CC BY
8Возможности использования иммобилизированных наносистем в ревматологии
Зборовский А. Б., Гонтарь И. П., Александров А. В., Алехина И. Ю., Трофименко А. С.
Иммобилизированные магнитоуправляемые антигенные наносистемы (АНС), синтезируемые по оригинальной технологии, позволяют усовершенствовать методы иммунодиагностики различных ревматических заболеваний и разрабатывать новые методы их лечения. Нами продемонстрирована высокая эффективность АНС при сорбции патогенных аутоантител к кардиолипину из цельной крови. Кроме того, показана возможность разрушения ДНК-содержащих циркулирующих иммунных комплексов при помощи АНС на основе дезоксирибонуклеазы I типа. Ключевые слова: нанотехнологии, иммуносорбция, ревматические заболевания.
Immobilized magnetic nanobeads: potential uses in rheumatology
Zborovskii A. B., Gontar'I. P., Alexandrov A. V., Alyokhina I. Yu., Trofimenko A. S.
Immobilized antigen-linked magnetic nanobeads (MNB), synthesized by a unique technique, make it possible to improve immunodiagnosis and elaborate novel techniques to treat various rheumatic diseases. We demonstrated high efficiency of MNB in immunosorption of pathogenic autoantibodies to cardiolipin isolated from whole blood specimens. Furthermore, it was shown that DNase I-linked magnetic nanobeads can destroy DNA-containing circulating immune complexes.
Key words: nanotechnologies, immunosorption, rheumatic diseases.
В настоящее время особое внимание уделяется перспективному развитию нанотехнологий, т. е. технологий направленного получения и использования веществ и материалов размером от нескольких десятков до сотен нанометров (1-100 нм) [4, 7].
Наномир человеческого организма, представленный множеством эндогенных нанообъектов (белки, нуклеиновые кислоты), включает в себя также активные центры, клеточные рецепторы, антигенные детерминанты, которые специфически взаимодействуют с субстратами, медиаторами иммунной системы, микробными токсинами и т. д. Эти объекты формируются химическими группами, имеющими длину связи от 0,12 до 0,17 нм, что способствует реализации их специфических биологических свойств.
Возможность интеграции эндогенных нанообъектов с целью эффективной детекции и возможного последующего удаления (экстракорпоральными методами) различных антигенов, аутоантител, токсинов, вирусов из биологических сред послужила отправной точкой наших исследований.
Ревматические заболевания часто являются хроническими недугами, для которых характерны большое разнообразие форм и вариабельность темпов прогрессирования, что делает необходимым изучение множества иммунологических показателей. Обнаружение в сыворотке крови различных аутоантител может имееть важное диагностическое значение: их уровень часто отражает активность патологического процесса и может влиять на прогноз заболевания.
В настоящее время для выявления аутоантител используют самые различные подходы, наиболее же широко применяются иммуноферментный (ИФА) и иммунофлюоресцентный (ИФЛ) методы анализа, позволяющие на современном уровне решать вопросы иммунодиагностики и дифференциальной диагностики аутоиммунных заболеваний.
Расширение номенклатуры тест-систем, выпускаемых для подобных исследований, сдерживается техническими сложностями, связанными с трудностями при осаждении отдельных антигенов (белковой, липидной, полисахаридной или нуклеиновой природы), и высокой стоимостью диагностических наборов.
С целью разработки и внедрения принципиально новых диагностических препаратов на основе интеграции антиген-
ных нанообъектов в НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН созданы и апробированы иммобилизированные магнитоуправляемые антигенные наносистемы (АНС). Они представляют собой полиакриламидные гранулы с включенным в их структуру антигеном и магнитным материалом.
Следует более детально остановиться на основных этапах создания АНС. Для осуществления намеченной цели нам понадобилось решить ряд вопросов, связанных с необходимостью увеличить сорбционную емкость диагностических препаратов и обеспечить сохранность антигенов в максимально нативном состоянии. Большое значение имели выбор типа носителя и возможность манипуляции препаратами в процессе проведения анализа.
