Научная статья на тему 'Возможность определения однонуклеотидных полиморфизмов и HLA-генотипирования эмбрионов на основании генетического материала бластомеров в программах преимплантационного скрининга'

Возможность определения однонуклеотидных полиморфизмов и HLA-генотипирования эмбрионов на основании генетического материала бластомеров в программах преимплантационного скрининга Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
341
44
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ПРЕИМПЛАНТАЦИОННЫЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ (ПГС) / БЛАСТОМЕРЫ / ПОЛНОГЕНОМНАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ (ПГА) / ОДНОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПОЛИМОРФИЗМЫ (SNP) / МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ / ГЕНЫ ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ (MHC) / PREIMPLANTATION GENETIC SCREENING (PGD) / BLASTOMERES / WHOLE GENOMIC AMPLIFICATION (WGA) / SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNP) / MASS SPECTROMETRY / GENES OF THE MAIN HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC)

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Гудков Георгий Владимирович, Филиппов Евгений Федорович, Тен Флора Паксуновна, Крутенко Дмитрий Викторович, Тарасов Ярослав Владимирович

В работе показана возможность расширенного преимплантационного генетического скрининга (ПГС), позволяющего усовершенствовать стратегию отбора эмбрионов, удовлетворяющих не только требованию по отсутствию хромосомных нарушений, но и включающую их дополнительную проверку на предрасположенность к различным заболеваниям, а также выбор эмбриона с наиболее оптимальным HLA гаплотипом в случаях выраженной совместимости родителей по HLA-генам

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Гудков Георгий Владимирович, Филиппов Евгений Федорович, Тен Флора Паксуновна, Крутенко Дмитрий Викторович, Тарасов Ярослав Владимирович

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

THE POSSIBILITY OF THE DETERMINATION OF SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS AND HLA-GENOTYPING OF EMBRYONES ON THE BASIS OF THE GENETIC MATERIAL OF THE BLASTOMERES IN THE PROGRAMS OF PREIMPLANTATION SCREENING

The research shows the possibility of extended preimplantation genetic screening (PGD) that allows to improve the strategy of selection of embryos that satisfies not only the requirement of the absence of chromosomal abnormalities, but also includes their additional check for predisposition to various diseases, as well as the choice of the embryo with the most optimal HLA haplotype in cases with expressed compatibility of parents for HLA-genes

Текст научной работы на тему «Возможность определения однонуклеотидных полиморфизмов и HLA-генотипирования эмбрионов на основании генетического материала бластомеров в программах преимплантационного скрининга»

УДК 576.3:[57.086.862+57.088.1]

14.00.00 Медицинские науки

ВОЗМОЖНОСТЬ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОДНОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОЛИМОРФИЗМОВ И иьл-ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ НА ОСНОВАНИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА БЛАСТОМЕРОВ В ПРОГРАММАХ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОГО СКРИНИНГА

Гудков Георгий Владимирович д.м.н., профессор

Филиппов Евгений Федорович д.м.н., профессор

Тен Флора Паксуновна ГБОУ ВПО КубГМУМинздрава России, кафедра клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС, г. Краснодар, Россия

Крутенко Дмитрий Викторович к.б.н.

Тарасов Ярослав Владимирович Биолог

Курелинок Светлана Александровна врач-репродуктолог

Пивень Александр Владимирович биолог

Демченко Леонид Сергеевич биолог

Отделение клеточных и репродуктивных технологий МБУЗ «Детская городская клиническая больница №1», г. Краснодар, Россия

В работе показана возможность расширенного преимплантационного генетического скрининга (ПГС), позволяющего усовершенствовать стратегию отбора эмбрионов, удовлетворяющих не только требованию по отсутствию хромосомных нарушений, но и включающую их дополнительную проверку на предрасположенность к различным заболеваниям, а также выбор эмбриона с наиболее оптимальным HLA гаплотипом в случаях выраженной совместимости родителей по HLA-генам

Ключевые слова: ПРЕИМПЛАНТАЦИОННЫЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ СКРИНИНГ (ПГС), БЛАСТОМЕРЫ, ПОЛНОГЕНОМНАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ (ПГА),

