микроорганизмы определялись правильно более чем в 80 % случаев [33].
Масс-спектрометрическое исследование внутривидовых особенностей. В спектрах микроорганизмов, кроме «видовых» спектральных сигналов, можно выявить пики, характерные только для определенных штаммов. Это легло в основу масс-спектрометрического внутривидового типирования. Было показано, что среди представителей некоторых видов штаммовые отличия спектров выражены слабо (например, у Neisseria gonorrhoeae). У таких видов, как Helicobacter pylori, напротив, спектры внутри вида различаются достаточно явно, что позволяет проводить внутривидовое разделение микроорганизмов с помощью МС (МС-типирование) [34].
Гетерогенность спектров внутри вида охарактеризована для многих микроорганизмов. Так, для E. coli обозначены как консервативные (общие для вида), так и характерные только для конкретных штаммов пики [35]. Найдены сигналы, позволяющие идентифицировать отдельные штаммы Legionella pneumophila, при этом результаты МС-типирования совпадают с результатами типирования с помощью пульс-электрофореза [36]. При кластерном анализе на основе спектров штаммы Acinetobacter baumannii были разделены на несколько групп, разделение тех же штаммов с помощью молекулярно-генетических методов (ПЦР повторяющихся последовательностей) давало похожие результаты [37]. Таким образом, соответствие МС-типирования и типирования с помощью других методов говорит о надежности МС-подхода и возможности его использования при поиске отдельных МС-вариантов, представляющих интерес для клиники. Это прежде всего касается выявления резистентных и вирулентных штаммов (см. ниже).
Весьма перспективным МС-типирование может стать для эпидемиологических расследований. Например, найдены характерные сигналы в спектре E. coli филогруппы В2 (ее представители наиболее вирулентны среди экстраинтести-нальных эшерихий), позволяющие отличать его от спектров других филогрупп (генетических линий) [38]. Идентификация отдельных категорий (патотипов) этого вида только по наличию специфических пиков в спектрах оказалась затруднительной. Для достоверности МС-дифференцировки пато-типов учитывалось не только присутствие, но и отсутствие
микробиология
определенных пиков (binary absence/presence fingerprint) [39]. Наличие сигнала с m/z = 9060 в спектрах E. coli стало отличительным признаком штаммов, не принадлежащих к серовару O157:H7 (энтерогеморрагический штамм), в масс-спектрах серовара O157:H7 пик 9060 отсутствовал [40]. ПЦР-риботипы Clostridium difficile также возможно различать при помощи MALDI-TOF МS [41]. Обозначены пики для идентификации высоковирулентного сиквенс-типа Streptococcus agalactiae ST-17 [42]. Следует отметить, что МС используется непосредственно для сиквенс-типирования: анализ спектров ампликонов ДНК позволяет определить нуклеотидные последовательности различных аллелей. Примером успешной апробации МС-сиквенс-типирования стали результаты MALDI-TOF-исследования пневмококков, которые соответствовали результатам традиционного мультилокусного сиквенс-типирования для 99% аллелей [43].
Описаны примеры использования MALDI-TOF-типирования при расшифровке причин эпидемиологических вспышек, в частности для характеристики изолятов S. pneumoniae, вызвавших вспышку конъюнктивита, и при типировании штаммов A. baumannii при внутрибольничных инфекциях [37, 44]. Апробировано использование локальной базы данных для ускорения диагностики токсигенных вариантов Streptococcus pyogenes при скарлатине [45].
Следует отметить, что дальнейший прогресс внутривидового типирования при помощи МС невозможен без дополнительных мероприятий по стандартизации. Необходимы методическая унификация и создание глобальных баз данных, содержащих типовые спектральные характеристики ре-ференсных штаммов (эпидемически и клинически значимых сероваров, токсигенных штаммов и т.д.). Весьма полезными могут оказаться локальные базы данных для конкретных географических областей с учетом свойств циркулирующих в них микроорганизмов. Создание стандартных глобальных и локальных баз данных позволит широко применять внутривидовую идентификацию с помощью МС.
В качестве отдельной задачи МС-технологий можно рассматривать оценку вирулентности возбудителя, которая определяется его способностью продуцировать факторы патоген-ности. Патогенность является многофакторным признаком, и свойства, определяющие ее (токсигенность, способность к адгезии/колонизации, способность к инвазии и ускользанию от иммунных эффекторов), могут распознаваться при помощи МС. Присутствие в спектрах отдельных пиков может позитивно коррелировать с наличием у микроорганизма ад-гезинов, ферментов, токсинов и т.д. Современная научная литература подтверждает подобное соответствие [46—49]. При помощи MALDI-TOF MS были идентифицированы бо-тулотоксины типов А, B, Е и F, дельта-токсин Staphylococ-cus aureus, гемолизины Vibrio parahaemolyticus. Были определены сигналы, отражающие наличие адгезинов cadF у Campylobacterjejuni. Среди стрептококков группы А удалось идентифицировать изоляты, вызывающие инвазивные заболевания (инвазивные штаммы), по специфическим для них МС-маркерам [50]. Серотип b Haemophilus influenzae, ассоциированный с наиболее тяжелыми течением гемофильной инфекции, также идентифицировался с высокой достоверностью (97—100% для различных алгоритмов идентификации) [51]. Были определены серовар-специфические сигналы (m/z = 2856, 3258, 4716, 5713) в спектре Salmonella typhi [52]. Показано, что MALDI-TOF МS позволяет выявить особо опасные серогруппы Vibrio cholerae (О1 и О139). Их идентификация связана с получением специфического МС-сигнала (m/z = 34565 +/- 31) белка наружной мембраны OmpU, консервативного для эпидемических штаммов [8].