Решение первого вопроса было осуществлено посредством использования иммобилизации антигенов. Иммобилизация осуществляется благодаря переводу в нерастворимую форму различных растворимых антигенов, ферментов, гормонов и других лигандов с помощью физико-химических методов с сохранением их биологических свойств. Она имеет неоспоримые преимущества, в число которых входят:
1) высокая устойчивость к физико-химическим и микробным воздействиям;
2)создание высокой концентрации лиганда в поверхностном реакционном слое;
3) увеличение чувствительности препарата;
4) возможность многократного использования (после предварительной десорбции);
5) использование фиксированных лигандов в различных методах иммунодиагностики.
Для получения стабильных иммобилизированных биопрепаратов многократного применения с заданными свойствами (формой, диаметром частиц, размером пор, плотностью) часто используется метод эмульсионной полимеризации, для которого характерен ряд принципиальных моментов:
• фиксируется большое количество лиганда;
• обеспечивается значительная механическая прочность;
• поры гранул не препятствуют взаимодействию лиганда и антилиганда;
• приготовление микрогранул проводится в широком диапазоне рН;
№ 3 — 2009 год
53
• уменьшается неспецифическая сорбция за счет носителя;
• имеется возможность регулирования количества включенного в гель лиганда;
• функционально активные группы ориентированы в поверхностном слое, что повышает чувствительность препарата;
• потери низкомолекулярного лиганда можно полностью исключить ковалентным связыванием внутри пространственной структуры геля.
Данный метод в основном отработан на ферментах и микробных антигенах. Он наиболее перспективен и требует дальнейшего совершенствования как метод получения новых диагностических и лечебных препаратов.
Разработанный нами унифицированный способ получения АНС посредством эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота позволил существенно увеличить сорбционную емкость, сохранить антигены в максимально нативном состоянии и открыл возможности контролируемого модифицирования биомолекул с прогрозируемыми свойствами. С помощью данного метода стало возможным придать нанообъектам (антигенам) принципиально новые качества и осуществить их интеграцию в полноценно функционирующие системы большего масштаба.
Вторым важным моментом при создании диагностических АНС был выбор носителя. Известно, что успехи использования иммобилизированных препаратов в медицине во многом определяются адекватностью метода иммобилизации и зависят от природы носителя. Для получения иммуносорбентов применяют большое число природных и синтетических полимеров, к которым предъявляются следующие требования:
• нерастворимость;
• высокая биологическая и химическая устойчивость, значительная механическая прочность;
• высокая гидрофильность;
• достаточная проницаемость для лиганда и антилиганда;
• форма, обеспечивающая быстрое протекание реакционного раствора через слой сорбента;
• способность легко активироваться для ковалентного связывания лиганда;
• высокая емкость при отсутствии неспецифической сорбции;
• инертность по отношению к очищаемому материалу.
Носитель, полностью удовлетворяющий названным требованиям, получить пока не удается. Каждый вид носителя имеет свои достоинства и недостатки. Наиболее часто в качестве носителя используют синтетический продукт полимеризации — полиакриламидные гели, обладающие особыми качествами:
1) химической стабильностью, инертностью, прозрачностью;
2) лабильностью структуры, позволяющей получать гели с желаемой величиной пор, отсутствием адсорбции, устойчивостью к изменениям рН и температуры и нерастворимостью в большинстве растворителей;
3) возможностью получения гелей с хорошей воспроизводимостью из аналитически чистых исходных веществ.
Интерес к гелям объясняется еще и тем, что многие ткани человека и животных имеют подобную природу и это значительно уменьшает аллергические явления при введении в ор-
ганизм различных препаратов животного происхождения, заключенных в гели.
При механическом включении лигандов в ячеистую структуру разных гелей величина их пор подбирается таким образом, чтобы молекулы лиганда прочно фиксировались в них, сохраняя специфические центры свободными для химических реакций. Так, например, иммобилизация кардиолипина в полиакриламидном геле приводит к тому, что заряженная часть липидной молекулы — антиген-связывающий центр — пространственно переориентируется в гидрофильную среду и становится доступной для взаимодействия с антиген-свя-зывающим центром Fab-фрагмента специфических иммуно -глобулинов.
