CC BY
38
Возможности молекулярно-генетического анализа для доклинической диагностики заболеваний коленного сустава
Костюк С.А.1, Бенько А.Н.1, Герасименко М.А.1, Кезля О.П.1, Езерский К.Ф.2, Полуян О.С.1
1Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск 2432-й ордена Красной Звезды главный военный клинический медицинский центр Вооруженных Сил Республики Беларусь, Минск
Kostiuk S.A.1, Benko A.N.1, Gerasimenko M.A.1, Kezlia O.P.1, Ezerski K.F 2, Poluyan O.S.1
Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk 2The Main Military Clinical Medical Center of the Armed Forces of the Republic of Belarus N432, Minsk
Possibilities of the molecular-genetic analysis for knee joint diseases preclinical diagnosis
Резюме. Ревматические заболевания представляют собой разнородную группу заболеваний, при которых поражается опорно-двигательная система. Как правило, причина этих расстройств неизвестна и их патогенез малопонятен, что заключает в себе ряд диагностических сложностей для современной медицины. На ранних стадиях обычно отсутствуют патогномоничные признаки, такие как различные клинические особенности, специфические морфологические изменения или типичные серологические маркёры. Ранняя диагностика необходима во избежание деструктивных процессов, которые могут привести к значительному ухудшению качества жизни и ранней инвалидизации. В связи с данными ограничениями высоки ожидания в отношении генных исследований молекулярных маркёров и профиля экспрессии генов для первоначального диагноза.
Ключевые слова: заболевания коленного суставов, генетические маркёры, доклиническая диагностика.
Медицинские новости. — 2016. — №3. — С. 29—33. Summary. Rheumatic diseases represent diverse group of diseases with the musculoskeletal system defeat. As a rule, the reason of these frustration is unknown and their pathogenesis is obscure that shows the number of diagnostic difficulties for modem medicine. At early stages usually there are no patognomonic signs, such as various clinical features, specific morphological changes or typical serologic markers. Early diagnostics is necessary in order to avoid destructive processes which can lead to considerable deterioration of life and early invalidization. Due to these restrictions there exist high expectations concerning gene researches of molecular markers and the genes expression profile for the initial diagnosis. Keywords: knee joints diseases, genetic markers, preclinical diagnostics. Meditsinskie novosti. - 2016. - N3. - P. 29-33.
Остеоартрит (ОА) - частое и все еще неизлечимое заболевание,которое приводит сначала к частичной, а затем полной потере функции сустава, резко снижает качество жизни пациентов. При этом происходит нарушение биомеханики соседних суставов, конечности в целом, позвоночника и контрлатеральной конечности. До 37% пациентов старше 60 лет страдают этим недугом [6]. В ближайшем будущем прогнозируется увеличение количества пациентов с ОА [18]. Данное заболевание (группа заболеваний) относится к категории мультифакториальных - в его этиологии имеют место как генетические, так и приобретенные факторы [8]. В последние десятилетия отмечается заметный рост количества дегенеративно-воспалительных заболеваний суставов не всегда понятной этиологии у молодых активных пациентов. Биология остеоар-трита обширна - заболевание не ограничивается поражением только одной ткани, а развивается в результате комплексного взаимодействия общих и локальных факторов, постепенного вовлечения новых тканей, из чего и складывается сложная патогенетическая картина. Диагностика
ранних стадий ОА часто вызывает трудности - рентгенологические признаки отсутствуют, симптоматика выражена неярко. Артрозо-артрит, разрушение хряща, деформации, глубокие патологические изменения кости являются конечной стадией патологического процесса.
Алгоритм обследования пациента с ОА включает подробный сбор анамнеза с уточнением возможной причины заболе-
вания и его динамики, тщательного клинического исследования не только пораженного, но и смежных (голеностопного и тазобедренного)суставов, позвоночника. Рентгенологическое исследование проводится в следующих проекциях: передне-задняя, боковая, вырезка надколенника, по Rosenberg (45 градусов сгибания). По показаниям выполняется МРТ и РКТ.
