CC BY
181
DOI: 10.23868/201805003
омиксные технологии в репродуктивной медицине: оценка качества ооцитов и эмбрионов
Е.А. Жиряева1, 2, Е.В. Киясова2, А.А. Ризванов2
1 ООО «Клиника семейной медицины», Казань, Россия
2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
OMICS technologies in reproductive medicine: assessment of quality of oocytes and embryos E.A. Zhiryaeva1' 2, E.V. Kiyasova2, A.A. Rizvanov2
1 Klinika semejnoj mediciny, LLC, Kazan, Russia
2 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
e-mail: [email protected]
Одним из основных факторов успеха процедуры вспомогательных репродуктивных технологий является отбор наиболее «качественных» половых клеток для дальнейших манипуляций и получения жизнеспособного эмбриона для имплантации. Большинство современных методик основаны на морфокине-тических предикторах качества (т. е. на оценке морфологии эмбриона и скорости деления бластомеров), которые позволили достичь определенных успехов в увеличении процента наступления беременностей и снижении числа многоплодных беременностей, но их точность на данный момент недостаточна. Таким образом, развитие объективных, достоверных, быстрых и доступных тестовых систем с целью определения качества ооцитов и потенциала развития эмбриона — одна из задач репродуктивной медицины.
Целью данного обзора стало описание преимуществ и ограничений омиксных технологий, применение которых позволит углубиться в понимание физиологии эмбриона, а также установить критерии неинвазивного отбора гамет и эмбрионов. В связи с этим в последнее время во вспомогательной репродукции применяются исследования геномных, протеомных, транскрип-томных, метаболомных профилей ооцитов, гранулезных и куму-люсных клеток, эмбрионов и кондиционированных сред.
ключевые слова: эмбрион, бластоциста, протеом, секретом, метаболом, геномика, транскриптом.
введение
Всемирная Организация Здравоохранения определяет бесплодие как отсутствие наступления беременности в течение 12 мес. регулярной половой жизни без контрацепции [1]. По последним данным, в западных странах бесплодны 9 % пар репродуктивного возраста [2, 3]. В развитых странах, в т. ч. и в России, каждая шестая пара обращается за лечением бесплодия, и количество таких пациентов продолжает расти.
Самым эффективным методом лечения бесплодия на сегодняшний момент является использование вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ): экстракорпоральное оплодотворение, инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита, донорство гамет и эмбрионов, суррогатное материнство и др.
Одним из ключевых моментов ВРТ является оценка «качества» половых клеток, эндометрия и жизнеспособности эмбрионов с целью выбора наиболее жизнеспособного эмбриона на перенос для увеличения вероятности наступления беременности и рождения здорового ребенка [4]. К сожалению, возможности определения жизнеспособности эмбриона в клинических условиях ограничены и в большинстве случаев основываются на морфологии и скорости деления клеток эмбриона [5]. Использование вышеперечисленных параметров для отбора эмбрионов позволило получить 32,3 % наступления беременности в результате программ ВРТ [3], но этого недостаточно, поэтому с каждым годом возрастает доля циклов ЭКО (экстракорпоральное оплодотворение)/ИКСИ (интрацито-плазматическая инъекция сперматозоида) с применением
One of the main factors of success of the procedure art (assisted reproductive technology) is the selection of the most "high-quality" gametes for further manipulation and obtaining a viable embryo for implantation. The majority of modern techniques based on morphokinetic predictors of quality (i. e. assessment of embryo morphology and rate of division of the blasto-meres), which allowed to achieve some success in increasing the percentage of successful pregnancies and reduce the number of multiple pregnancies, but their accuracy is currently insufficient. Thus, the development of objective, reliable, fast and affordable test systems to determine the quality of oocytes and the development potential of the embryo — one of the challenges of reproductive medicine.
The purpose of this review was to describe the advantages and limitations obecnych technologies, the application of which will allow to deepen our understanding of the physiology of the embryo, as well as set criteria for non-invasive selection of gametes and embryos. In this regard, recently in assisted reproduction are applied the studies of genomic, proteomic, transcript, and metab-olomic profiles of oocytes, granulosa and Cumulus cells, embryos, of conditioned media.
Keywords: embryo, blastocyst, proteome, secretome, metabolome, genomics, transcriptome.
преимплантационного генетического скрининга (диагностики). Согласно данным H.H. Lai с соавт. (2017), результативность программ с использованием преимплантаци-онной генетической диагностики методами aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization)/NGS (Next Generation Sequencing) может достигать 45 %/53,2 % соответственно (уровень наступления клинической беременности) [6].