UDC 576.3:[57.086.862+57.088.1] Medical sciences

THE POSSIBILITY OF THE DETERMINATION OF SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS AND HLA-GENOTYPING OF EMBRYONES ON THE BASIS OF THE GENETIC MATERIAL OF THE BLASTOMERES IN THE PROGRAMS OF PREIMPLANTATION SCREENING

Gudkov Georgy Vladimirovich Dr.Sci.Med., professor

Filippov Evgeny Fedorovich Dr.Sci.Med., professor

Ten Flora Paksunovna GBOU VPO KubGMU,

Department of clinical immunology, Allergology and laboratory diagnostics, Krasnodar, Russia

Krutenko Dmitry Viktorovich Cand.Biol.Sci.

Tarasov Yaroslav Vladimirovich Biologist

Kurelenok Svetlana Alexandrovna reproductive physician

Piven Aleksandr Vladimirovich Biologist

Demchenko Leonid Sergeevich Biologist

Department of cellular reproductive technologies of "Children's city clinical hospital №1", Krasnodar, Russia

The research shows the possibility of extended preimplantation genetic screening (PGD) that allows to improve the strategy of selection of embryos that satisfies not only the requirement of the absence of chromosomal abnormalities, but also includes their additional check for predisposition to various diseases, as well as the choice of the embryo with the most optimal HLA haplotype in cases with expressed compatibility of parents for HLA-genes

Keywords: PREIMPLANTATION GENETIC SCREENING (PGD), BLASTOMERES, WHOLE GENOMIC AMPLIFICATION (WGA), SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNP), MASS

ОДНОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПОЛИМОРФИЗМЫ (SNP), МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ, ГЕНЫ ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ (MHC)

Doi: 10.21515/1990-4665-134-008

Преимплантационный генетический скрининг (ПГС) на основе метода сравнительной геномной гибридизации на микрочипах (Array Comparative Genomic Hybridization, aCGH) служит для выявления цельнохромосомных нарушений у эмбриона, а также крупных внутрихромосомных перестроек [1, 2, 3]. Данный метод не позволяет определять однонуклеотидные полиморфизмы (Single Nucleotide Polymorphism, SNP), которые могут иметь большое значение в предрасположенности будущего ребенка к различным заболеваниям [4, 5]. Другим отягощающим фактором, после отбора здорового по результатам aCGH эмбриона, может быть неблагоприятная комбинация родительских аллелей по генам главного комплекса гистосовместимости (Major Histocompatibility Complex, MHC). В случае, когда HLA-антигены матери и отца сходны по большому числу аллелей, эмбрион по данным антигенам будет близок к матери, что не обеспечит необходимую стимуляцию ее иммунной системы и может стать причиной прерывания беременности. Например, установлено, что при наличии общих аллелей по локусу DRB1 у матери и эмбриона риск ранних преждевременных родов в 5 раз выше, чем у пар мать-ребенок, где HLA совместимость по данному локусу отсутствует [6]. По этой причине, при выраженной HLA-совместимости супругов, нормальные по результатам aCGH эмбрионы желательно подвергать дополнительному "сортингу" с выбором для переноса в процедуре ЭКО тех из них, которые имеют комбинацию HLA аллелей наиболее отличную от гаплотипа матери.

Важным этапом на пути формирования методологических основ ПГС является проведение полногеномной амплификации (ПГА) с

SPECTROMETRY, GENES OF THE MAIN HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC).

получением библиотеки фрагментов, репрезентативно отражающих геном единичных клеток - бластомеров [7]. Только благодаря успехам последних лет, связанных с разработкой методов ПГА, стало возможным снять ограничения "малых количеств" стартового материала для целей молекулярно-генетического анализа [8]. Современные протоколы ПГА обеспечивают практически 1000-кратное умножение генома отдельных клеток развивающегося зародыша [9], что предоставляет широкую возможность для тестирования различных молекулярно-генетических методов. В этой связи, качество ПГА должно обеспечивать не только проведение аСОИ, но и возможность эффективной реализации полимеразно-цепных реакций (ПЦР), лежащих в основе выявления 8КР и ИЬЛ-генотипирования.