Кроме высокой вирулентности существует еще один феномен, который негативно влияет на течение инфекционно-
го процесса и проявляется в виде формирования микробами биопленок. Своевременная диагностика биопленочного процесса позволяет скорректировать лечение и избежать осложнений [53]. Протеомный анализ биопленок на основе S. pneumoniae, выполненный при помощи технологии MALDI-TOF, показал достоверные различия в белковом составе биопленочных и небиопленочных образцов [54]. Аналогичные наблюдения, сделанные в отношении ацинетобактерий, си-негнойной палочки, кандид и других микробов, демонстрируют возможность применения МС для диагностики биопленочных процессов [55—58].
Масс-спектрометрическая оценка антибиотикорези-стентности. Подходы к МС-изучению антибиотикорези-стентности можно условно разделить на 2 группы: 1) определяющие наличие резистентности к конкретным препаратам без выявления механизма резистентности, 2) определяющие резистентность и раскрывающие ее механизмы.
Одним из подходов 1-й группы является определение жизнеспособности микроорганизмов в присутствии антибактериального препарата. Резистентные микроорганизмы в присутствии препарата продолжают функционировать, поглощая из питательной среды меченые питательные вещества (например, дейтерированные аминокислоты, обладающие специфическим МС-сигналом). Чувствительные к антибиотику микробы ингибируются и не накапливают метку. По разнице в их масс-спектрах делается вывод о резистентности. Такой методический подход получил название SILAC-технология (от англ. .stable isotope /abelling by amino acids in cell culture). Результативность SILAC продемонстрирована в опытах со штаммами S. aureus. Они инкубировались в средах с нормальным и дейтерированным лизином в присутствии и в отсутствие оксациллина [59]. В результате были выявлены «тяжелые» спектры (содержащие пики лизина с «тяжелыми» изотопами, m/z = 6490, 6995), характерные для резистентных штаммов, и обычные спектры чувствительных штаммов. Аналогичные результаты были получены с Pseudomonas aeruginosa [60]. Клетки P. aeruginosa культивировали в средах с нормальным и дейтерированным лизином, добавляя меропенем, тобрамицин, ципрофлоксацин. В МС-спектрах были обнаружены достоверные различия между устойчивыми и чувствительными штаммами.
В рамках первого подхода существуют методы, основанные на выявлении постоянно присутствующих специфических отличий масс-спектров резистентных штаммов, которые существенно отличаются от спектров чувствительных микроорганизмов [61]. При кластерном анализе разделение спектров на группы явно коррелирует с наличием резистентности [62]. Кластеризация, как правило, осуществляется по наличию пиков, специфичных для устойчивых штаммов. Такие пики логично называть «пиками резистентности». Подобный подход ярко иллюстрируется на примере метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA). Было выявлено 6 специфических для MRSA пиков (m/z = 1729, 2288, 5514, 6004, 6576, 6885) [63]. Достоверность МС-идентификации MRSA подтверждается молекулярно-генетическими методами: только 10 % штаммов (7 из 76), негативных по mecA (генетический маркер метициллин-резистентных стафилококков), были масс-спектрометрически идентифицированы как MRSA [62]. Такая же технология апробировалась и на модели различных по чувствительности к ванкомицину штаммов энтерококков. Были найдены пики, специфичные для ванкомицин-резистентного Enterococcus faecium (m/z = 2211, 4717, 5094, 5945, 8327) [64]. Результаты подтвердились секвенированием: у всех штаммов, идентифицированных при помощи МС в качестве резистентных, выявлялся генетический маркер устойчивости к гликопептидам vanB. Более сложный вариант технологии МС-обнаружения
стрептомицин-резистентных штаммов N. gonorrhoeae был предложен S. Nabu и соавт. [65]. На основе данных двухмерного электрофореза и MALDI-TOF MS они разработали ре-ференсную карту протеома гонококка, обнаружив 8 белков, которые по-разному экспрессировались у чувствительных и устойчивых штаммов.
Пики резистентности — не единственный вариант маркеров спектров устойчивых микроорганизмов. В результате действия повреждающих факторов в бактериальной клетке быстро меняется метаболизм, что проявляется в виде так называемого стресс-ответа [66]. Стресс-ответ, индуцированный антибиотиками, запускает перестройку многих важнейших структур микробной клетки, начиная от ферментов репарации ДНК и заканчивая поверхностными белками [67—70]. Доказано, что стресс-ответ на антибиотики может быть по-разному реализован у чувствительных и резистентных бактерий [71]. Естественно, что и белковый профиль в таких случаях меняется по-разному. Это положение является теоретической базой для разработки методов определения микробной резистентности при помощи МС-изучения стресс-ответа. Практической реализацией МС-оценки индуцированного антибиотиками стресс-ответа является технология MBT ASTRA, разрабатываемая компанией Bruker. Она предполагает оценку чувствительности к антибиотикам с помощью количественного мониторинга роста клетки в присутствии/ отсутствие антибиотика. Уже после первого часа инкубации при помощи MALDI-TOF MS выявляются статистически значимые различия между масс-спектрами клебсиелл (K. pneumoniae и K. oxytoca), растущими в средах с меропенемом и без антибиотика [72]. Важно, что большинство из исследованных штаммов проявляли дозозависимимые изменения масс-спектров при использовании различных концентраций меропенема. Это дает надежду на разработку количественных критериев оценки резистентности при помощи МС.
