CC BY
65
Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 12 No. 1 2016, pp. 52-59 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2015 by Gurkov, Belousova, Shchapova, Baduev, Vereshchagina and Timofeyev
ORIGINAL ARTICLE
Injections of Encapsulated pH Sensor SNARF-1 do not Induce Apparent Stress Reaction in Larvae of Endemic Baikal Caddisflies Baicalina thamastoides
A.N. Gurkov1*, I.A. Belousova1,2, E.P. Shchapova1, B.K. Baduev1,
K.P. Vereshchagina1, M.A. Timofeyev1
11nstitute of Biology at ISU, 664003, Irkutsk, Karl Marx str., 1, Russia
2 Institute of Systematics and Ecology of Animals, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 630091, Novosibirsk, Frunze str. 11, Russia
*E-Mail: [email protected]
Received November 27, 2015
In the present study possibility of stress reaction of larvae of caddisflies Baicalina thamastoides Martynov, 1914 to injection of encapsulated sensors has been assessed. Activities of superoxide dismutase, non-specific esterases and glutathione S-transferase, which play important roles in functioning of organism defense systems, were used as biomarkers. Enzyme activities were measured after injections of empty microcapsules and microcapsules with fluorescent pH sensor SNARF-1, as well as after inlections of physiological saline solution and solution of the fluorescent sensor. Obtained results argue for nontoxicity and no apparent stress reaction of antioxidant and detoxification systems of B. thamastoides larvae to both types of microcapsules.
Key words: antioxidant defense, Baikal, microcapsules, Trichoptera
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
53
Injections of Encapsulated pH Sensor SNARF-1...
Микрокапсулы являются не только климата и деятельность человека оказывают на
перспективным средством целевой доставки генно- неё существенное воздействие (Timoshkin et al.,
модифицирующих векторов и лекарственных 2015; Moore et al., 2009). Это обуславливает
средств в ткани живого организма, но и могут быть необходимость развития и улучшения
использованы как носители широкого круга существующих программ мониторинга экосистемы
молекулярных сенсоров, спектр или яркость Байкала. Особого внимания заслуживает
флуоресценции которых реагирует на такие бентосная зона озера, в которой сосредоточена
параметры как pH, ионный состав и т. д. (Johnson & основная часть эндемичного биоразнообразия
Spence, 2011). Микрокапсулы, наполненные Байкала (Timoshkin et al., 2015; Bajkalovedenie
флуоресцентными сенсорами и введённые в живой (Baicalogy), 2012). Одной из групп, формирующих
организм, являются перспективным инструментом значительную долю биомассы бентосной зоны
для прижизненной оценки стрессовых состояний Байкала, являются эндемичные ручейники
организма и могут найти широкое применение в (Trichoptera), обильно представленные в литорали
экологическом мониторинге водных экосистем личиночными стадиями. Личинки ручейников
(Sadovoy et a/., 2012). Однако, введение зачастую обладают сравнительно низкой
микрокапсул в организм для регистрации устойчивостью к стрессовым факторам среды и
физиологических параметров само по себе может поэтому могут использоваться в качестве
сопровождаться реакцией защитных систем высокочувствительных тест-объектов для
организма на введённые микрокапсулы, что может токсикометрической оценки и в экологическом
помешать адекватной оценке состояния организма мониторинге водоёмов (Hodkinson & Jackson,
с помощью микрокапсул. Это обуславливает 2005).
необходимость предварительной оценки В данной работе оценивали возможность
возможной стресс-реакции организмов на развития стресс-ответа организма личинки
инъекции микрокапсул, особенно у видов, ручейника при инъекции инкапсулированных
перспективных для использования в качестве тест- сенсоров. В качестве стресс-маркера были
объектов. использованы показатели активности трёх
Озеро Байкал — это крупнейший резервуар ферментов, играющих ключевую роль в
пресной воды на планете, а также наиболее функционировании защитных систем организма:
древняя и разнообразная из существующих супероксиддисмутазы (СОД), неспецифических
открытых пресноводных экосистем (Martens, 1997). эстераз (НЭ) и глутатион^-трансферазы (ГСТ).
Последние оценки состояния экосистемы озера СОД — это один из ключевых ферментов,
свидетельствуют о том, что глобальное изменение ответственных за утилизацию активных форм
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
Gurkov et al.
54
кислорода, чья продукция в митохондриях увеличивается при множестве нарушений в организме. ГСТ и НЭ являются одними из основных ферментов системы детоксикации ксенобиотиков.
