CC BY
62
РАЗДЕЛ I
Em&jSfc
УДК (616.348-002.44+616.344-002-031.841-079.4:616.15-07
возможности дифференциальной диагностики язвенного колита и болезни крона с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови
о.п. Алексеева, Н.Н. Миронов, С.В. Криштопенко, Е.Н. Колодей,
ГУЗ «Нижегородская областная клиническая больница им. Н.А. Семашко»
Алексеева Ольга Поликарповна - e-mail: al_op@mail.ru
Обследован 61 пациент (46 - язвенный колит (ЯК), 15 - болезнь Крона (БК)) в активной фазе заболевания с эндоскопически и морфологически верифицированным диагнозом. Изучена возможность использования высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови для дифференциальной диагностики заболеваний (ЯК и БК). Высушенный экстракт сыворотки
крови подвергался исследованию на хроматографе «Милихром А-02». Обработка хроматограмм производилась при помощи многоуровневого кластерного анализа с формированием трехмерных образов патологических состояний, достоверно отличающегося при ЯК и БК. Диагностическая чувствительность и точность метода достигала 100%.
Ключевые слова: язвенный колит, болезнь Крона, дифференциальная диагностика,
жидкостная хроматография.
61 patients (46 - Ulcerative colitis, 15 - Crohn's disease in active phase) with the endoscopically and morphologically verified diagnosis are examined. A possibility of a blood serum highly effective fluid chromatography use for the disease diagnosis is studied. A blood serum dried extract was investigated on the «Milichrome A 02» chromatograph. The chromatograms were study with a use of a multilevel cluster analysis with a pathologic state three-measured form, trustworthy differing from Ulcerative colitis and Crohn's disease. A diagnostic sensitivity and accuracy of the method was achieving 100%.
Key word: Ulcerative colitis, Crohn's disease, differencial diagnostic, fluid chromatography.
Введение
Воспалительные заболевания кишечника, прежде всего язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), по частоте осложнений, тяжести течения, инвалидизации лиц молодого возраста занимают одно из ведущих мест в структуре болезней желудочно-кишечного тракта. При этом во всем мире, в том числе и в России, отмечается четкая тенденция увеличения распространенности этой патологии среди всех возрастных групп. Диагностика этих заболеваний продолжает представлять трудности для клиницистов. «Диагностические ловушки» ставят в тупик даже опытных клиницистов, а у 10-15% больных не удается разграничить эти два заболевания [1, 2].
Существенные трудности в диагностике воспалительных заболеваний кишечника связаны с поздним обращением пациентов за медицинской помощью, плохой осведомленность врачей первичного звена об этих заболеваниях, многообразной клинической картиной и системными проявлениями болезни, необходимостью использования для диагностики рентгенологических (ирригоскопия и изучение пассажа бария по тонкой кишке, эндоскопических (фиброколо-носкопия, фиброгастродуоденоскопия) и морфологических методов. Средние сроки постановки диагноза ЯК от начала заболевания составляют от 2 до 8 месяцев, болезни Крона - от 6 месяцев до 2 лет. Все это создает необходимость поиска новых диагностических методов ЯК, БК и способов их разграничения.
В современной аналитической химии и биохимии широко применяется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) биохимических сред [3, 4].
Цель исследования: апробация возможности применения высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови для дифференциальной диагностики ЯК и БК.
Материалы и методы
Обследован 61 пациент (46 - с ЯК, 15 - с БК). Мужчин - 35 человек (из них 28 - с ЯК, 7 - с БК), женщин - 26 человек (из них 18 - с ЯК, 8 - с БК). Средний возраст больных составил 35,3 года (у мужчин - 34 года, у женщин - 36 лет).
Больные ЯК имели давность заболевания от 6 месяцев до 25 лет, большинство больных (55%) имели давность заболевания от 1 года до 5 лет. Больные БК имели давность заболевания от 6 месяцев до 10 лет. В исследование не включались больные с тяжелой сопутствующей патологий. Диагноз у всех больных верифицирован эндоскопически и морфологически. Тяжесть ЯК оценивалась по международному критерию PGA. Значение данного показателя составило у больных от 5 до 11 баллов.
Тяжесть БК оценивалась по стандартному международному индексу активности болезни Крона (CDAI). Величина данного индекса составляла у больных от 220 до 450 ед.
В качестве объекта исследования была выбрана сыворотка крови как наиболее доступный материал, несущий в себе максимально возможную информацию о состоянии органов человека.
Забор крови в количестве 5-10 мл проводился у пациентов натощак. Полученная сыворотка (не менее 2 мл) высушивалась при 25°С до состояния сухой корочки и перемалывалась до состояния гомогенного порошка. Далее бралась навеска порошкообразной сыворотки в количестве 40 мг и проводилась экстракция 85% метанолом в течение 45 минут. После осаждения крупно- и среднемолекулярных белков проводилось центрифугирование смеси при скорости 12 000 об./мин., с последующим отбором надосадочной жидкости. Полученный таким образом экстракт сыворотки крови подвергался хроматографическому исследованию.
При анализе использовалась стандартная методика исследования на хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «Эконова», г. Новосибирск). Современные жидкостные хроматографы на микроволнах типа «Милихром А-02» представляют собой аналитический комплекс функционально объединенных устройств, обеспечивающих разделение жидких смесей, детектирование, идентификацию и количественный учет компонентов смеси. Контрольная программа встроенного в спектрофотометр компьютера не допускает неправильных и несовместимых параметров, обеспечивая автоматический набор пробы, спектрофотометрическое детектирование, объективность и высокую точность анализов. С использованием специальной диагностической системы STADIA 4,52 на основе многоуровнего кластерного анализа формировались трехмерные образы заболевания [5].