Переходя ко второму подходу МС-исследования резистентности микробов, следует вспомнить о ее механизмах. Классическими считаются 5 путей происхождения резистентности: нарушение проницаемости внешних структур микробной клетки, активное выведение антибиотика из микробной клетки (эффлюкс), модификация мишени, инактивация антибиотика, формирование метаболического «шунта» [73]. МС позволяет осуществить прямую детекцию компонентов микроорганизмов, ответственных за потерю чувствительности к антибиотикам. Иными словами, МС-технологию предполагается использовать в протеомном варианте, нацеленном на идентификацию конкретных протеинов. Многочисленные примеры подтверждают возможность такого подхода.
Показано, что с помощью сочетания двухмерного электрофореза и MALDI-TOF MS возможен анализ структур, отвечающих за транспорт антибиотика через клеточные мембраны грамотрицательных бактерий, таких как пори-ны и эффлюксные системы [74]. При помощи двухмерного электрофореза и MALDI-TOF/TOF MS были определены эф-флюксные белки E. coli (штамм K-12), отвечающие за резистентность к тетрациклину и ампициллину [75]. На основе электрофореза в полиакриламидном геле и MALDI-TOF MS экстрактов наружной мембраны удалось идентифицировать эффлюксную систему AcrAB-TolC у K. pneumoniae [76]. Позднее для этого микроорганизма были определены пики, являющиеся индикаторами ОтрК36-порина, отвечающего за проникновение в бактериальную клетку карбапенемов. В этом случае маркером резистентности служит отсутствие или изменение в масс-спектре пика данного белка, так как устойчивость приобретается благодаря модификации структуры порина [77].
Один из механизмов резистентности к препаратам, дей-
microbiology
ствующим на синтез белка (например, к аминогликозидам), заключается в модификации субъединиц рибосом через метилирование рибосомальной РНК (рРНК). Принципиальная возможность обнаружения феномена метилирования при помощи МС была показана в работе S. Douthwaite и соавт. [78]. Весьма трудоемкая методика включала несколько этапов. Во-первых, из биомассы тестируемого штамма получали экстракт, содержащий материальную основу модификации мишени, — метилтрансферазу, ферментирующую процесс метилирования рРНК. Параллельно на искусственной матрице ДНК синтезировали транскрипты РНК, репрезентирующие участки рРНК, в которых обычно происходит метилирование. На втором этапе инкубировали экстракт с метилтрансферазой и полученные транскрипты РНК для метилирования последних. Затем обработанную метилтранс-феразой РНК ферментировали РНКазами, полученные оли-гонуклеотиды очищали и получали их масс-спектрограммы методом MALDI-TOF MS с применением матрицы на основе 3-гидроксипиколиновой кислоты. Присутствие модификаций подтверждали по появлению характерных пиков, соответствующих наличию метилированных нуклеотидов в стандартных для возникновения резистентности позициях. Например, типовой мишенью для Erm-метилтрансфераз являются нуклеотиды, расположенные в позициях 2056—2063 рРНК. Метилирование этого участка дает в масс-спектре оли-гонуклеотидов диагностический пик с m/z = 2689, который в итоге может послужить критерием наличия резистентности к эритромицину через модификацию мишени. Безусловно, сложность и дороговизна описанной методики не позволяют использовать ее для решения задач рутинной микробиологической практики. Предложенный способ доказывает лишь принципиальную возможность МС-выявления модификации мишени и имеет потенциал для методического упрощения.
У штаммов, устойчивых к действию полимиксинов, включая колистин, происходит специфическая модификация главной мишени этого класса антибиотиков — липополиса-харида (ЛПС) наружной мембраны [79]. Поэтому выявление модифицированного ЛПС является индикатором резистентности к полимиксинам. M. Pelletier и соавт. [10] разработали и подробно описали методологию поиска модификаций в структурах ЛПС. Для масс-спектрометрического исследования из тестируемых бактерий (A. baumannii) был изолирован важный компонент ЛПС — липид А. Его очищали, заключали в нархарман-матрицу и анализировали при помощи MALDI-TOF MS. У липида А, экстрагированного из резистентных к колистину штаммов, были выявлены специфические изменения масс-спектра (появление пика с m/z = 2194), свидетельствующие о модификациях фосфоэтаноламина и галактозамина. Модификации были подтверждены и более детально охарактеризованы при помощи других вариантов МС.
