CC BY
6Б01: 10.24412/с1-34446-2023-4-188-190
ВОЗМОЖНОСТИ ИМПЛАНТИРУЕМЫХ ОПТИЧЕСКИХ СЕНСОРОВ ДЛЯ МОНИТОРИНГА рН В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНАХ
ВОДНЫХ ЖИВОТНЫХ
А. Н. Гурков, Е. П. Щапова, Я. А. Ржечицкий, Е. В. Борвинская, А. А. Назарова, А. А. Дягилева, М. А. Тимофеев
НИИ биологии Иркутского государственного университета, г. Иркутск
Задачи экологического мониторинга водоёмов и экотоксикологического тестирования новых соединений и их смесей, синтезируемых и используемых в промышленных масштабах, требуют принципиального повышения производительности и автоматизации существующих процедур определения состояния различных животных. Это особенно актуально для сравнительно небольших животных, имеющих линейные размеры тела до нескольких сантиметров, благодаря чему их наиболее удобно использовать в качестве модельных видов в лабораторных экспериментах, но из-за чего крайне затруднён многократный отбор их внутренних сред для биохимических анализов.
Принципиальную альтернативу традиционным подходам в этой области могут предоставить различные имплантируемые сенсоры, которые позволили бы отслеживать ряд физиологических параметров напрямую из тканей животных в реальном времени. На практике подобные инструменты обеспечат возможность в динамике оценивать необходимые показатели у одной и той же особи небольшого размера, что на данный момент возможно лишь для отдельных физиологических параметров. Например, флуоресцентные индикаторные красители и разнообразные нано- и микроразмерные комплексы уже сейчас могут обеспечить возможность количественного определения таких критических низкомолекулярных веществ как многие ионы, отдельные метаболиты, а также некоторые гормоны и лекарственные препараты [3; 4; 6]. Большинство подобных чувствительных компонентов не требуют применения микроэлектронных устройств в непосредственной близости от них и используют свет в качестве носителя информации о целевом параметре. Расшифровка передаваемого ими сигнала относительно проста и требует лишь внешнего прибора для детекции света, исходящего из тканей организма.
Тем не менее, даже известные чувствительные компоненты требуют подбора материалов и параметров полимерных носителей для получения функциональных имплантируемых оптические сенсоров, а также разработки конкретных методик для их
Гурков А. Н. и др. Возможности имплантируемых оптических ...
внедрения и применения в тех или иных органах различных животных. В данном исследовании на примере pH-чувствительного индикаторного красителя SNARF-1 нами были отработаны методики подготовки и применения имплантируемых сенсоров в тканях ряда морфологически разнообразных видов гидробионтов. SNARF-1 в прото-нированном и депротонированном состояниях обладает разными спектрами флуоресценции, что позволяет количественно оценивать pH раствора через соотношение интенсивности свечения красителя на двух длинах волн, соответствующих этим спектрам. Во всех случаях SNARF-1 использовали в виде ковалентного конъюгата с декс-траном для прочного заякоревания флуорофора в том или ином полимерным носителе (D-3304, Thermo Fisher Scientific, США), а спектры его флуоресценции регистрировали с помощью высокочувствительного оптоволоконного спектрометра (QE Pro, OceanOptics, США), подключённого к различным оптическим установкам.
Для применения SNARF-1 в кровеносной системе рыб нами были использованы полупроницаемые полиэлектролитные микрокапсулы с полиэтиленгликолевым покрытием, замедляющим распознавание иммунными клетками. Данные микрокапсулы диаметром порядка нескольких микрон удалось вводить в кровоток небольших рыб (взрослых особей Danio rerio (F. Hamilton, 1822) и других) и визуализировать в жабрах под флуоресцентным микроскопом (Микмед-2, ЛОМО, Россия) после инъекции в почку. Перед измерениями рыб потребовалось анестезировать и удалить их жаберные крышки. Микросенсоры позволили измерять pH крови в течение нескольких часов [1].