Активность ферментов оценивали в ответ на инъекции пустых микрокапсул и микрокапсул, содержащих флуоресцентный pH-сенсор SNARF-1. Также проводили оценку в ответ на инъекции физиологического раствора и раствора флуоресцентного сенсора.
MATERIALS AND METHODS
Подготовка микрокапсул
Микрокапсулы подготавливали методом наслоения противоположно заряженных полимеров. Вначале получали пористые ядра карбоната кальция, смешивая 0,625 мкл 1М раствора Na2CO3 и 0,625 мкл 1М раствора CaCl2 с 2 мл раствора декстрана, меченого чувствительным к pH флуоресцентным красителем SNARF-1 (Invitrogen, D-3304), с концентрацией 2 мг/мл, при интенсивном перемешивании. Через 10 с перемешивания полученные ядра карбоната кальция три раза отмывали осаждением с помощью центрифугирования и разведением в деионизированной воде. Поры ядер, сформированных в растворе меченого SNARF-1 декстрана, содержали данный краситель. Затем на ядра последовательно наносили слои положительно заряженного полимера
полиаллиламин гидрохлорида (ПАГ; Aldrich, 2832315) и отрицательно заряженного полистиролсульфоната натрия (ПСН; Aldrich,
243051). Для этого ядра помещали в раствор соответствующего полимера с концентрацией 4 мг/мл (содержащий также 1М NaCl) на 5 мин при ультразвуковом воздействии для снижения агрегации ядер. Ядра трижды отмывали от раствора оставшегося полимера, после чего наслаивали второй полимер, а затем повторяли процедуру несколько раз. Для повышения биосовместимости покрывали полученные структуры дополнительным слоем гополимера полиФ-лизина и полиэтиленгликоля (ПЛЛ-ПЭГ; SuSoS, SZ34-67), экспонируя ядра в растворе данного полимера с концентрацией 2 мг/мл в течение двух часов. Наконец, ядра из карбоната кальция растворяли в 0,1М растворе ЭДТА c pH 7.0, после чего получали полые микрокапсулы с формулой стенки (ПАГ/ПСН)5-(ПЛЛ-ПЭГ), содержащие SNARF-1. Поскольку SNARF-1 ковалентно связан с декстраном, он не может покинуть полость микрокапсулы. Пустые капсулы получали аналогично, но без добавления меченого SNARF-1 декстрана при формировании ядер.
Измерение концентрации микрокапсул проводили в камере Горяева. Концентрации микрокапсул в растворах, использованных позже для инъекций, были доведены примерно до 6700 шт/мкл и 67000 шт/мкл для содержащих и не содержащих SNARF-1 микрокапсул
соответственно. Данные концентрации выбраны, поскольку микрокапсулы с декстраном, меченым SNARF-1, оказались примерно в 5 раз крупнее микрокапсул без него (в среднем 5 мкм и 1 мкм соответственно) из-за различий в размерах
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
55
Injections of Encapsulated pH Sensor SNARF-1...
кристаллизовавшихся ядер карбоната кальция. разделены на 5 групп: контрольная группа,
При выбранных концентрациях растворы оставленная в условиях акклимации, и 4
микрокапсул обладают близкими суммарными экспериментальные тест-группы. В жировые тела
площадями поверхности микрокапсул. ручейников тест-групп делали инъекции,
Отлов ручейников и проведение сопровождавшиеся последующим
экспериментов экспонированием животного под объективом
В качестве объекта данного исследования были флуоресцентного микроскопа Микмед-2 (ЛОМО) с
выбраны личинки массового эндемичного вида зелёным освещением в течение около 30 с. Данное
ручейников Baicalina thamastoides Martynov, 1914, экспонирование имитировало процесс снятия
населяющие литоральную зону озера Байкал. сигнала с флуоресцентных сенсоров в тканях
Отлов производили с глубины 2-3 м в прибрежной ручейника. Инъекции в личинки ручейников были
зоне озера Байкал в п. Большие Коты в сентябре следующих типов: введение физиологического
2015 г. Вид определяли по (Timoshkin, 2004; раствора, введение «пустых» микрокапсул в
Lepneva, 1964). Отловленные личинки ручейников физиологическом растворе, введение микрокапсул
были прикреплены к мелким валунам в тех местах, с флуоресцентным pH-чувствительным красителем
где отсутствовало обрастание водорослями. SNARF-1, введение меченого SNARF-1 декстрана
Температура отлова — 12 °C, при данной в физиологическом растворе. Концентрация
температуре животных содержали и проводили все декстрана, меченого SNARF-1, в физиологическом
последующие эксперименты. После отлова личинки растворе составляла 0,2 мг/мл, что соответствует
ручейников были акклимированы к лабораторным средней молярной концентрации SNARF-1,
условиям в течение 4-5 суток: их содержали в используемой для измерения pH на культурах
холодильнике в аквариумах по 2-3 л в хорошо клеток (Venn et a/., 2009). Инъекции производили с
аэрируемой байкальской воде при низком помощью шприца на 100 мкл (Hamilton) с
освещении. В аквариумы помещали небольшие насаженной иглой с внешним диаметром 0,25 мм.