Механизм ферментативной инактивации b-лактамных антибиотиков оценивается по феномену их энзиматиче-ского гидролиза в присутствии бактерий, продуцирующих b-лактамазы: в масс-спектре появляются пики продуктов деградации препарата, а пики нативного антибиотика исчезают. Метод зарекомендовал себя как достоверный и чувствительный: в большинстве исследований было показано совпадение между результатами МС-анализа и данными, полученными молекулярно-генетическими (секвенирование) и фенотипическими методами [80—82]. Использование такого подхода возможно при работе непосредственно с биологическим образцом. Например, после детекции микроорганизма в пробе крови и примитивной пробоподготовки, включающей добавление антибиотика, проводится МС-регистрация препарата или продуктов его гидролиза [83, 84]. Внедрение в практическую микробиологию метода МС-оценки фермент-
микробиология
зависимой деструкции антибиотиков реализовано фирмой Bruker, которая выпустила на рынок модуль определения b-лактамазной активности MBT STAR-BL. Главное достоинство модуля — наличие программного пакета MBT Compass STAR-BL module, позволяющего автоматически проанализировать полученные масс-спектры и сделать вывод о лакта-мазной активности изучаемого возбудителя.
МС-технологии оценки резистентности бактерий к антибиотикам высоко результативны, но имеют существенные недостатки. Об одном — методической сложности, делающей невозможными воспроизведение некоторых способов в рядовых лабораториях, — упоминалось ранее. Второй и главный недостаток связан с отсутствием стандартизованных критериев оценки резистентности, аналогичных брэкпойнтам Европейского комитета по тестированию чувствительности к антибиотикам EUCAST и Института клинических и лабораторных стандартов США (CLSI).
Заключение. Анализ научной информации о применении МС в медицинской микробиологии позволяет сделать несколько важных выводов. Бурное развитие МС-технологий и внедрение их в микробиологию повлекло за собой революционные изменения в микробиологической диагностике, которые кардинально меняют принципы медицинской микробиологии. Внедрение МС носит глобальный характер — только в Европе в микробиологической диагностике специализированно работают более тысячи MALDI-TOF-MS систем. Основным достижением МС-технологий является быстрая и надежная идентификация большинства актуальных для медицины видов, которая производится не только из чистых культур, но и из мономикробного биологического материала. Перспективы МС связаны с разработкой и внедрением в практику методов внутривидового определения клинически/эпидемиологически значимых штаммов и оценки их свойств, включая вирулентность и резистентность. Главные проблемы микробиологической МС связаны с трудностями идентификации микроорганизмов в смешанных культурах (включая биологический материал) и с отсутствием стандартных критериев МС-оценки резистентности микробов. Быстрый прогресс в развитии прикладных МС-технологий дает надежду на то, что указанные проблемы будут решены в течение ближайших лет.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (соглашение № 14.607.21.0064, уникальный идентификатор прикладных научных исследований RFMEFI60714X0064).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 4—10, 12, 14—20, 23—27, 29—33, 35—52, 54—72, 74—84 см. REFERENCES)
1. Данные с сайта Европейского Центра по Профилактике и Контролю Заболеваний. Available at: http://ecdc.europa.eu. (дата обращения: Сентябрь 2015 г.)
2. Баранов А.А., Маянский А.Н., Чеботарь И.В., Маянский Н.А. Новая эпоха в медицинской микробиологии. Вестник РАН. 2015; 85 (1): 1008—16.
3. Данные с сайта Научно-производственной фирмы «Литех». Available at: http://www.biotyper.ru/maldi-bactoscreen.htm. (дата обращения: Сентябрь 2015 г.)
11. Маянский Н.А., Калакуцкая А.Н., Мотузова О.В., Ломинадзе Г.Г., Крыжановская О.А., Катосова Л.К. MALDI-TOF масс-спектрометрия в рутинной работе микробиологической лаборатории. Вопросы диагностики в педиатрии. 2011; 3 (5): 20—5. 13. Афанасьев М.В., Миронова Л.В., Балахонов С.В. MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ для идентификации возбудителей чумы, холеры и туляремии. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015; 33 (2): 3—8. 21. Чеботарь И.В., Пономаренко О.А., Лазарева А.В., Карасева О.В., Горелик А.Л., Бочарова Ю.А. и др. Использование MALDI-TOF-
технологии для идентификации возбудителей септических состояний в педиатрической практике. Современные технологии в медицине. 2015; 7 (2): 68—74.
22. Крыжановская О.А., Лазарева А.В., Пономаренко О.А., Катосова Л.К., Тепаев Р.Ф., Карасева О.В. и др. Масс-спектрометрическая идентификация возбудителей инфекций кровотока: опыт в педиатрической практике. Российский педиатрический журнал. 2014; 17 (5): 4—9.
28. Маянский А.Н. Патогенетическая микробиология. Нижний Новгород: НГМА; 2006.
34. Ильина Е.Н. Прямое МАЛДИ масс-спектрометрическое профилирование бактериальных белков для индикации и характеристики патогенов. Acta Nature. 2009; (1): 115—20.
53. Чеботарь И.В., Гурьев Е.Л. Лабораторная диагностика клинически значимых биопленочных процессов. Вопросы диагностики в педиатрии. 2012; (4): 15—20.
73. Страчунский Л.С., Белоусов Ю.Б., Козлов С.Н. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. Смоленск: НИИАХ СГМА; 2002.
Поступила 10.12.15
REFERENCES
1. European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). Available at: http://ecdc.europa.eu (accessed September 2015). (in Russian)
2. Baranov A.A., Mayanskiy A.N., Chebotar' I.V., Mayanskiy N.A. A new epoch in medical microbiology. Vestnik RAN. 2015; 85 (1): 1008—16. (in Russian)
3. Lytech Company. Available at: http://www.biotyper.ru/maldi-bactoscreen.htm (accessed September 2015). (in Russian)
4. Su W., Gao X., Jiang L., Qin J. Microfluidic platform towards point-of-care diagnostics in infectious diseases. J. Chromatogr. A. 2015; 1377: 13—26.