В случае мышц небольших рыб для замедления распознавания иммунной системой микроинкапсулированный краситель был дополнительно внедрён в гидрогель подобранной вязкости (2,7%-ный полиакриламид). Данный носитель позволил вводить микросенсоры в плотные ткани рыб в асептических условиях с помощью простой инъекции, а pH межклеточной среды мышц удалось отслеживать в течение не менее чем двух дней [8].
В случае более крупных рыб покровы тела становятся менее проницаемы для света, что затрудняет эффективное применение оптических сенсоров в общем случае. Крайне удобным исключением оказался прозрачный жировой плавник лососёвых рыб. Микроинкапсулированный SNARF-1 в плотных гидрогелевых нитях удалось относительно легко внедрять в жировой плавник радужной форели и получать гораздо более интенсивной сигнал, чем после подкожой инъекции. Для быстрого снятия оптического сигнала с плавников этих высокоподвижных рыб был подготовлен компактный мобильный прибор с подключёнными по оптоволокну возбуждающим лазером (FC-556-120, CNI, Китай) и спектрометром. С помощью данной оптической установки измерения pH в жировом плавнике одних и тех же особей радужной форели удалось проводить в небольшом аквариуме без анестезии рыб в течение более чем недели [7].
Небольшие ракообразные (взрослые особи байкальских амфипод Eulimnogammarus verrucosus (Gerstfeldt, 1858) длиной около 3 см) могут быть легко и безопасно зафиксированы под объективом микроскопа без анестезии [2], однако они высокочувствительны к освещению для возбуждения флуоресценции. Для решения этой проблемы в состав сенсоров на основе гидрогелевого носителя помимо SNARF-1 потребовалось ввести апконверсионные частицы с возбуждением в инфракрасной области и зелёным свечением. Данные частицы оказались способны опосредованно возбуждать флуоресценцию SNARF-1, а модификация флуоресцентного микроскопа сделала возможной её регистрацию на фоне люминесценции частиц. Полученные комбинированные сенсоры позволили изучить изменения pH в мышцах одних и тех же особей холодолюбивого эндемичного вида E. verrucosus при смоделированном экологически релевантном повышении температуры [5].
Таким образом, хотя различные группы животных требуют учёта их анатомических и поведенческих особенностей, результаты, полученные на примере pH-сенсо-ров, демонстрируют применимость имплантируемых оптических сенсоров для проведения физиологических исследований на гидробионтах.
Исследование поддержано грантом РНФ № 20-64-47011.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers / E. Borvinskaya [et al.] // Biology Open. 2017. Vol. 6, N 5. P. 673-677.
2. Restraining small decapods and amphipods for in vivo laboratory studies / A. Gurkov [et al.] // Crus-taceana. 2018. Vol. 91, N 5. P. 517-525.
3. Implantable sensors based on gold nanoparticles for continuous long-term concentration monitoring in the body / K. Kaefer [et al.] // Nano Letters. 2021. Vol. 21, N 7. P. 3325-3330.
4. Implantable nanosensors for human steroid hormone sensing in vivo using a self-templating corona phase molecular recognition / M. A. Lee [et al.] // Advanced Healthcare Materials. 2020. Vol. 9, N 21. P. 2000429.
5. Turn a shrimp into a firefly: Monitoring tissue pH in small crustaceans using an injectable hydrogel sensor with infrared excitation and visible luminescence / A. Nazarova [et al.] // Photonics. 2023. Vol. 10, N 6. P. 697.
6. Recent developments in nanosensors for imaging applications in biological systems / G. Rong [et al.] // Annual Review of Analytical Chemistry. 2019. Vol. 12. P. 109-128.
7. Adipose fin as a natural "optical window" for implantation of fluorescent sensors into salmonid fish / Y. Rzhechitskiy [et al.] // Animals. 2022. Vol. 12, N 21. P. 3042.
8. Durability of implanted low-density polyacrylamide hydrogel used as a scaffold for microencapsulated molecular probes inside small fish / E. Shchapova [et al.] // Polymers. 2022. Vol. 14, N 19. P. 3956.