Таким образом, актуальность внедрения расширенного ПГС очевидна, поскольку позволяет усовершенствовать стратегию отбора эмбрионов, удовлетворяющих не только требованию по отсутствию хромосомных нарушений, но и включающую их дополнительную проверку на предрасположенность к различным заболеваниям, а также выбор эмбриона с наиболее оптимальным ИЬЛ гаплотипом в случаях выраженной совместимости родителей по ИЬЛ-генам.

Цель: В ходе процедуры ПГС на основе аСОИ изучить возможность применения полногеномной амплификации генетического материала единичных бластомеров для создания репрезентативной ДНК-библиотеки фрагментов, пригодной для определения однонуклеотидных полиморфизмов (8КР) и ИЬЛ-генотипирования эмбрионов на стадии дробления.

Материалы и методы

По программе вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) было обследовано 10 супружеских пар, которые имели показания к

проведению ПГС методом aCGH. Средний возраст женщин составил 34,4±5,2 года (от 26 до 42 лет). Программу ЭКО/ИКСИ проводили по стандартному протоколу. Дополнительными критериями включения пациентов в исследование являлось носительство однонуклеотидных мутаций в генах системы свертывания крови (фактор Ляйдена - F5, метионин-синтаза - MTR, метилентетрагидрофолатредуктаза - MTHFR, метионин-синтаза редуктаза - MTRR), а также высокая совместимость супругов по генам HLA (наличие трех и более совпадений по аллелям генов HLA II класса - DQA, DQB и DRB1).

В результате трансвагинальных пункций фолликулов было получено 85 ооцитов с индивидуальными колебаниями от 4 до 15 (в среднем 8,5 ооцитов на пациентку), среди которых доля ооцитов в стадии метафазы второго деления мейоза (категория М11) составила 76 (89,4%). После выполнения ИКСИ коэффициент нормального оплодотворения составил 90,5%, т.е. всего оплодотворилось 77 ооцитов (по 7,7 на пациентку).

При оценке качества эмбрионов пригодными к биопсии бластомера было признано 35 зигот (класс А), что составило 45,5% от нормально оплодотворенных зигот. Биопсия бластомеров выполнялась на 3-й день культивирования при достижении эмбрионами 6-8 клеточной стадии. В блестящей оболочке эмбриона инфракрасным лазером формировали отверстие при помощи системы лазерной диссекции "Zilos-tk" (Hamilton Thorne, USA). Далее осуществляли захват бластомера пипеткой, который шестикратно отмывали в специальной среде PBS-PVP (1% поливинилпирролидон в фосфатно-солевом буфере) и затем переносили в 0,2 мл пробирку с реагентом для экстракции ДНК. Пробирки центрифугировали и переносили в холодовой штатив для дальнейших манипуляций.

В настоящем исследовании ПГА генетического материала бластомера проводили с использованием набора "PicoPLEX™ WGA Kit"

(Rubicon Genomics, США) на ДНК-амплификаторе "Veriti" (Thermo Fisher Scientific, USA) согласно стандартному протоколу производителя. Контроль качества продуктов ПГА оценивали по результатам электрофореза в 1,5% агарозном геле с помощью системы "ChemiDoc™ XRS+" (Biorad, США). Для последующего исследования отбирались образцы демонстрирующие хорошо различимые, яркие полосы со средним размером амплифицированных фрагментов 400 п.н.

HLA-генотипирование проводили на мультиплексном проточном анализаторе "Luminex-200" (Luminex Corporation, США). В работе использовали наборы реагентов "Lifecodes HLA-DQA/B SSO Typing Kit", "Lifecodes HLA-DRB1 SSO Typing Kit" (Immucor, США). Постановку реакции и анализ результатов проводили согласно стандартному протоколу производителя.

Для исследования однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) использовали времяпролетный масс-спектрометр MALDI-TOF "Autoflex speed T" (Bruker, Германия) и набор реагентов "SNP-экспресс-MS" (Литех, Россия) к следующим SNP: фактор Ляйдена (F5, G1691A R506Q G>A, rs6025) метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR, A223V C677T C>T, rs1801133); метионин-синтаза (MTR, D919G 2756 A>G, rs1805087); метионин-синтаза редуктаза (МTRR, I22M A66G A>G, rs1801394). Все этапы реакции минисеквенирования выполняли согласно протоколу производителя. Продукты минисеквенирования в объеме 0,4 мкл, наносили на мишень ("AnchorChip"), предварительно покрытую матрицей на основе 3-гидроксипиколиновой кислоты. После высушивания мишени с нанесенными образцами ее помещали в масс-спектрометр для регистрации и обработки масс-спектров при помощи стандартного пакета программ "FlexControl", "FlexAnalysis" и "Genotools".