Диагноз, как правило, устанавливается уже в запущенных случаях, и все усилия
современной медицины направлены на лечение этих необратимых изменений, то есть конечного патогенетического звена. К этому времени возможность для выполнения органосохранных рекон-структивых вмешательств уже упущена. Однако на современном этапе развития диагностических технологий распознавать заболевание и проводить этиопатогене-тически направленное лечение можно и
нужно на стадии молекулярно-генетиче-ских изменений, когда есть надежда на стабилизацию, а возможно, и обратное течение процесса.
На поиск этиологических факторов и патогенетических механизмов Оа тратятся огромные средства. Ведущие мировые исследователи в основном сосредоточились на выделении и изучении динамики биомаркёров - адипокинов и т.д. Однако полученные результаты лишь частично
На современном этапе развития диагностических технологий распознавать заболевание и проводить этиопатогенетически направленное лечение можно и нужно на стадии молекулярно-генетических изменений, когда есть надежда на стабилизацию, а возможно, и обратное течение процесса
оправдали большие надежды и ожидания. Доказано, что выделение и динамика биомаркёров имеют сравнительно небольшую ценность и могут использоваться лишь для мониторинга активности процесса и эффективности лечения, не раскрывая при этом этиопатогенетической причины заболевания [13].
Для молодых активных пациентов с артралгией важно поддержание в дальнейшем уровня физической активности, прогнозирование. В ряде случаев выполнение диагностической артроскопии не приводит к каким-либо существенным находкам, а углубленное исследование не выявляет наличие грубых нарушений биомеханики сустава. Перед исследователями часто возникают непростые задачи. Например, ожирение и избыточный вес являются общепринятыми факторами риска ОА вследствие дегенерации хряща из-за избыточной аксиальной нагрузки. Однако ряд исследований доказывает наличие у пациентов с повышенным индексом массы тела и ожирением дегенеративно-дистрофических изменений не только в суставах, на которые приходится избыточная нагрузка в связи с большой массой тела, но и в ненагружаемых (аксиально) суставах -межфаланговых, локтевых и т.д. [20].
В таком случае глубже понять механизм развития артрозо-артрита и определить его этиологию позволяют мо-лекулярно-биологическое исследования. Новые технологии постоянно внедряются в медицину, и в хирургию в частности. Современные высокотехнологичные методы в хирургии, адаптированные для помощи конкретному пациенту, требуют наличия полной и достоверной информации о характере патологии у данного пациента, что предполагает также знание особенностей генетического статуса. Установление необходимости хирургического вмешательства, определение тактики ведения операции, контроль эффективности хирургического вмешательства, исследование биопсийного материала сегодня предполагают дополнительное использование молекулярно-генетических тестов.
Многие заболевания или осложнения заболеваний, требующие хирургической коррекции, являются мультифактори-альными, включая генетический фактор. Этиопатогенетическую основу мульти-факториальных заболеваний составляют функционально ослабленные варианты определенных генов (генов «предрасположенности»), повреждающий эффект которых реализуется на фоне неблагоприятного воздействия внешней среды. Генетический механизм возникновения
мультифакториальных заболеваний наиболее сложный, так как в основе его лежат различные комбинации аллельных вариантов многих генов, получившие название «генных сетей» [3, 9, 10, 15].
Разработка на этой основе комплекса досимптоматического генетического тестирования для пациента - важная задача
современной медицины. Исследование роли генетических факторов при таких заболеваниях входит в число наиболее перспективных направлений современной генетики и приоритетных областей здравоохранения.
В связи со значительной распространенностью заболеваний с генетической предрасположенностью очевидна необходимость совершенствования методов их ранней диагностики для своевременного назначения адекватного хирургического или терапевтического лечения и осуществления проспективного медико-генетического консультирования семей.
Задачи генетического контроля:
1. Диагностика генетически детерминированной патологии как изолированной, так и входящей в состав синдромов.
2. Определение тактики адекватного комплексного этиопатогенетического консервативного или хирургического лечения, его этапности, формулировка прогноза, выбор метода реабилитации и последующей активности больного.
3. Определение генетического прогноза, выявление членов семьи с доклинической стадией заболевания.
4. Ведение регистра семей и пациентов с наследственной патологией, их динамическое наблюдение.
5. Разработка научно-практических программ, информационного обеспечения, рекомендаций по ранней диагностике и профилактике (в том числе пренаталь-ной), патогенетически ориентированной терапии и адекватной хирургической тактики лечения наследственной патологии.