Необходимо подчеркнуть, что в зависимости от химической природы антигенов, их растворимости, молекулярной массы возможен индивидуальный подбор метода иммобилизации, типа носителя или их сочетания. Подобрав оптимальные условия, можно создать иммуносорбенты, близкие к идеальным.
Таким образом, иммобилизация биологически активных веществ (антигенов), осуществляемая нами в поверхностном слое двойной полиакриламидной гранулы, дала возможность создать высокую концентрацию антигена именно в реакционно-активной зоне, что позволило повысить чувствительность методов иммуноанализа в несколько раз.
Особое внимание при производстве иммуносорбентов мы обратили на придание им магнитных свойств. Включение магнитного материала (природного магнетита, ферритов, мелких частиц железа, никеля, кобальта, окислов железа) внутри полиакриламидной гранулы позволяет манипулировать ими с помощью внешнего магнитного поля. Данное обстоятельство немаловажно при разработке и создании разнообразных технических устройств, позволяющих автоматизировать постановку иммунологических реакций, а также использовать магнитосорбенты в методах иммуносорбции в качестве лечебных препаратов. Подобные иммуносорбенты находят применение в бактериологии и других областях науки, но в клинике внутренних болезней, и в частности в ревматологии, они пока не имеют широкого распространения.
В итоге с использованием конденсационных методов нанотехнологий (при подходе «снизу вверх») нами были получены иммобилизированные АНС различной химической природы, представляющие собой двойные полиакриламидные гранулы правильной сферической формы со средним диаметром гранул 55 ± 6,2 мкм (при соотношении полимерного носителя и железа 2:1 в пересчете на сухую массу), имеющие длительный срок хранения (до двух лет). После регенерации они пригодны для повторного использования.
На основе магнитоуправляемых АНС были разработаны условия проведения количественных ИФЛ- и ИФА-методов определения различных антител, имеющих большое диагностическое значение. АНС были целенаправленно апробированы при выявлении специфических антител к нативной и денатурированной ДНК, кардиолипину, РНК, коллагену, эластину, ферментам антиоксидантной системы и пуринового метаболизма и другим антигенам у больных системной красной волчанкой (СКВ), системной склеродермией, ревматоидным артритом, остеоартрозом и другими ревматическими заболеваниями.
54
№ 3 — 2009 год
АНС могут использоваться и с лечебной целью. Известно, что терапевтическое воздействие осуществляется, как правило, по двум взаимодополняющим направлениям — введением в организм лекарственных препаратов и выведением из организма иммунных комплексов, антител, микроорганизмов, токсинов и т. д. Благодаря развитию эфферентных методов появились новые возможности приостановить патологический процесс и даже вызвать его обратное развитие. Это достигается путем пропускания крови или другой биологической жидкости через колонки со специальным веществом — гемосорбентом. Как показали наши модельные эксперименты, использование АНС в качестве иммуносорбента позволяет избежать большинства недостатков, присущих различным сорбентам, а именно увеличить эффективность сорбции в несколько раз по сравнению с аналогами, повысить специфичность процедуры, снизить ее травматичность в отношении форменных элементов крови.
Эффективность и безопасность использования АНС в качестве иммуносорбента были изучены нами in vitro. Образцы цельной гепаринизированной крови были получены у 30 больных с верифицированной СКВ (25 женщин и 5 мужчин, средний возраст 35,8 ± 14,1 года, средняя продолжительность заболевания 7,6 ± 6,3 года) с высоким исходным содержанием антител к кардиолипину (более 0,3 Ед/л). Верификация диагноза производилась с помощью критериев Американской коллегии ревматологии в редакции 1997 г. [6]. Образцы крови разделяли на две части, одну из которых перфузировали через АНС на основе иммобилизированного кардиолипина (Sigma, США), а другую — через контрольный сорбент, колонку с активированным углем марки ГСУ [1, 2]. В результате средняя концентрация антител к кардиолипину после перфузии через АНС была достоверно ниже, чем в контроле (рис. 1). Использование в качестве сорбента активированного угля марки ГСУ вызывало, в отличие от сорбентов на основе АНС, выраженное снижение содержания форменных элементов крови, изменение иммуноглобулинового состава и уменьшение концентрации общего белка (табл).