Результаты и обсуждение

Полногеномная амплификация

Доступное для анализа количество геномной ДНК (гДНК) является ключевым фактором, от которого зависит успешность последующего применения многих современных методов молекулярно-генетического анализа. После биопсии бластомера необходимо амплифицировать его гДНК, содержание которой менее 10 пг, что крайне недостаточно для проведения различных методов молекулярной диагностики (секвенирование, микрочипы, генотипирование коротких тандемных повторов, количественная ПЦР и др.). Количество гДНК необходимое для этих методов колеблется от 1 до 100 нг, что соответствует 160-1600 клеткам [7].

Главное требование к продукту ПГА - максимально возможная и пропорциональная репрезентативность всех участков генома единичных клеток. Для этого необходимо создание точек инициации репликации, равномерно разбросанных по всему геному на расстояниях, которые полимераза успеет преодолеть до того, как диссоциирует с матрицы ДНК. Несмотря на разнообразие методов ПГА (DOP-PCR, LA-PCR, MDA, MALBAC и др.) наиболее перспективными для целей ПГС являются две сходные технологии "PicoPlex" и "MALBAC" (Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles). Они обеспечивают широкое покрытие генома и достаточно равномерную амплификацию всех его участков за счет наличия квазилинейного этапа предварительной репликации первичного транскрипта амплификации, которая позволяет существенно уменьшить неравномерность воспроизведения гДНК в ходе последующего этапа экспоненциального роста числа ампликонов [9].

Наиболее показательной методикой ПГА, заслуживающей отдельного рассмотрения, является технология MALBAC (рис. 1). Для этих целей разработан специальный праймер, который имеет на 5'-конце одинаковый 27-нуклеотидный "хвост", а на 3'-конце - последовательность

Г I 1 и и

случайных нуклеотидов. Такие праимеры при низкои температуре (15—20°С) равномерно гибридизуются на протяжении всей матрице гДНК, а при повышении температуры до 70-75°С начинают репликативно удлиняться с образованием полуампликонов различной длины (0.5-1.5 кЬ) с единственным "5'-хвостом". Для этих целей используется термостабильная ДНК-полимерза с вытесняющей активностью. Для этих

и о и I

целей разработан специальный праймер, который имеет на 5 -конце одинаковый 27-нуклеотидный "хвост", а на З'-конце - последовательность

Г I 1 и и

случайных нуклеотидов. Такие праймеры при низкой температуре (15-20°С) равномерно гибридизуются на протяжении всей матрице гДНК, а при повышении температуры до 70-75°С начинают репликативно удлиняться с образованием полуампликонов различной длины (0.5-1.5 кЬ) с единственным "5'-хвостом". Для этих целей используется термостабильная ДНК-полимерза с вытесняющей активностью.

Рис. 1 - Схема, поясняющая технологию MALBAC полногеномной аплификации гДНК [9]. Случайный отжиг праймеров на матрице гДНК и их репликация с линейным ростом числа полуампликонов, а затем и полных ампликонов в ходе температурного цикла. Полные ампликоны замыкаются в шпильки за счет "липких" комплементарных концов, благодаря чему они теряют способность к дальнейшему участию в цикле линейной репликации. На финальном этапе протекает ПЦР с ДНК матрицы полных ампликонов с экспоненциальным ростом их числа. m -число температурных циклов (8-12); n - число праймеров

гибридизованных с ДНК-матрицей; (m + 1) х n - число полуампликонов на

2

m-цикле; m х n - число полных ампликонов генерируемых на m-цикле.