6. Совершенствование имеющихся и разработка новых эффективных методов оперативного и консервативного лечения.
Все большей реальностью становится индивидуализация хирургического вмешательства.
Успешная диагностика и лечение доклинических форм поражений коленного сустава становятся возможными
благодаря трем основным факторам: 1) появление новых диагностических возможностей (цифровая рентгенография, радиоизотопное исследование, компьютерная томография, магниторезонансная томография); 2) обоснование, с точки зрения доказательной медицины, эффективности скрининговых программ для раз-
личных по этиологии поражений коленного сустава; 3) разработка эндоскопической и малоинвазивной хирургии коленного сустава, доказавшей высокую свою эффективность в долгосрочной перспективе при своевременном использовании органосохраняющих и малоинвазивных методик. Дополнили данные разработки и молекулярно-генетические технологии [4, 7, 19].
Хирургическая патология. В последние десятилетия термином «хирургическая патология» (англ. surgical pathology) в большинстве стран обозначают раздел патологической анатомии (патологии), посвященный морфологическому исследованию органов и тканей, прижизненно полученных у пациентов с диагностической и/или лечебной целью. При этом термин «хирургическая» не ограничивает ее рамки исследованием только объектов, поступивших из собственно хирургических отделений. Хирургическая патология имеет дело со всем тканевым материалом, направленным врачами любой специальности: гинекологами, урологами, отоларингологами, дерматологами и т.д.
Практически все современные методы лабораторной диагностики применяются в хирургической патологии. Революционным событием в хирургической патологии стала возможность использовать в диагностике методы молекулярной патологии, позволяющей идентифицировать на клеточном и тканевом уровнях приобретенные мутации и соответствующие им изменения генетически детерминированных продуктов. Высочайшая чувствительность молекулярно-биологических технологий позволяет распознавать отпечатки уникальных молекулярных повреждений. Это дает возможность максимально точной и ранней диагностики, выявления и верификации отдельных пораженных клеток; оценка молекулярных прогностических факторов может играть важнейшую роль в клиническом прогнозировании у конкрет-
Революционным событием в хирургической патологии стала возможность использовать в диагностике методы молекулярной патологии, позволяющей идентифицировать на клеточном и тканевом уровнях приобретенные мутации и соответствующие им изменения генетически детерминированных продуктов
ного пациента и назначении адекватной индивидуальной терапии.
Метод ДНК-гибридизации приобрел для хирургической патологии особое значение с появлением методик, позволяющих выполнять гибридизацию in situ. Она обеспечивает детекцию определенных последовательностей ДНК и РНК в гистологических срезах, цитологических препаратах, в культуре ткани и дает возможность судить о результатах реакции в конкретной клетке. В тесной связи с этим находится развитие интерфазной цитогенетики, позволяющей анализировать хромосомы в покоящихся (неделящихся) клетках.
Другим подходом к решению этой проблемы стали чиповые технологии (microarray), в которых пробы с денатурированными ДНК и РНК наносят на твердые носители с закрепленными олигонуклео-тидами. После гибридизации с заданными последовательностями нуклеиновых кислот пробы меняют свои оптические свойства в четко определенных местах их расположения на чипе, что позволяет одномоментно анализировать многочисленные гены. Однако необходимость гомогенизации ткани существенно ограничивает информативность этих методов из-за невозможности сопоставить результаты реакции с конкретными клетками. Выходом из этой ситуации стала разработка лазерной микродиссекции, при которой из препарата вырезают микроскопические участки ткани, группы клеток и даже отдельные клетки. Эти микрообразцы можно подвергать полимеразной цепной реакции (и другим молекулярным методикам) с последующей более достоверной структурной экстраполяцией ее результатов. Наиболее близким для патологоанатомов может стать метод тканевых чипов (tissuemicroarray), который позволяет анализировать множественные микрообразцы ткани, полученные даже из архивного материала. Образцы распола-
гаются на специальной подложке, и морфологические проявления сопоставляются с экспрессией молекулярных маркёров [1, 12, 16].
Результаты высокотехнологичных методик, в первую очередь молекулярно-биоло-гических, дополняют рутинное патогистоло-гическое заключение новой уникальной информацией, а в ряде случаев позволяют решить диагностические и прогностические вопросы, недоступные традиционным морфологическим методам [1, 2].