валуны, схожие по форме с теми, к которым Перед инъекцией по центру длины домика
ручейники были прикреплены в естественной личинки с латеральной стороны в нём делали
среде. Важно отметить, что покидание домиков отверстие размером 2-3 мм, мягко откалывая
личинками, свидетельствующее о стрессовом песчинки пинцетом. Через это отверстие под углом
состоянии ручейника, в течение акклимации не примерно 30 ° вводили 2 мкл соответствующего
наблюдали. При проведении экспериментов раствора в латеральную часть жирового тела
использовали только личинок без внешних личинки. После проведённых процедур животных
паразитов и симбионтов. возвращали в условия акклимации. Через сутки
Для проведения эксперимента ручейники были после инъекции и экспозиции под
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
Gurkov et al.
56
флуоресцентным микроскопом личинок быстро проведённого статистического анализа, для всех
вынимали из домиков и фиксировали в жидком трёх ферментов не отмечено наличия
азоте. статистически значимых отличий между выборками
Биохимические анализы (P-значения равны соответственно 0,16, 0,9 и 0,37
Зафиксированных в жидком азоте ручейников для СОД, НЭ и ГСТ). В то же время, из ранее
гомогенизировали полипропиленовым пестиком в проведённых исследований на личинках
фосфатносолевом буфере. Затем образцы ручейников известно, что экспонирование в
центрифугировали при 10000 g 10 мин. присутствии различных токсикантов должно
Полученный супернатант использовали для вызывать значительную реакцию антиоксидантной
определения активности ферментов. Активность и детоксицирующей систем, в первую очередь
СОД измеряли по методике (Beauchamp & СОД, ГСТ и экстераз (Xie et al., 2009; Berra et al.,
Fridovich, 1971), активность НЭ — по методике 2006). Таким образом, полученный в данной
(Serebrov et al., 2006), активность ГСТ — по работе результат может свидетельствовать о том,
методике (Habig et al., 1974) с модификациями что микрокапсулы (в том числе содержащие
(Timofeyev, 2010). Концентрацию общего белка флуоресцентный краситель) нетоксичны, и их
определяли по методике Брэдфорд. инъекции не вызывают развития стресс-реакции
Активность СОД и НЭ измерена для 10 антиоксидантной и детоксицирующей систем у
биологических повторностей в рамках каждой личинок ручейников B. thamastoides.
экспериментальной группы, активность ГСТ — для Следует отметить, что отсутствие токсичности
4-12 биологических повторностей. Измерения микрокапсул может иметь и кратковременный
проведены в трёх технических повторах для всех характер, поскольку остается небольшая доля
ферментов. Данные были проверены на вероятности того, что ответ защитных систем может
соответствие нормальному распределению тестом развиваться в другие временные точки после
Шапиро-Уилка, после чего логарифмированы для инъекции. Однако, в таком случае, воздействие
нормализации. Статистическую значимость непосредственно инъекции должно быть
различий оценивали однофакторным нивелировано через сутки содержания в условиях
дисперсионным анализом. Статистический анализ акклимации, в то время как ответ защитных систем
проведён в пакете R (R Core Team, 2015). на введённые в ткани микрокапсулы мог ещё не
RESULTS AND DISCUSSION успеть развиться.
Полученные результаты приведены на Рис. 1. Как следует из представленных материалов и
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
57
Injections of Encapsulated pH Sensor SNARF-1...
Figure 1. Активность СОД (A), НЭ (B) и ГСТ (C) в гомогенате тела личинки ручейников B. thamastoides в контрольной группе и через сутки после инъекции физиологического раствора (ФР), пустых микрокапсул (МК), микрокапсул с содержанием SNARF-1 (MK+SNARF-1-Д) и раствора меченого SNARF-1 декстрана (SNARF-1-Д).
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
Gurkov et al.
58
CONCLUSIONS
Таким образом, предварительные результаты наших исследований свидетельствуют в пользу нетоксичности и отсутствия выраженного стрессответа антиоксидантной и детоксицирующей систем у личинок B. thamastoides как на инъекции микрокапсул и экспонирование под флуоресцентным микроскопом, так и на инъекции инкапсулированного pH-сенсора SNARF-1. Возможность отложенных хронических эффектов на организм при применении инкапсулированных сенсоров, требует дальнейшего изучения, включающего большее количество временных точек и оцениваемых параметров стресс-реакции.