Для увеличения шансов на успешное завершение цикла ЭКО, многие центры осуществляют перенос двух и даже более эмбрионов. В России суммарная доля переносов двух эмбрионов составляет 57,4 % [7]. Это может привести к возникновению многоплодной беременности, что, в свою очередь, сопровождается увеличением риска преждевременных родов и возникновению некоторых осложнений, таких как детский церебральный паралич, задержка внутриутробного развития и др. [8].
Поэтому, одна из задач современной репродуктивной медицины — разработка объективных и точных способов диагностики потенциала ооцитов и жизнеспособности эмбрионов для уменьшения числа переносимых эмбрионов.
Настоящий обзор посвящен описанию преимуществ и недостатков современных технологий для выявления «качественных» ооцитов и наиболее «перспективных» эмбрионов, основанных на анализе ооцитов, соматических клеток, окружающих ооцит, на молекулярном уровне и оценке потенциала развития эмбриона. Установление молекулярных предикторов, отражающих репродуктивные возможности организма, может помочь в лечении бесплодия.
Омиксные технологии — комплекс современных технологий, позволяющих произвести анализ всей совокупности
процессов как в одной клетке, так и в целом организме [9]. Появление омиксных технологий расширило наши знания и предоставило значительно больше информации о биологических процессах, связанных с репродуктивной функцией организма. Этот новый наукоемкий вид технологий основан на последних достижениях в таких областях исследований как протеомика, метаболомика, транскриптомика, геноми-ка и др. С их помощью можно проанализировать эпигенетические маркеры, гены, мРНК, белки и метаболиты [9].
Геномика
Геномика — наука о геномах, включающая изучение их структуры, функционирования и эволюции на молекулярном, хромосомном, биохимическом и физиологическом уровнях [10].
Многие исследования указывают на корреляцию между количеством анеуплоидных эмбрионов, полученных в результате программ ЭКО и возрастом пациентов [11, 12]. По статистике, у пациенток в возрасте младше 30 лет, доля анеуплоидных эмбрионов — 25 %, у пациенток после 40 лет — 60-70 % [13]. Согласно последним данным, доля анеуплоидных эмбрионов у пациенток в возрасте 27-37 лет увеличилась до 47 %, а в возрастной категории 38-47 лет — до 78 % [14].
Невозможно определить плоидность эмбриона, основываясь только на его морфологических характеристиках. Поэтому в программах ВРТ все чаще стали использоваться методы определения количества и структуры хромосом: preimplantation genetic screening (PGS), и preimplantation genetic diagnosis (PGD). В отличие от PGS, PGD используется в том случае, если у супружеской пары высока вероятность рождения ребенка с генетической патологией [15].
Одним из первых методов PGS была флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Для проведения FISH материал (полярное тельце, бластомер, клетки трофэктодермы), полученный в результате биопсии (полярного тельца, бластомера или клеток трофэктодермы), фиксируется на предметном стекле. Слайд с тестируемой ДНК и ДНК-зонды, помеченные различными флуорофорами, гибриди-зуются, после чего сигналы визуализируются с помощью микроскопа. Наиболее часто проводят анализ следующих хромосом: 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X и Y [16]. В зависимости от результатов исследования решается вопрос о возможности переноса эмбриона и вероятности возникновения генетической патологии у плода.
Преимуществом данного метода является возможность одновременно выявлять несколько последовательностей ДНК (РНК) в одном интерфазном ядре или на одной метафазной пластинке [17].
D. Griffin и соавт. (1992) первыми применили метод FISH для определения наследственных заболеваний, сцепленных с Х-хромосомой [18]. Другая группа ученых использовала этот же подход для определения наличия анеуплоидий у эмбрионов [19]. Однако дальнейшие исследования показали отсутствие улучшений в исходе программ ЭКО при использовании метода FISH [20-22]. Аналогичные выводы сделал в своем анализе M. Checa с соавт. (2009) [23]. Американское общество репродуктивной медицины (ASRM) и Европейское общество репродукции человека и эмбриологии (ESHRE) пришли к выводу, что использование метода FISH для определения плоидности эмбрионов при ЭКО с PGS не обосновано [24, 25]. К недостаткам данного метода можно отнести анализ ограниченного числа хромосом. Также к ложноо-трицательным результатам может привести то, что метод FISH позволяет определить наличие или отсутствие таргетного региона в ДНК-пробе и не дает информации об остальной части хромосомы. Было показано, что
около 30 % из эмбрионов, которые по результатам FISH на 3 день развития являются анеуплоидными, в результате повторного скрининга на 5 день развития оказываются эуплоидными [26]. Такая разница связана с мозаи-цизмом эмбрионов. Известно, что мозаицизм возникает на ранних стадиях развития эмбрионов [27]. Это означает, что генетический статус биопсированного для FISH анализа бластомера эмбриона может не совпадать с генетическим статусом остальных бластомеров [28]. В результате могут возникать ложно-положительные или ложно-отрицательные заключения. Таким образом, мо-заицизм эмбрионов является ограничением метода FISH для использования в PGS/PGD [29].