1. Использование микроанализа на доклиническом этапе диагностики поражений коленного сустава - анализ генной экспрессии с использованием микроанализа
В ядре практически всех клеток в организме содержится полный набор хромосом, которые содержат десятки тысяч генов, ДНК генетического кода. Тем не менее в каждом типе клеток только часть этих генов экспрессируется, то есть используется для синтеза белка. Определенный набор белков, производимых в каждой клетке, придает ей уникальные свойства.
Термин «экспрессия гена» происходит от латинского слова expression - выражение. Экспрессия генов - это процесс, посредством которого информация, содержащаяся в генах в виде ДНК, используется для синтеза мРНК (транскрипция), которая транспортируется в цитоплазму и используется в качестве временной матрицы для синтеза белков (трансляция), именно они будут определять функциональную активность клетки.
Изучение уровня и типов мРНК клетки предоставляет непрямую информацию о белках, которые экспрессируются в клетке. Качественный и количественный
состав мРНК клеток меняется в зависимости от внешних и внутренних стимулов, выступая как показатель адаптации клетки к изменению внутренних ее параметров и действию внешних раздражителей. Поддержание адекватного уровня генной
экспрессии - важный фактор клеточного гомеостаза. Изменение экспрессии тех или иных генов сопровождает ряд заболеваний, в том числе хирургических.
В середине 1990-х появились технологии микроанализа, которые позволили одновременно исследовать множество мРНК быстро и эффективно. Ученые получили возможность исследовать экспрессию генов как при физиологических процессах (развитие ткани, ее функционирование), так и при патологии.
Микроанализ основан на способности данной мРНК связываться (гибридизиро-ваться) с определенной матрицей ДНК по принципу комплементарности (рисунок). Пробы фиксированы на матрице, меченые образцы гибридизируются с пробами (полностью комплементарные последовательности связываются прочно, при отсутствии нуклеотидного соответствия связь непрочная).
В микроанализе тысячи ДНК последовательностей иммобилизированы на маленьких неподвижных носителях, которые размещены на слайдах, нитроцеллюлоз-ных мембранах. ДНК последовательности = олигонуклеотиды (одноцепочечные) длиной 5-50 нуклеотидов, но могут быть и больше.
Хотя при патологическом процессе большее количество генов меняет свой количественный состав, в некоторых случаях ученые могут использовать технологию микроанализа для детекции малых мутаций или полиморфизмов в последовательности гена. В данном случае иммобилизированные на чипе ДНК могут отличаться только одним или несколькими специфичными нуклеотидами, исследуемая проба - геномная ДНК индивида. Данные чипы используются для анализа одно-нуклеотидных полиморфизмов (SNPs), малых вариаций в последовательности генов, которые встречаются в человеческой популяции. Этот тип микроанализа особенно полезен при диагностике заболеваний (или предрасположенности к
заболеваниям), ассоциированных с определенным профилем SNP [7, 10].
2. Исследование изменений в уровне экспрессируемых мРНК
Микроанализ полезен для быстрого изучения множества генов. Микрочипы
Экспрессия генов - это процесс, посредством которого информация, содержащаяся в генах в виде ДНК, используется для синтеза мРНК (транскрипция), которая транспортируется в цитоплазму и используется в качестве временной матрицы для синтеза белков (трансляция), именно они будут определять функциональную активность клетки
позволяют оценивать экспрессию мРНК для тысяч генов одновременно, быстро идентифицировать большие или малые мутации на большом протяжении генома. Микроанализ особенно ценен для определения генов-кандидатов, молекулярные события в которых могут быть ассоциированы с развитием заболевания.
Например, микрочиповое сравнение здоровой (контрольной) ткани индивида и пораженной ткани того же индивида (например, биопсийный или интраопераци-онный материал) предоставляет значимую информацию об изменениях, которые имеют место в данном конкретном случае заболевания, относительно количества экспрессируемой мРНК, наличия делеций, умножения копий гена. Данная информация значима в определении тактики терапии и прогнозировании течения заболевания. Микроанализ был использован для сравнения одной популяции с другой с целью определения профиля SNPs, который определяет вероятность развития того или иного заболевания, что позволило разработать методы профилактики и программы мониторирования частоты заболеваемости [19].