ACKNOWLEDGMENT
Коллектив авторов благодарит Адельшина Р.В. за помощь в отлове личинок ручейников, а также Рожкову Н.А., Мартемьянова В.В. и Меглинского И.В. за ценные рекомендации при проведении данной работы. Работа проведена при финансовой поддержке гранта РНФ (№ 15-14-10008).
REFERENCES
Bajkalovedenie (Baicalogy) (2012) Nauka, Novosibirsk. 1114 p. (In Russian).
Beauchamp C. & Fridovich I. (1971) Superoxide Dismutase: Improved Assays and an Assay Applicable to Acrylamide Gels. Analytical Biochemistry, 44(1), 276-287.
Berra E., Forcella M., Giacchini R., Rossaro B. & Parenti P. (2006) Biomarkers in Caddisfly Larvae of the Species Hydropsyche Pellucidula (Curtis,
1834) (Trichoptera: Hydropsychidae) Measured in Natural Populations and after Short Term Exposure to Fenitrothion. Bulletin of environmental contamination and toxicology, 76(5), 863-70.
Habig W.H., Pabst M.J. & Jakoby W.B. (1974) Glutathione S-Transferases. The First Enzymatic Step in Mercapturic Acid Formation. J. Biol. Chem, 249(22), 7130-7139.
Hodkinson I.D. & Jackson J.K. (2005) Terrestrial and Aquatic Invertebrates as Bioindicators for Environmental Monitoring, with Particular Reference to Mountain Ecosystems. Environmental management, 35(5), 649-66.
Johnson I. & Spence M.T.Z. (2011) Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. Life Technologies (Invitrogen), NY, USA.
Lepneva S. G. (1964) Fauna of USSR. Caddisflies. Publishing House of Academy of Sciences, Moscow-Leningrad, USSR (In Russian)
Martens K. (1997) Speciation in Ancient Lakes. Trends in Ecology & Evolution, 12(5), 177-182.
Moore M.V., Hampton S.E., Izmest'eva L.R., Silow E.A., Peshkova E.V. & Pavlov B.K. (2009) Climate Change and the World's ‘Sacred Sea— Lake Baikal, Siberia. BioScience, 59(5), 405417.
R Core Team. (2015). R: A Language and Environment for Statistical Computing (http://www.r-project.org).
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
59
Injections of Encapsulated pH Sensor SNARF-1...
Sadovoy A., Teh C., Korzh V., Escobar M. & Meglinski I. (2012) Microencapsulated Bio-Markers for Assessment of Stress Conditions in Aquatic Organisms in Vivo. Laser Physics Letters, 9(7), 542.
Serebrov V.V., Gerber O.N., Malyarchuk A.A., Martemyanov V.V., Alekseev A.A. & Glupov V.V. (2006) Effect of Entomopathogenic Fungi on Detoxification Enzyme Activity in Greater Wax Moth Galleria MelloneNa L. (Lepidoptera, Pyralidae) and Role of Detoxification Enzymes in Development of Insect Resistance to Entomopathogenic Fungi. Biology Bulletin, 33(6), 581-586.
Timofeyev M.A. (2010) Ecological and Physiological Aspects of Adaptation to Abiotic Environmental Conditions of Endemic Baikalian and Palearctic Amphipods. Thesis for Dr.Sci. degree. Tomsk, 384. (In Russian)
Timoshkin O.A. (2004) Index of Animal Species
Inhabiting Lake Baikal and Its Catchment Area. Nauka, Novosibirsk. (In Russian).
Timoshkin O.A., Bondarenko N.A., Volkova Y A., Tomberg I.V., Vishnyakov V.S. & Malnik V V. (2015) Mass Development of Green Filamentous Algae of the Genera Spirogyra and Stigeoclonium (Chlorophyta) in the Littoral Zone of the Southern Part of Lake Baikal. Hydrobiological Journal, 51(1), 13-23.
Venn A.A., Tambutte E., Lotto S., Zoccola D., Allemand D. & Tambutte S. (2009) Imaging Intracellular pH in a Reef Coral and Symbiotic Anemone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(39), 16574-9.
Xie L., Flippin J.L., Deighton N., Funk D.H., Dickey D.A. & Buchwalter D.B. (2009) Mercury(II) Bioaccumulation and Antioxidant Physiology in Four Aquatic Insects. Environmental Science & Technology, 43(3), 934-940.
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016