АНС также были использованы нами при усовершенствовании способа снижения уровня ДНК-содержащих иммунных комплексов (ДНК-ИК) в крови больных СКВ. Известен метод разрушения ДНК-ИК крови с помощью дезоксирибонуклеазы I типа (ДНКазы I), иммобилизированной на нейлоновых микрокапсулах диаметром около 1 мм, посредством акти-
перфузии через ГСУ
перфузии
АНС
Рис. 1. Эффективность сорбции антител к кардиолипину с использованием АНС и активированного угля марки ГСУ в условиях in vitro
вации глутаральдегидом [8]. Применение данного способа, в дальнейшем обозначаемого как прототип, для очистки крови от ДНK-ИK затрудняют существенные недостатки: во-первых, инактивация значительной доли иммобилизируемого фермента за счет вовлечения активного центра последнего в формирование ковалентных связей и, во-вторых, наличие небольшой сорбционной емкости. ^оме того, при перфузии крови через прототип наблюдается снижение содержания лейкоцитов.
Для синтеза АНС нами был использован хроматографически очищенный препарат бычьей панкреатической ДН^зы I («Sigma», США). ^нечная концентрация энзима в гранулах составляла 0,3 мг/мл, что соответствовало прототипу. Расчетная площадь поверхности гранулированных АНС, соответствующая объему 40 мл, составила: для прототипа — 11,4 см2, для АНС — 259,3 см2. В колонку объемом 40 мл (что соответствует прототипу) вносили АНС и перфузировали через нее со скоростью 10 мл/ч по 20 мл нативной гепaрини-зированной крови, полученной от 10 больных С^.
Таблица Воздействие сорбентов на лабораторные параметры крови (M ± m)
Параметр До сорбции После активированного угля марки ГСУ После иммуносорбции с АНС
Эритроциты (х 1012) 3,95 ± 0,19 3,1 ± 0,18* 3,8 ± 0,2
Лейкоциты (х 109) 7,60 ± 0,80 4,8 ± 0,36* 6,7 ± 0,7
Тромбоциты (х 109) 219 ± 22,6 151 ± 17,1* 240 ± 9,9
1д G (г/л) 16,7 ± 1,19 8,8 ± 1,2* 15,2 ± 0,1
1д М (г/л) 2,29 ± 0,54 0,9 ± 0,2* 1,26 ± 0,2
1д А (г/л) 3,52 ± 0,42 1,9 ± 0,2* 2,41 ± 0,3*
Общий белок (г/л) 63,1 ± 1,2 51,8 ± 0,9* 61,4 ± 1,1
Примечания.
1. ^ G, ^ M, ^ A — иммуноглобулины классов G, М и A соответственно.
2. Знаком (*) отмечены различия с исходными данными для р < 0,05.
SB
№ 3 — 2009 год
DtWLVhJDfpMj
Последние представляли собой часть вышеупомянутой группы, отличавшуюся повышенными значениями циркулирующих иммунных комплексов (ИК) — более 4 Ед. После перфузии АНС отмывали от несвязавшихся белков забуфе-ренным физиологическим раствором рН = 7,4 и проводили регенерацию 0,1 М глицин-НС1 буфером рН = 2,2 два раза по 10 мин. Содержание ИК в сыворотке крови определяли двукратно (исходно и после перфузии) методом преципитации в полиэтиленгликоле [5]. Эффективность снижения содержания ИК при помощи данных АНС оценивали, сравнивая полученные значения с концентрацией ИК в сыворотке крови 10 практически здоровых лиц без выполнения перфузии.