5. Onnerfjord P., Ekstrom S., Bergquist J., Nilsson J., Laurell T., Marko-Varga G. Homogeneous sample preparation for automated high throughput analysis with matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1999; 13 (5): 315—22.
6. Carda-Broch S., Berthod A., Armstrong D.W. Ionic matrices for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight detection of DNA oligomers. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003; 17 (6): 553—60.
7. Gyemant G., Toth A., Bajza I., Kandra L., Liptak A. Identification and structural analysis of synthetic oligosaccharides of Shigella sonnei using MALDI-TOF MS. Carbohydr. Res. 2001; 334 (4): 315—22.
8. Paauw A., Trip H., Niemcewicz M., Sellek R., Heng J.M., Mars-Groenendijk R.H. et al. OmpU as a biomarker for rapid discrimination between toxigenic and epidemic Vibrio cholerae O1/O139 and non-epidemic Vibrio cholerae in a modified MALDI-TOF MS assay. BMC Microbiol. 2014; 14: 158.
9. Toh-Boyo G.M., Wulff S.S., Basile F. Comparison of sample preparation methods and evaluation of intra-and intersample reproducibility in bacteria MALDI-MS profiling. Anal. Chem. 2012; 84 (22): 9971—80.
10. Pelletier M.R., Casella L.G., Jones J.W., Adams M.D., Zurawski D.V., Hazlett K.R. et al. Unique structural modifications are present in the lipopolysaccharide from colistin-resistant strains of Acinetobacter baumannii. Antimicrob. Agents Chemother. 2013; 57 (10): 4831— 40.
11. Mayanskiy N.A., Kalakutskaya A.N., Motuzova O.V., Lominadze G.G., Kryzhanovskaya O.A., Katosova L.K. MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory everyday work. Voprosy diagnostiki vpediatrii. 2011; 3 (5): 20—5. (in Russian)
12. Patel R. MALDI-TOF MS for the diagnosis of infectious diseases. Clin. Chem. 2015; 61 (1): 100—11.
13. Afanas'ev M.V., Mironova L.V., Balakhonov S.V. MALDI-TOF mass spectrometry for identification of the causative agent of plague, cholera and tularemia. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2015; 33 (2): 3—8. (in Russian)
14. Majchrzykiewicz-Koehorst J.A., Heikens E., Trip H., Hulst A.G., de Jong A.L., Viveen M.C. et al. Rapid and generic identification of influenza A and other respiratory viruses with mass spectrometry. J. Virol. Methods. 2015; 213: 75—83.
15. Chen J.H., Ho P.L., Kwan G.S., She K.K., Siu G.K., Cheng V.C. et al. Direct bacterial identification in positive blood cultures by use of two commercial matrix-assisted laser desorption ionization—time of flight mass spectrometry systems. J. Clin. Microbiol. 2013; 51 (6): 1733—9.
16. Ferreira L., Sánchez-Juanes F., González-Avila M., Cembrero-Fuciños D., Herrero-Hernández A., González-Buitrago J.M. et al. Direct identification of urinary tract pathogens from urine samples by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2010; 48 (6): 2110—5.
17. Sánchez-Juanes F., Siller Ruiz M., Moreno Obregón F., Criado González M., Hernández Egido S., de Frutos Serna M. et al. Pretreatment of urine samples with SDS improves direct identification of urinary tract pathogens with matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2014; 52 (1): 335—8.
18. Demarco M.L., Burnham C.A. Diafiltration MALDI-TOF mass spectrometry method for culture-independent detection and identification of pathogens directly from urine specimens. Am. J. Clin. Pathol. 2014; 141 (2): 204—12.
19. Segawa S., Sawai S., Murata S., Nishimura M., Beppu M., Sogawa K. et al. Direct application of MALDI-TOF mass spectrometry to cerebrospinal fluid for rapid pathogen identification in a patient with bacterial meningitis. Clin. Chim. Acta. 2014; 435: 59—61.
20. Nyvang Hartmeyer G., Kvistholm Jensen A., Böcher S., Damkjaer Bartels M., Pedersen M., Engell Clausen M. et al. Mass spectrometry: pneumococcal meningitis verified and Brucella species identified in less than half an hour. Scand. J. Infect. Dis. 2010; 42 (9): 716—8.
21. Chebotar' I.V., Ponomarenko O.A., Lazareva A.V., Karaseva O.V., Gorelik A.L., Bocharova Yu.A. et al. MALDI-TOF technique availability for identification of septic agents in pediatric practice. Sovremennye tekhnologii v meditsine. 2015; 7 (2): 68—74. (in Russian)
22. Kryzhanovskaya O.A., Lazareva A.V., Ponomarenko O.A., Katosova L.K., Tepaev R.F., Karaseva O.V. et al. Mass spectrometric identification of causative pathogens of bloodstream infections: experience in pediatric practice. Rossiyskiy pediatricheskiy zhurnal. 2014; 17 (5): 4—9. (in Russian)
23. Kok J., Thomas L.C., Olma T., Chen S.C., Iredell J.R. Identification of bacteria in blood culture broths using matrix-assisted laser desorption-ionization Sepsityper™ and time of flight mass spectrometry. PLoS One. 2011; 6 (8): e23285.