Анализ предоставляет информацию о типах и количествах экспрессируемых мРНК в образце. В данном типе микроанализа иммобилизованные ДНК представляют собой олигонуклеотиды, образцы для гибридизации получают из мРНК, экстрагируемой из клеток и тканей. Образцы мРНК подвергаются обратной транскрипции для получения кДНк, которая затем метится радиоактивной или флюоресцентной меткой. Если образцы получены из здоровых и пораженных тканей пациента, то после гибридизации, детекции сигнала и его анализа микроанализ может выявить специфический набор генов, дифференциально экспрессируемых в двух тканях. Данная информация может помочь в определении тактики лечения пациента, использоваться для разработки новых средств терапии.
3. Использование микроанализа для изучения изменения количества генетического материала
Сравнительный геномный гибридиза-ционный (СГГ) микроанализ используется для изучения обширных геномных приобретений или потерь, а также изменений количества копий определенного гена, вовлеченного в патологический процесс. В СГГ-микрочипе каждый участок иммобилизованной ДНК характеризуется определенной хромосомной локализацией, тестируемые образцы представляют собой обширные фрагменты геномной
ДНК. Например, сравнение может быть проведено между меченой геномной ДНК, выделенной из нормальной ткани, и ДНК, выделенной из пораженной ткани. СГГ-микроанализ способен выявить данные регионы потери или приобретения ДНК информации и, таким образом, определить специфические гены, копийность которых увеличена или снижена при заболевании [2, 12].
4. Геномный анализ
Ученые, изучающие геном, стремятся связать каждое изменение в генотипе с фенотипом. Многие геном-ассоцииро-ванные исследования показывают, что только скромная доля наследственного
риска распространенных заболеваний объясняется известными генетическими вариациями. В связи с этим возникает вопрос: «Существуют ли редкие варианты генотипа, присущие конкретным индивидам, которые могут являться дополнительной причиной того или иного состояния?»
Разработка новых HTS-технологий позволила начать изучение данного вопроса посредством возможности секвенировать целый геном или его части, чтобы идентифицировать генетические варианты, которые могут привести к болезни. Полученные данные анализируются с использованием методов биоинформатики с целью выявить специфичные для данного заболевания генетические изменения, для интеграции информации о последовательности гена, в целом данных об изменениях в геноме, наличии уже исследованных генов, ассоциированных с патогенезом данного патологического процесса.
HTS-технология использовалась и для детекции вариативной копийности генов у индивидов, а также анализа наличия гибридных генов (gene-fusion events), присутствие которых может объяснить особенности индивидуальной чувствительности к развитию заболевания. Данная информация может использоваться с целью скрининга лиц, обладающих повышенным риском развития того или иного состояния [12, 17].
5. Анализ транскриптома
HTS-технология позволила изучать РНК-транскрипты, полученные с хро-мосомальной ДНК, методами, которые были недоступны при использовании традиционного метода секвенирования
или микроанализа. Например, с использованием HTS возможно получить не только информацию о качестве и количестве экс-прессируемой РНК всех известных генов (как в микроанализе), но и о неизвестных РНК-транскриптах. Так, HTS может идентифицировать РНК-транскрипты гибридных генов, феномен РНК-редактирования и новые классы некодирующих рНк, а также неизвестные или менее распространенные сплайсинговые варианты и сплайсинговые регионы.
Комбинирование HTS с ядерным тестом (nuclear run-on assay) позволило ученым мониторировать уровни транскрипции, оценивать наличие антисмысловой
транскрипции, дивергентной транскрипции и транскрипции, распространяющейся за пределы пре-мессенджер РНК сайта расщепления. Как продолжение данной методологии ученые могут также монито-рировать уровень мРНК-деградации, что не только обогащает наши знания о биологических процессах, но также помогает дифференцировать норму от патологии. Например, метод позволяет идентифицировать неизвестное событие гибридов генов, некодирующие РНК, сплайсинговые варианты РНК или РНК-редактирование, что может быть ответственно за развитие заболевания [19].
6. Интерактомный анализ
Для понимания того, как то или иное событие отражается на фенотипе, необходимо изучение функциональных и физических взаимодействий хромосомных генов, а также их продуктов (РНК и протеины). Исследование данных взаимодействий значимо для дальнейшего понимания природы заболевания.