При температуре 95°C полуампликоны денатурируют с матрицы гДНК и далее они служат матрицей для репликации с обратной стороны, в ходе которой формируются полные ампликоны с двумя комплементарными друг другу концами ("хвостами"). При снижении температуры до 58° C "липкие" концы полных ампликонов соединяются с формированием шпилечной структуры (петель ДНК), что предохраняет их от дальнейшей амплификации в следующих циклах (выход из цикла). Число таких циклов повторяется 8-12 раз, что обеспечивает квазлинейный рост достаточного числа полных ампликонов замкнутых в петли. Предварительная квазиленейная амплификация в течение небольшого числа циклов является критически важной для следующего этапа ПЦР поскольку позволяет избежать неравномерного воспроизведения гДНК в ходе экспоненциальной амплификации. На этом финальном этапе полные ампликоны сами являются ДНК матрицей для экспоненциальной амплификации в ходе обычной ПЦР. Наличие линейного этапа предамлификации имеет большое значение, что выгодно отличает MALBAC технологию от DOP-PCR и MDA, позволяющее реализовать на ее основе диагностику вариации числа копий генов (Copy Number Variation, SNV) и минимизировать долю ложноотрицательных заключений при определении SNP.

На рис. 2 в качестве примера представлены образцы продуктов ПГА генетического материала бластомеров в 1,5% агарозном геле. Как видно из рисунка, после ПГА в образцах № 1, 2 и 3 выявили недостаточное количество генетического материала, что привело к сомнительным результатам при проведении дальнейших исследований.

МК1234567

500400 -300-

hitüil

Рис. 2 - Пример визуальной оценки качества ПГА.

М - маркер молекулярной массы. К - контрольная ДНК (ДНК, разведенная до концентрации 6,25 пг/мкл, что примерно соответствует концентрации ДНК в одной клетке). 1 - 7 - номера образцов генетического материала бластомеров после ПГА.

Длина амплифицированных фрагментов ДНК лежала в диапазоне длин от 300 до 600 п.н. Как уже отмечалось выше, из 35 образцов в 3-х визуально наблюдали тусклые полосы (бенды), характеризующие недостаточную амплификацию геномной ДНК.

HLA-генотипирование

HLA-генотипирование проводили c использованием коммерческих наборов на основе технологии SSO, принцип которой основан на амплификации геномной ДНК из образца с последующей гибридизацией на олигонуклеотидных зондах нанесенных на микросферы. Для исследования использовали генетический материал после ПГА, полученный от всех 35 эмбрионов, а также соответствующую геномную ДНК от всех родительских пар. Правильная комбинация всех родительских аллелей HLA генов II класса во всех исследованных локусах (DRB1, DQA и DQB) была определена в 31 (88,6%) образце (табл. 1). В образцах

амплифицированной ДНК с тусклой (3 эмбриона) или нормальной (1 эмбрион) визуализацией бендов на геле были определены не корректно одна из аллелей (3 случая) или обе аллели (1 случай).

Таблица 1 - Результаты НЬЛ-генотипирования эмбрионов по локусам БКБ1, DQA и DQB с указанием числа совпадений с родительскими аллелями.

Число совпадений Локусы НЬЛ Совпадения по всем трем локусам НЬЛ

DRB1 DQA DQB

по материнской аллели 35 (100%) 34 (97,1%) 34 (97,1%) 34 (97,1%)

по отцовской аллели 33 (94,3%) 32 (91,4%) 33 (94,3%) 31 (88,6%)

по обеим аллелям 33 (94,3%) 32 (91,4%) 32 (91,4%) 31 (88,6%)

Как видно из представленных данных в подавляющем большинстве случаев (88,6%) подтвердилась возможность проведения НЬЛ-генотипирования после выполнения ПГА генетического материала бластомеров, полученных на 3-й день дробления эмбрионов. Для выполнения процедуры ЭКО, по возможности, отбирали эмбрионы, НЬЛ гаплотип которых характеризовался максимальной гетерозиготностью по исследованным локусам НЬЛ генов II класса.

Масс-спектрометрическая детекция полиморфизмов (8ИР) MAЬDI-TOF масс-спектрометрия позволяет быстро, с высокой точностью и производительностью определять наличие генетических полиморфизмов, не требуя использования дорогостоящих изотопных или флуоресцентных меток. Результат измерения представляет собой масс-спектр продуктов реакции минисеквенирования в виде пиков, соответствующих ионам определенной молекулярной массы, по которым выносят суждение о нуклеотидных заменах в данном положении [10].