24. Wang X.H., Zhang G., Fan Y.Y., Yang X., Sui W.J., Lu X.X. Direct identification of bacteria causing urinary tract infections by combining matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry with UF-1000i urine flow cytometry. J. Microbiol. Methods. 2013; 92 (3): 231—5.
25. Hsueh P.R., Lee T.F., Du S.H., Teng S.H., Liao C.H., Sheng W.H. et al. Bruker biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for identification of Nocardia, Rhodococcus, Kocuria, Gordonia, Tsukamurella, and Listeria species. J. Clin. Microbiol. 2014; 52 (7): 2371—9.
26. Lau A.F., Drake S.K., Calhoun L.B., Henderson C.M., Zelazny A.M. Development of a clinically comprehensive database and a simple procedure for identification of molds from solid media by matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2013; 51 (3): 828—34.
27. Hettick J.M., Green B.J., Buskirk A.D., Kashon M.L., Slaven J.E., Janotka E. et al. Discrimination of Penicillium isolates by matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry fingerprinting. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008; 22 (16): 2555—60.
28. Mayanskiy A.N. Pathogenic Microbiology [Patogeneticheskaya mikrobiologiya]. Nizhniy Novgorod: NGMA; 2006. (in Russian)
29. Werno A.M., Christner M., Anderson T.P., Murdoch D.R. Differentiation of Streptococcus pneumoniae from Nonpneumococcal Streptococci of the Streptococcus mitis group by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization—Time of Flight Mass Spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2012; 50 (9): 2863—7.
30. Dubois D., Segonds C., Prere M.F., Marty N., Oswald E. Identification of clinical Streptococcus pneumoniae isolates among other alpha and nonhemolytic streptococci by use of the vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J. Clin. Microbiol. 2013; 51 (6): 1861—7.
31. Zhou C., Tao L., Hu B., Ma J., Ye X., Huang S. et al. Matrix-assisted
microbiology
laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for the identification of beta-hemolytic streptococci. J. Thorac. Dis. 2015; 7 (4): 591—5.
32. Ikryannikova L.N., Filimonova A.V., Malakhova M.V., Savinova T., Filimonova O., Ilina E.N. et al. Discrimination between Streptococcus pneumoniae and Streptococcus mitis based on sorting of their MALDI mass spectra. Clin. Microbiol. Infect. 2013; 19 (11): 1066—71.
33. Khot P.D., Fisher M.A. Novel approach for differentiating Shigella species and Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2013; 51 (11): 3711—6.
34. Il'ina E.N. Direct MALDI mass spectrometry profiling of bacterial proteins for the display and characteristics of the pathogens. Acta Nature. 2009; (1): 115—20. (in Russian)
35. Dallagassa C.B., Huergo L.F., Stets M.I., Pedrosa F.O., Souza E.M., Cruz L.M. et al. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry analysis of Escherichia coli categories. Genet. Mol. Res. 2014; 13 (1): 716—22.
36. Fujinami Y., Kikkawa H.S., Kurosaki Y., Sakurada K., Yoshino M., Yasuda J. Rapid discrimination of Legionella by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Microbiol. Res. 2011; 166 (2): 77—86.
37. Mencacci A., Monari C., Leli C., Merlini L., De Carolis E., Vella A. et al. Typing of nosocomial outbreaks of Acinetobacter baumannii by use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2013; 51 (2): 603—6.
38. Sauget M., Nicolas-Chanoine M.H., Cabrolier N., Bertrand X., Hocquet D. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry assigns Escherichia coli to the phylogroups A, B1, B2 and D. Int. J. Med. Microbiol. 2014; 304 (8): 977—83.
39. Clark C.G., Kruczkiewicz P., Guan C., McCorrister S.J., Chong P., Wylie J. et al. Evaluation of MALDI-TOF mass spectroscopy methods for determination of Escherichia coli pathotypes. J. Microbiol. Methods. 2013; 94 (3): 180—91.
40. Fagerquist C.K., Garbus B.R., Miller W.G., Williams K.E., Yee E., Bates A.H. et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157: H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight— time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Anal. Chem. 2010; 82 (7): 2717—25.
41. Reil M., Erhard M., Kuijper E.J., Kist M., Zaiss H., Witte W. et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2011; 30 (11): 1431—6.
42. Lartigue M.F., Kostrzewa M., Salloum M., Haguenoer E., Hery-Arnaud G., Domelier A.S. et al. Rapid detection of «highly virulent» Group B Streptococcus ST-17 and emerging ST-1 clones by MALDI-TOF mass spectrometry. J. Microbiol. Methods. 2011; 86 (2): 262—5.
43. Dunne E.M., Ong E.K., Moser R.J., Siba P.M., Phuanukoonnon S., Greenhill A.R. et al. Multilocus sequence typing of Streptococcus pneumoniae by use of mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2011; 49 (11): 3756—60.
44. Williamson Y.M., Moura H., Woolfitt A.R., Pirkle J.L., Barr J.R., Carvalho G. et al. Differentiation of Streptococcus pneumoniae conjunctivitis outbreak isolates by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74 (19): 5891—7.