Иммунопреципитация хроматина с последующим секвенированием (СМР-Seq) - наиболее популярная комбинация методов для идентификации транскрипционных факторов или транскрипционных комплексов, связывающихся с хромосомами. Например, так как сайты, связывающие РНК-полимеразу II ^АроШ), определяют активную транскрипцию, тест ChIP-SeqRNApoШ использовался для изучения таких вопросов, как старт транскрипции, транскрипционные сайты в норме, превалирование аберрантных или альтернативных стартовых сайтов транскрипции. Комбинаторный анализ
Микрочипы позволяют оценивать экспрессию мРНК для тысяч генов одновременно, быстро идентифицировать большие или малые мутации на большом протяжении генома. Микроанализ особенно ценен для определения генов-кандидатов, молекулярные события в которых могут быть ассоциированы с развитием заболевания
результатов тестов ChIP-Seq позволяет понять сложную структуру хромосомной организации и как она регулируется множеством клеточных факторов. Например, Barski и соавт. использовали ChIP-Seq анализ для создания геномных карт высокого разрешения, в которых были отражены места расположения гистонов, РНК полимеразы II и CCCTC-связывающего фактора (CTCF), что отражает сложность организации генома и процесса транскрипции. Подобным образом ChlP-Seq анализ рецептора эстрогенов a (ER-a является ключевым компонентом эстроген регулируемой транскрипции) и РНК по-лимеразы II не только позволил выявить сайты связывания ER-a на человеческих хромосомах, но также продемонстрировал сложность транскрипционного ответа данных генов на действие эстрадиола и/ или его антагонистов. Взаимодействие РНК с РНК-связывающими протеинами (RBP) или с микро-РНК-содержащим РНК-индуцируемым комплексом гашения (microRNA-containing RNA-Induced Silencing Complex (RISC)) определяет судьбу транскрипции, индуцируя пре-мРНК-сплайсинг, и мРНК-стабильность, локализацию и трансляцию. Некоторые из этих взаимодействий связаны с ключевыми клеточными функциями, такими как регуляция и конъюгация хромосом в мейозе и канцерогенез.
Заключение.
В настоящее время наблюдается бурное развитие молекулярно-генетических технологий, многие из них используются с целью совершенствования диагностики на доклиническом этапе поражений в органах. Данные технологии позволяют точно составить молекулярный образ конкретного пациента и применить индивидуальный подход к терапии [2, 5, 11, 14].
Анализ литературных данных (пока единичных) и проведенные нами пилотные клинические исследования позволяют с большой надеждой обратиться к раз-
работке системы молекулярно-генети-ческой диагностики патологии суставов. Внедрение этой методики позволит расширить наши представления об этиологии и патогенезе артрозо-артрита, проводить раннюю доклиническую диагностику, сделает возможной индивидуализацию лечения пациентов с патологией суставов.
Молекулярная патология открыла новую страницу в истории хирургической патологии и заняла большое место в комплексе современных морфологических методов исследования. Однако, анализируя данные молекулярных методов, следует всегда помнить мысль И.В. Давыдовского (1969), высказанную почти полвека назад и развитую позднее Д.С. Саркисовым (1987), о том, что «болезнь, как комплекс клинико-анатомиче-ских проявлений, является результирующей действия этиологического фактора и сложного комплекса ответных реакций индивидуума, в том числе - компенсаторно-приспособительных процессов». Поэтому результаты любого нового высокотехнологичного метода исследования должны оцениваться только с учетом индивидуальных особенностей пациента, а молекулярная диагностика должна обеспечить связь клинических и фундаментальных дисциплин.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Самойлов, М.В. Хирургическая патология: история и новые технологии / М.В.Самойлов, О.Д.Мишнев, Н.Г.Гончаров // Лечеб. дело. - 2010. -№2. - С.89-95.
2. A cancer detection platform which measures telom-erase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter / TXu [et al.] // Cancer Res. - 2010. -Vol.70. - P.6420-6426.