У здоровых лиц концентрация ИК была равной 1,6 ± 0,4 Ед. У больных СКВ этот показатель исходно составлял 7,1 ± 4,4 Ед; после перфузии через АНС было отмечено его снижение до 1,55 ± 1,2 Ед; р = 0,026. Концентрация ИК у здоровых лиц была достоверно меньше, чем их первоначальная концентрация при СКВ; статистически значимого различия между первым показателем и конечным содержанием ИК при СКВ, напротив, выявлено не было (рис. 2). При перфузии крови через АНС содержание эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов крови существенно не изменялось. Таким образом, нами было продемонстрировано снижение содержания ИК до уровня, близкого к нормальному, при перфузии крови через АНС. В соответствии с ранее опубликованными данными, использование прототипа позволяло уменьшить содержание ИК лишь на 60-65% от исходного уровня [6].
После первой регенерации АНС потеря удельной активности составила около 10%, при повторных регенерациях (в общей сложности 19 раз) существенных изменений удельной активности иммобилизированного фермента не происходило.
Следовательно, при использовании АНС на основе иммобилизированной ДНКазы I за счет применения полиакрил-
ч:
ш
х
а:
СС
а
I-
х
ф
X
о
*
исходно
после
перфузии
Рис. 2. Сравнительная эффективность сорбции ДНК-ИК с использованием АНС на основе ДНКазы I и прототипа в условиях in vitro
амидного носителя с магнитными свойствами достигается увеличение эффективности сорбции ДНК-ИК по сравнению с прототипом за счет более высокой удельной ферментативной активности и большей рабочей площади препарата. Кроме того, благодаря магнитоуправляемости упрощаются манипуляции с АНС, предотвращающие эффект слипания полиакриламидных гранул в сорбционной колонке. Указанные преимущества, наряду с новизной, позволили получить положительное решение Роспатента о выдаче патента на рассмотренную инновацию.
Особо следует отметить, что после несложной процедуры регенерации АНС могут быть повторно использованы как диагностические и лечебные препараты [3]. Это будет способствовать снижению себестоимости АНС и окажет несомненное позитивное влияние на их потребительские качества.
Заключение
Оригинальная технология, разработанная в ГУ НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН, позволила получать АНС, в которых антиген сконцентрирован преимущественно в поверхностном реакционно-активном слое полиакриламидной гранулы. Процесс получения магнитоуправляемых иммуносорбентов отличается быстротой, хорошей воспроизводимостью, возможностью полной автоматизации. Внутри каждой гранулы расположен магнитный материал, позволяющий манипулировать ими с помощью внешнего магнитного поля. Создание и внедрение в практику новых гемосорбентов на основе АНС, возможно, позволит иммуносорбции занять достойное место в патогенетической терапии целого ряда заболеваний, протекающих с аутоиммунным компонентом.
Литература
1. Гонтарь И. П., Зборовский А. Б., Левкин С. В. Способ получения иммобилизированного кардиолипинового антигена для определения специфических антител // Патент на изобретение № 1649807 (дейст. с 07.10.1993 г.).
2. Гонтарь И. П., Кочергин И. Ю., Зборовская И. А. Способ получения кардиолипинового иммуносорбента // Патент на изобретение № 2092189 (дейст. с 10.10.1997 г.).
3. Гонтарь И. П., Заводовский Б. В., Зборовский А. Б. и др. Способ проведения экстракорпоральной иммуносорбции // Патент на изобретение № 2098140 (дейст. с 10.12.1997г.).
4. Концепция развития Российской Федерации в области нанотехнологий на период до 2010 года. — М: 2007. — 28 с.
5. Лемперт Б. А. Параметры определения циркулирующих иммунных комплексов и специфичности ПЭГ-теста с использованием в качестве модели агрегированного IgG// Лаб. дело. — 1988. — № 1. — C. 28-29.
6. Hochberg M. C. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus // Arthritis Rheum., 1997; 40: 1725.
7. Jain K. K. Nanotechnology-based Drug Delivery for Cancer// Technology in Cancer Research and Treatment, 2005; 4 (4): 4407-4416.
8. Terman D. S., Tavel A., Tavel T. et al. Degradation of circulating DNA by extracorporeal circulation over nuclease immobilized on nylon microcapsules// J. Clin. Invest., 1976; 52 (5): 12011212. ■
ojp.fy
№ 3 — 2009 год
57