Процесс идентификации 8КР данным методом включает следующие основные этапы. На матрице геномной ДНК, выделенной из венозной крови пациента, проводят амплификацию фрагментов генов, включающих исследуемый 8КР полиморфизм. Дале выполняют дефосфорилирование

продуктов амплификации ДНК с целью гидролиза дНТФ, которые препятствуют реакции минисеквенирования. Для этого используется щелочная фосфатаза креветки (rSAP - от англ. recombinant Shrimp Alkaline Phosphatase), которая дефосфорилирует 5'- и 3'-монофосфатные концы олигонуклеотидов и нуклеотидов, но не проявляет активности в отношении молекул ДНК и РНК, имеющих на концах 2 - 3 фосфатных остатка. Для проведения минисеквенирования используют короткий олигонуклеотидный зонд (от 15 до 30 нуклеотидов), который отжигается на ДНК матрице непосредственно перед нуклеотидом, где может иметь место замена (полиморфизм), а также строго определенный набор из 2'-дезокси (dNTP) и 2',3'-дидезокситринуклеотидов (ddNTP) - терминаторы (не способны создавать фосфодиэфирную связь со следующим нуклеотидом). В ходе минисеквенирования ДНК-полимераза достраивает зонд комплементарно матрице, в роли которой выступает амплифицированный фрагмент нужного гена, с образованием продуктов разной молекулярной массы. Принципиальная схема реакции минисеквенирования представлена на рис. 3.

Аллель 1 ("Т")

SNP-зонд (23 эвена)

I К

-ТТА —

SNP

+ДНК полимераза

- ddATP * dGTP

Аллель 2 ("С")

SNP-зонд (23 звена)

I К

-©ТА-

I

I

SNP

Достроенный SNP-зонд (24 звена)

I

i

] ddA

-ТТА—

Достроенный SNP-зонд (25 звеньев) dG

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

I, MlddA

-СТА-

и а и 24 25 » V а

ППЯ1ГТТП

I

Я 22 23 24 25 » 27 2« 21 22 2! 24 ¡5 2S 27 2а

□□нииапп □□ЕЮИОШ

li«H4Ual.jJ*IiL ..I,

Аллель 1 Гомозигота Т/Т

зонд *

»w'wiif, L.

I'UfiJU

Аллель 1/2 Гетерозигота Т/С

иШ

Аллель 2 Гомозигота С/С

Рис. 3 - Принципиальная схема реакции минисеквенирования и масс-спектрометрического анализа продуктов реакции

Например, на матрице ЛССОЛ ТООССОА ТОСЛ ТС [С/Т] ОТС (замена

с>т) при использовании зонда с 5'-лссалтаассалтаслтс-з' с

наборам нуклеотидов ёТ, ёёс и ёёО, продуктами реакции минисеквинирования будут: продукт - ACCGATGGCCGATGCATC+ddC, в случае аллеля "С" (5758 Да); продукт -ACCОATООCCОATОCATC+dT+ddG, в случае аллеля "Т" (6102 Да); оба продукта - при гетерозиготном генотипе (рис. 4).

Аллель"С" ACCGATGGCCGATGCATCCGTC

....... I

TGGCTACCGG ACCGATGGCCGATGCATC

-----■ -------- ----" ' — — ■ —..........HUI-V3H I UV3V.V.V3H I UV-H I V. VJ I V-.....

3GCTACCGGCTACGTAGGCAG..... ТСПГТДГГСЯГТДГЯТДЯ ГДй

зонд

Аллель -Т ACCGATGGCCGATGCATCTGTC .

TGGCTACCGGCTACGTAGACAG. ACCGATGGCCGATGCATC

зонд

ddG

Аллель "Т"

Зонд Аллель "С" 6102 Да

5485 Да 5758 Да

ddc dT

Продукты

ACCGATGGCCGATGCATC^] ПЦР ACCGATGGCCGATGCATC|TG]

Рис. 4 - Пример реакции минисеквенирования с использованием зонда (5485 Да) и набора нуклеотидов ёТ, ёёс, ёёО с последующей детекцией ПЦР-продуктов (5758 Да и 6102 Да), соответствующих аллелям "С" и "Т"