3. Anderson, W.FHuman gene therapy / W.FAnderson // Science. - 1992. - Vol.256. - P.808-813.
4. Circulating tumor cells in breast cancer: correlation to bone marrow micrometastases, heterogeneous response to systemic therapy and low proliferative activity / V.Muller [et al.] // Clin. Cancer. Res. - 2005. -Vol.11. - P.3678-3685.
5. Detection of micrometastasis by cytokeratin 20 RT-PCR is limited due to stable background transcription in granulocytes / RJung [et al.] // Br. J. Cancer. - 1999. -Vol.81. - P.870-873.
6. Dillon, C.F Prevalence of knee osteoarthritis in the United States: arthritis data from the Third National Health and Nutrition Examination Survey 1991-94 / C.FDillon, E.K.Rasch, Q.Gu, R.Hirsch //. J. Rheumatol. -2006. - Vol.33. - P.2271-2279. [PMID: 17013996].
7. DNA microarray technology: the anticipated impact on the study of human disease / J.Khan [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - Vol.1423. - P.17-28.
8. Felson, DT. An update on the pathogenesis and epidemiology of osteoarthritis / DTFelson // Radiol. Clin. North Am. - 2004. - Vol.42. - P.1-9.
9. Gagandeep, S.P. Gene Therapy in Surgical Oncology / S.P.Gagandeep, GJ.Poston, A.R.Kinsella // Ann. Surg. Oncol. - 1995. - Vol.2, N2. - P.179-188.
10. Mulligan, R.C. The basic science of gene therapy / R.C.Mulligan // Science. - 1993. - Vol.260. - P.926-931.
11. Nolan, TQuantification of mRNA using real-time RT-PCR / TNolan, R.E.Hands, S.A.Bustin // Nat. Protoc. -2006. - Vol.1. - P.1559-1582.
12. Personalized copy number and segmental duplication maps using next-generation sequencing / C.Alkan [et al.] // Nat. Genet. - 2009. - Vol.41. -P.1061-1067.
13. Poonpet, T. Adipokines: Biomarkers for osteoarthritis? / TPoonpet, S.Honsawek // World J. Orthop. - 2014. - Vol.18, N5(3). - P.319-327.
14. Predictive and prognostic value of peripheral blood cytokeratin-19 mRNA-positive cells detected by realtime polymerase chain reaction in node-negative breast cancer patients / N.Xenidis [et al.] // J. Clin. Oncol. -2006. - Vol.24. - P.3756-3762.
15. Roeme, K. Concepts and strategies for human gene therapy / K.Roemer, TFriedmann // Eur. J. Biochem. -1992. - Vol.208. - P.211-225.
16. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. 9th ed. / Ed. by J.Rosai. - St.Jouis: Mosby, 2004.
17. Rosenberg, S.A Gene therapy for cancer / S.A.Rosenberg // JAMA. - 1992. - Vol.268. - P.2416-2419.
18. Salihu, H.M. Obesity: What is an elderly population growing into? / H.M.Salihu, S.M.Bonnema, A.P.Alio // Maturitas. - 2009. -Vol.63. - P.7-12.
19. Transcriptome sequencing to detect gene fusions in cancer / C.A. Maher [et al.] // Nature. - 2009. -Vol.458. - P.97-101.
20. Yusuf, E. Association between weight or body mass index and hand osteoarthritis: a systematic review / EYusuf, R.G.Nelissen, A.Ioan-Facsinay, V.Stojanovic-Susulic et al. // Ann. Rheum. Dis. - 2010. - Vol.69. -P.761-765.
Поступила 23.12.2015 г.
№ Международные Обзоры:
клиническая практика и здоровье
МЕЖДУНАРОДНЫЙ МУЛЬТИМЕДИЙНЫЙ ЭЛЕКТРОННЫЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
Ресурсы сайта www.medпоvosti.by
www, obzory.mednovosti.by
Электронный журнал предназначен для врачей и руководителей здравоохранения; просматривается в режиме листания страниц; позволяет публиковать полноцветные статьи со звуковым сопровождением (музыка, вступительное слово автора, руководителя центра), с иллюстрациями, с эффектом слайд-шоу, видеороликами, анимацией. Подписка бесплатная на сайте www.mednovosti.by. ,, „ _ „„ „,_ т .„._, „
н ' Минск, пл. Свободы, 23-35. Тел.+375 (017) 327-07-54