45. Xiao D., You Y., Bi Z., Wang H., Zhang Y., Hu B. et al. MALDI-TOF mass spectrometry-based identification of group A Streptococcus isolated from areas of the 2011 scarlet fever outbreak in china. Infect. Genet. Evol. 2013; 14: 320—6.
46. Wang D., Baudys J., Krilich J., Smith T.J., Barr J.R., Kalb S.R. A two-stage multiplex method for quantitative analysis of botulinum neurotoxins type A, B, E, and F by MALDI-TOF mass spectrometry. Anal. Chem. 2014; 86 (21): 10847—54.
47. Valour F., Rasigade J.P., Trouillet-Assant S., Gagnaire J., Bouaziz A., Karsenty J. et al. Delta-toxin production deficiency in Staphylococcus aureus: a diagnostic marker of bone and joint infection chronicity linked with osteoblast invasion and biofilm formation. Clin. Microbiol. Infect. 2015; 21 (6): 568.e1—568.e11.
48. Bechlars S., Wüstenhagen D.A., Drägert K., Dieckmann R., Strauch E., Kubick S. Cell-free synthesis of functional thermostable direct hemolysins of Vibrio parahaemolyticus. Toxicon. 2013; 76: 132—42.
микробиология
49. Scott N.E., Marzook N.B., Deutscher A., Falconer L., Crossett В., Djordjevic S.P. et al. Mass spectrometric characterization of the Campylobacter ejuni adherence factor CadF reveals post-translational processing that removes immunogenicity while retaining fibronectin binding. Proteomics. 2010; 10 (2): 277—88.
50. Moura H., Woolfitt A.R., Carvalho M.G., Pavlopoulos A., Teixeira L.M., Satten G.A. et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for differentiation of invasive and noninvasive Streptococcus pyogenes isolates. FEMSImmunol. Med. Microbiol. 2008; 53 (3): 333—42.
51. Mansson V., Resman F., Kostrzewa M., Nilson В., Riesbeck K. Identification of Haemophilus influenzae Type b Isolates by Use of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2015; 53 (7): 2215—24.
52. Kuhns M., Zautner A.E., Rabsch W., Zimmermann O., Weig M., Bader O. et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 2012; 7 (6): e40004.
53. Chebotar' I.V., Gur'ev E.L. Laboratory diagnostics of clinically significant microbial biofilms. Voprosy diagnostiki v pediatrii. 2012; (4): 15—20. (in Russian)
54. Allegrucci M., Hu F.Z., Shen K., Hayes J., Ehrlich G.D., Post J.C. et al. Phenotypic characterization of Streptococcus pneumoniae biofilm development. J. Bacteriol. 2006; 188 (7): 2325—35.
55. Shin J.H., Lee H.W., Kim S.M., Kim J. Proteomic analysis of Acine-tobacter baumannii in biofilm and planktonic growth mode. J. Microbiol. 2009; 47 (6): 728—35.
56. Park A.J., Murphy K., Krieger J.R., Brewer D., Taylor P., Habash M. et al. A temporal examination of the planktonic and biofilm proteome of whole cell Pseudomonas aeruginosa PAO1 using quantitative mass spectrometry.Mol. Cell. Proteomics. 2014; 13 (4): 1095—105.
57. Thomas D.P., Bachmann S.P., Lopez-Ribot J.L. Proteomics for the analysis of the Candida albicans biofilm lifestyle. Proteomics. 2006; 6 (21): 5795—804.
58. Giaouris E., Samoilis G., Chorianopoulos N., Ercolini D., Nychas G.J. Differential protein expression patterns between planktonic and biofilm cells of Salmonella enterica serovar Enteritidis PT4 on stainless steel surface. Int. J. Food Microbiol. 2013; 162 (1): 105—13.
59. Sparbier K., Lange C., Jung J., Wieser A., Schubert S., Kostrzewa M. MALDI Biotyper-based rapid resistance detection by stable-isotope labeling. J. Clin. Microbiol. 2013; 51 (11): 3741—8.
60. Jung J.S., Eberl T., Sparbier K., Lange C., Kostrzewa M., Schubert S. et al. Rapid detection of antibiotic resistance based on mass spectrometry and stable isotopes. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2014; 33 (6): 949—55.
61. Edwards-Jones V., Claydon M.A., Evason D.J., Walker J., Fox A.J., Gordon D.B. Rapid discrimination between methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus by intact cell mass spec-trometry. J. Med. Microbiol. 2000; 49 (3): 295—300.
62. Du Z., Yang R., Guo Z., Song Y., Wang J. Identification of Staphy-lococcus aureus and determination of its methicillin resistance by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 2002; 74 (21): 5487—91.
63. Madhava Charyulu E., Gnanamani A., Mandal A.B. Identification and Discrimination of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus Strains Isolated from Burn Wound Sites Using PCR and Authentication with MALDI-TOF—MS. Indian J. Microbiol. 2012; 52 (3): 337—45.
64. Griffin P.M., Price G.R., Schooneveldt J.M., Schlebusch S., Tilse M.H., Urbanski T. et al. Use of matrix-assisted laser desorption ion-ization-time of flight mass spectrometry to identify vancomycin-re-sistant enterococci and investigate the epidemiology of an outbreak. J. Clin. Microbiol. 2012; 50 (9): 2918—31.