В настоящем исследовании использовали времяпролетный масс-спектрометр MALDI-TOF "Autoflex speed T" (Bruker, Германия) и набор реагентов "8КР-экспресс-М8" (Литех, Россия) к SNP следующих генов: фактор Ляйдена (F5), MTHFR, MTR и MTRR. Все этапы реакции минисеквенирования выполняли согласно протоколу производителя. Продукты минисеквенирования в объеме 0,4 мкл, наносили на мишень ("AnchorChip"), предварительно покрытую матрицей на основе 3-гидроксипиколиновой кислоты. После высушивания мишени с нанесенными образцами ее помещали в масс-спектрометр. Регистрацию и анализ масс-спектров выполняли при помощи стандартного пакета программ для масс-спектрометра "Autoflex Speed": "Flex Control", "FlexAnalysis" и "Genotools".

Рис. 5. - Пример мультиплексного определения в программе "Оепо1;оо18" двух 8КР гена аполипопротеина Е (АроЕ): Я158С (*2) С>Т (гетерозигота, пик "1") и С112Я (*4) Т>С (гомозигота, пики "2" и "3")

Для каждого из аллелей конкретного 8КР в программе "Оепо1оо1Б" создавали соответствующий протокол, включающий нуклеотидную последовательность зонда, типы нуклеотидов и терминаторов. После записи всех протоколов программа позволяла автоматически рассчитывать параметры масс-спектров для всего набора 8КР с определением соответствующих им аллелей. Пример, результата мультиплексного анализа в программе "Оепо1оо1Б", когда в одной пробе определяли несколько (два) 8МР, показан на рис. 5.

В настоящем исследовании у эмбрионов потенциально пригодных для переноса исследовали SNP-профиль наиболее важных полиморфизмов, связанных с системой свертываемости крови. Это представляется особенно важным, например, для пациенток с наследственной формой тромбофилии, поскольку наличие данных мутаций у их эмбрионов может сказываться в дальнейшем на репродуктивной функции и высоком риске тромботических осложнений у потомков [4]. Для диагностики полиморфизмов использовали генетический материал после ПГА, полученный от всех 35 эмбрионов, а также соответствующую геномную ДНК всех родительских пар. Правильная комбинация всех родительских аллелей полиморфизмов в исследованных генах была определена в 32 (91,4%) образцах. В 3-х образцах амплифицированной ДНК демонстрирующих тусклую визуализацию бендов на агарозном геле полиморфизмы в генах MTHFR и MTR были определены не корректно по одной из родительских аллелей.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности успешной реализации расширенного ПГС, который помимо диагностики хромосомных аномалий методом aCGH позволяет одновременно осуществить стратегию отбора эмбрионов на предрасположенность к различным заболеваниям (например, неблагоприятных SNP для генов системы свертывания крови), а также выбор эмбриона с оптимальным HLA гаплотипом в случаях выраженной совместимости родителей по HLA-генам.

Список литературы

1. Серов В Н., Горин В.С., Жабин С.Г., Горин Р.В., Маркдорф А.Г., Шин А.П. Новые методические подходы в пренатальной диагностике хромосомных заболеваний (обзор литературы) // Проблемы репродукции. - 2000. - № 2. - С. 11-18.

2. Буяновская О.А., Глинкина Ж.И., Каретникова Н.А., Бахарев В.А. Молекулярно-генетические методы в пренатальной диагностике хромосомных аномалий // Акушерство и гинекология. - 2012. - № 8., Т.1 - С. 3-9.

3. Екимова Е.В., Екимов А.Н., Алексеева М.Л. Роль молекулярных методов диагностики в преимплантационном скрининге эмбрионов (обзор литературы) // Проблемы репродукции. - 2012. - №6. - С. 56-59.

4. Макацария А.Д., Бицадзе В.О., Смирнова Л.М., Акиньшина СВ., Баймурадова СМ. Тромбогеморрагические осложнения в акушерско-гинекологической практике: Рук. для врачей. - М.: ООО "Медицинское информационное агентство", 2011. - 1056 с.

5. Nicolaides K.H., Syngelaki A., Gil M., Atanasova V. and Markova D. Validation of targeted sequencing of single-nucleotide polymorphisms for non-invasive prenatal detection of aneuploidy of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y // Prenatal Diagnosis. - 2013. - V.33, 6. -Р. 575-579.