Результаты и обсуждение
Результатами исследования являлись построенные при помощи ВЭЖХ спектральные образы сыворотки крови, которые статистически достоверно разграничивали группы больных ЯК и БК.
ВЭЖК спектральные образы сыворотки крови больных ЯК и БК, представленные на рисунке, имеют свои специфические характеристики и не пересекаются.
РИС.
Жидкостно-хроматографические спектральные образы сыворотки крови групп больных язвенным колитом (синяя окраска) и болезнью Крона (белая окраска).
РАЗДЕЛ I
РАЗДЕЛ I
ЕЮ
На рисунке видно практически полное расхождение диагностических образов язвенного колита и болезни Крона.
Результаты статистического анализа, представленные в таблице, показывают полное разграничение показателей ВЭЖГ у больных язвенным колитом и болезнью Крона с чув-^ ствительностью 100% и уровнем вероятности по критерию хи-квадрат 99.81.
таблица.
Результаты статистического анализа для дифференциальной диагностики между группами больных язвенным колитом и болезнью Крона при помощи ВЭЖХ сыворотки крови
Показатели Болезнь Крона Язвенный колит
Количество больных 15 46
Истинная диагностика 15 46
Гиподиагностика 0 0
Чувствительность диагностики (%) 100 100
Диагностическая точность (%) 100
Критерий хи-квадрат 39,984
Уровень вероятности (%) 99,81
В результате выполненных исследований показана возможность использования технологии построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови для дифференциальной диагностики язвенного колита болезни Крона в стадии обострения. Чувствительность и точность диагностики составили 100%.
Проводя обсуждение результатов исследования необходимо подчеркнуть, что патогенетические механизмы ЯК и БК не идентичны. Существуют особенности иммунных сдвигов, изменения в функции макрофагов, выделении специфических медиаторов воспаления, выработки аутоантител и другие специфические отличия [6].
Применение иммуногистохимических методов исследования позволило обнаружить увеличение количества иммуноглобулин^-содержащих клеток в слизистой оболочке толстого кишечника. При этом продукция Gg-G-1 субкласса увеличивается в ответ на пептидные антигены, а продукция Gg-G-2-субкласса - в ответ на действие бактериальных антигенов. Первый вариант был характерен для ЯК, второй - для БК [7].
Указанные особенности патогенеза ЯК и БК создают предпосылку для разграничения этих заболеваний, в частности, использование метода ВЭЖХ. Сыворотка крови, несмотря на то, что является очень сложной по своему составу субстанцией, подчинена единым физико-химическим принципам строения и функционирования биологических жидкостей. При дегидратации молекулы и молекулярные комплексы претер-
певают пространственные перемещения и локализуются в строго определенном месте в форме фиксированной волны на хроматографе. При этом каждая волна соответствует градиенту концентрации групп ассоциированных молекул, близких по своей физико-химической структуре. Волновые ритмы различного характера и качества являются одной из форм самоорганизации живой материи и ее взаимосвязи как с внешней, так и с внутренней средой организма [8, 9].
Почти все зарегистрированные на хроматограмме пики являются олигопептидами, пептидами или низкомолекуляр-ныими белками. На этом основании существует реальная возможность построения специфичных образов болезней, в том числе ЯК и БК, которые будут отличаться по своим временным и частотным характеристикам. Диалектически сам метод ВЭЖХ уникально сочетает элементы анализа, определяемые хроматографическим разложением такого биологического субстрата, как сыворотка крови на микроструктуры, и элементы синтеза, осуществляемые посредством многоуровневого кластерного анализа с формированием стабильного положения конечного образа в трехмерном пространстве, которое и осуществляется с использованием специальной компьютерной программы [5].
Выводы
1. Метод ВЭЖХ сыворотки крови позволяет проводить диагностику и дифференциальную диагностику язвенного колита и болезни Крона на основе построения трехмерных образов болезней.
2. Диагностическая чувствительность и точность метода составила 100%.
литература
1. Белоусова Е.А. Рекомендации по диагностике и лечению болезни Крона. // Фарматека. 2009. № 13 (187). С. 38-44 .
2. Loftus E.V.J. Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease: Oncidence prevaletnce and environmentae influences. // Gastuoenterol. 2004. V . 126. № 6. Р. 1504-1517.
3. Насонов С.Н., Диш А.Ю., Хазанов В.А. Особенность высокоэффективной жидкостной хроматографии анализа гликозида в плазме крови. // Актуальные проблемы эксперементальной и клинической фармакологии. Томск: Издательство Томского университета, 2001. С. 61-63.
4. Барам Г.И. Хроматограф Милихром А-02. Определение веществ с применением баз данных ВЭЖХ-УФ. Новосибирск. 2005. 64 с.
5. Насонов С.В. Свидетельство о регистрации программы для ЭВМ № 200761453. Программа для обработки спектров и создания экспертных диагностических систем Data Stat. 2007.
6. Белоусова Е.А. Язвенный колит и болезнь Крона. Тверь: Триада, 2002. 127 с.
7. Dalton H.R. Yewell D.P. The immunolody of inflammatory bowel disease. Inflamatory Bowel Dissease . Ed. by G. Jarnerot. 1992. Р. 125-147.
8. Глесдорф Т.Т., Пригожин Н.В. Термодинамическая теория структуры, устойчивости и флуктуации. М.: Мир, 1973. 243 с.
9. Шабалин В.Н. , Шатохина С.Н. Аутогенные ритмы и самоорганизация биожидкостей. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1996. № 10. С. 364-371.