65. Nabu S., Lawung R., Isarankura-Na-Ayudhya P., Isarankura-Na-Ayudhya C., Roytrakul S., Prachayasittikul V. Reference map and comparative proteomic analysis of Neisseria gonorrhoeae displaying high resistance against spectinomycin. J. Med. Microbiol. 2014; 63 (3): 371—85.
66. Marles-Wright J., Lewis R.J. Stress responses of bacteria. Curr. Opin. Struct. Biol. 2007; 17 (6): 755—60.
67. Yun S.H., Choi C.W., Park S.H., Lee J.C., Leem S.H., Choi J.S. et al. Proteomic analysis of outer membrane proteins from Acinetobacter
baumannii DU202 in tetracycline stress condition. J. Microbiol. 2008; 46 (6): 720—7.
68. Chong P.M., Lynch T., McCorrister S., Kibsey P., Miller M., Gravel D., Westmacott G.R., Mulvey M.R. Proteomic analysis of a NAP1 Clostridium difficile clinical isolate resistant to metronidazole. PLoS One. 2014; 9 (1): e8262.
69. Lin X., Kang L., Li H., Peng X. Fluctuation of multiple metabolic pathways is required for Escherichia coli in response to chlortetracy-cline stress. Mol. Biosyst. 2014; 10 (4): 901—8.
70. Olekhnovich I.N., Vitko S., Valliere M., Hoffman P.S. Response to Metr onidazole and oxidative stress is mediated through homeostatic regulator HsrA (HP1043) in Helicobacter pylori. J. Bacteriol. 2014; 196 (4): 729—39.
71. Poole K. Stress responses as determinants of antimicrobial resistance in Gram-negative bacteria. Trends Microbiol. 2012; 20 (5): 227—34.
72. Lange C., Schubert S., Jung J., Kostrzewa M., Sparbier K. Quantitative matrix-assisted laser desorption ionization—time of flight mass spectrometry for rapid resistance detection. J. Clin. Microbiol. 2014; 52 (12): 4155—62.
73. Strachunskiy L.S., Belousov Yu.B., Kozlov S.N. The Practical Guide on Antiinfection Chemotherapy [Prakticheskoe rukovodstvo po antiinfektsionnoy khimioterapii]. Smolensk: NIIAKh SGMA; 2002. (in Russian)
74. Imperi F., Ciccosanti F., Perdomo A.B., Tiburzi F., Mancone C., Alonzi T. et al. Analysis of the periplasmic proteome of Pseudomonas aeruginosa, a metabolically versatile opportunistic pathogen. Proteomics. 2009; 9 (7): 1901—15.
75. Xu C., Lin X., Ren H., Zhang Y., Wang S., Peng X. Analysis of outer membrane proteome of Escherichia coli related to resistance to am-picillin and tetracycline. Proteomics. 2006; 6 (2): 462—73.
76. G^bner S., Linke D., Schbtz W., Fladerer C., Madlung J., Autenri-eth I.B. et al. Emergence of carbapenem-non-susceptible extended-spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae isolates at the university hospital of Tbbingen, Germany. J. Med. Microbiol. 2009; 58 (Pt. 7): 912—22.
77. Cai J.C., Hu Y.Y., Zhang R., Zhou H.W., Chen G.X. Detection of OmpK36 porin loss in Klebsiella spp. by matrix-assisted laser desorption ionization—time of flight mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2012; 50 (6): 2179—82.
78. Douthwaite S., Jensen R.L., Kirpekar F. The activity of rRNA resistance methyltransferases assessed by MALDI Mass Spectrometry. In: W. Scott Champney, ed. New Antibiotic Targets. Totowa, New Jersey: Humana Press; 2008.
79. Lim L.M., Ly N., Anderson D., Yang J.C., Macander L., Jarkows-ki A. et al. Resurgence of colistin: a review of resistance, toxicity, pharmacodynamics, and dosing. Pharmacotherapy. 2010; 30 (12): 1279—91.
80. Sparbier K., Schubert S., Weller U., Boogen C., Kostrzewa M. Matrixassisted laser desorption ionization—time of flight mass spectrom-etry-based functional assay for rapid detection of resistance against ß-Lactam antibiotics. J. Clin. Microbiol. 2012; 50 (3): 927—37.
81. Kempf M., Bakour S., Flaudrops C., Berrazeg M., Brunel J.M., Drissi M. et al. Rapid detection of carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. PLoS One. 2012; 7 (2): e31676.
82. Álvarez-Buylla A., Picazo J.J., Culebras E. Optimized method for Acinetobacter species carbapenemase detection and identification by matrix-assisted laser desorption ionization—time of flight mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 2013; 51 (5): 1589—92.
83. Jung J.S., Popp C., Sparbier K., Lange C., Kostrzewa M., Schubert S. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for rapid detection of ß-lactam resistance in Enterobacteriaceae derived from blood cultures. J. Clin. Microbiol. 2014; 52 (3): 924—30.
84. Oviano M., Fernández B., Fernández A., Barba M.J., Mouriño C., Bou G. Rapid detection of enterobacteriaceae producing extended spectrum beta-lactamases directly from positive blood cultures by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spec-trometry. Clin. Microbiol. Infect. 2014; 20 (11): 1146—57.