6. Хорошкеева O.B., Тетруашвили H.K., Агаджанова А.А., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю. Полная гистосовместимость матери и плода как один из факторов преждевременных родов и плацентарной недостаточности // Акушерство и гинекология. - 2015. - № 10. - С. 103-106.

7. Лебедев И.Я., Черемных А.Д., Назаренко С.А., Светлаков А.В. Полногеномная амплификация ДНК: современные достижения и перспективы использования в преимплантационной генетической диагностике // Проблемы репродукции, 2005. - № 5. - С. 60-67.

8. Huang L., Ma F., Chapman A., Lu S., Xie X.S. Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015;16:79-102.

9. Huang Lei, Ma Fei, Chapman Alec, Lu Sijia, and Xie Sunney Xiaoliang Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications // Annu. Rev. Genom. Human Genet. 2015.16:79-102.

10. Степанов В.А., Трифонова Е.А. Мультиплексное генотипирование однонуклеотидных полиморфных маркеров методом масс-спектрометрии MALDI-TOF: частоты 56 SNP в генах иммунного ответа в популяциях человека // Молекулярная биология. - 2013. - Т.47, № 6. - С. 1-11.

References

1. Serov V.N., Gorin V.S., Zhabin S.G., Gorin R.V., Markdorf A.G., Shin A.P. Novye metodicheskie podhody v prenatal'noj diagnostike hromosomnyh zabolevanij (obzor literatury) // Problemy reprodukcii. - 2000. - № 2. - S. 11-18.

2. Bujanovskaja O.A., Glinkina Zh.I., Karetnikova N.A., Baharev V.A. Molekuljarno-geneticheskie metody v prenatal'noj diagnostike hromosomnyh anomalij // Akusherstvo i ginekologija. - 2012. - № 8., T.1 - S. 3-9.

3. Ekimova E.V., Ekimov A.N., Alekseeva M.L. Rol' molekuljarnyh metodov diagnostiki v preimplantacionnom skrininge jembrionov (obzor literatury) // Problemy reprodukcii. - 2012. - №6. - S. 56-59.

4. Makacarija A.D., Bicadze V.O., Smirnova L.M., Akin'shina SV., Bajmuradova SM. Trombogemorragicheskie oslozhnenija v akushersko-ginekologicheskoj praktike: Ruk. dlja vrachej. - M.: OOO "Medicinskoe informacionnoe agentstvo", 2011. - 1056 s.

5. Nicolaides K.H., Syngelaki A., Gil M., Atanasova V. and Markova D. Validation of targeted sequencing of single-nucleotide polymorphisms for non-invasive prenatal detection of aneuploidy of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y // Prenatal Diagnosis. - 2013. - V.33, 6. -R. 575-579.

6. Horoshkeeva O.B., Tetruashvili H.K., Agadzhanova A.A., Burmenskaja O.V., Trofimov D.Ju. Polnaja gistosovmestimost' materi i ploda kak odin iz faktorov prezhdevremennyh rodov i placentarnoj nedostatochnosti // Akusherstvo i ginekologija. -2015. - № 10. - S. 103-106.

7. Lebedev I.Ja., Cheremnyh A.D., Nazarenko S.A., Svetlakov A.V. Polnogenomnaja amplifikacija DNK: sovremennye dostizhenija i perspektivy ispol'zovanija v preimplantacionnoj geneticheskoj diagnostike // Problemy reprodukcii, 2005. - № 5. - S. 6067.

8. Huang L., Ma F., Chapman A., Lu S., Xie X.S. Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015;16:79-102.

9. Huang Lei, Ma Fei, Chapman Alec, Lu Sijia, and Xie Sunney Xiaoliang Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications // Annu. Rev. Genom. Human Genet. 2015.16:79-102.

10. Stepanov V.A., Trifonova E.A. Mul'tipleksnoe genotipirovanie odnonukleotidnyh polimorfnyh markerov metodom mass-spektrometrii MALDI-TOF: chastoty 56 SNP v genah immunnogo otveta v populjacijah cheloveka // Molekuljarnaja biologija. - 2013. - T.47, № 6. - S. 1-11.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.