Метод сравнительной геномной гибридизации (comparative genome hybridization, CGH), применяющийся в генетической диагностике, позволяет тестировать все 46 хромосом в ходе одного анализа. Более того, с помощью метода CGH производится детальный анализ по всей длине хромосомы, в отличие от FISH, который способен выявить только дисбаланс хромосомных сегментов [30]. Явным преимуществом CGH, по сравнению с FISH, является определение вариаций числа копий генов (Copy number variation, CNV). CNV — вид генетического полиморфизма, включающий в себя различия индивидуальных геномов по числу копий сегментов размером от 1 тыс. до 5 млн. оснований [30]. В качестве биоматериала можно использовать полярные тельца, клетки эмбриона, ткань хориона, амниотическую жидкость и т. д. [31].
Изначально метод CGH был разработан для тестирования анеуплоидий в образцах, содержащих малое количество клеток, а именно в солидных опухолях [32]. Для гибридизации с таргетной хромосомой требуется около 1 мкг ДНК, а в одной клетке содержится 5-10 пг ДНК [33]. Таким образом, необходима полногеномная амплификация ДНК. С этой целью успешно используется полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Суть метода CGH заключается в следующем: тестируемая ДНК метится флюоресцирующим красителем одного цвета, например, зеленого, а референтная ДНК — флюоресцирующим красителем другого цвета, например, красного. Равные количества меченых тестируемой и референтной ДНК гибридизуются с нормальными нитями в метафазe в течение 2-3 сут. Затем для анализа красной и зеленой флуоресценции используется компьютерная система визуализации. При этом избыточная концентрация красного красителя указывает на дефицит тестируемой ДНК, а зеленые зоны — на излишки тестируемой ДНК, соответствующие данному участку.
D. Wells с соавт. (1999) были первыми, кто использовал метод CGH для выявления трисомии в амниоци-тах и бластомерах [34]. Их выводы были подтверждены L. Voullaire с соавт. (2003) после успешного клинического применения данного метода для диагностики эуплоид-ности эмбрионов, полученных в программе ЭКО [35].
Данный метод позволяет произвести анализ всего генома на хромосомный дисбаланс в одной реакции гибридизации. Методика требует небольшого количества материала, из которого можно выделить ДНК [36].
Однако метод CGH не пригоден для выявления сбалансированных транслокаций, инверсий или инсерций, так как структурные перестройки, не изменяющие количество хромосом, не диагностируются. Также отсутствует возможность выявления полиплоидии [36].
В отличие от CGH, метод микроматричной сравнительной геномной гибридизаций (aCGH) основан на использовании ДНК-зондов, нанесенных на стекло-микроматрицу. Чувствительность данного метода зависит от размера участков ДНК, а также от плотности
ДНК-зондов на микроматрице. В настоящее время применяются как таргерные матрицы (targeted array), так и полногеномные CGH-микроматрицы (whole genome array) [37]. Преимущества и ограничения метода aCGH аналогичны методу CGH. Однако при использовании микроматриц уменьшается сложность процедуры и время, необходимое для анализа.
aCGH также применяется для обследования пациентов с умственной отсталостью и врожденными пороками развития. С помощью данной технологии удается выявить причину нарушений в 10-20 % случаев, другие технологии дают результативность 3-5 % [38].
Еще один метод генетической диагностики — высокопроизводительная технология определения последовательности нуклеиновых кислот (NGS) — дает возможность параллельного исследования нескольких образцов на одном чипе [39]. Существуют две основных стратегии NGS.
Первая основывается на получении ДНК, ее амплификации, а затем делении на мелкие фрагменты, которые подвергаются параллельному секвенированию с последующей «сборкой» генома и сравнению с рефе-ренсной ДНК [40].
Альтернативный метод не предполагает амплификацию всего генома, а основывается на использовании мультиплексной ПЦР. Количество сайтов амплификации может варьировать от нескольких сотен до нескольких тысяч. Ключевым фактором является то, что данные ло-кусы находятся на каждой хромосоме [39].
F. Fiorentino с соавт. (2014) провели сравнительный анализ технологий aCGH и NGS для скрининга анеу-плоидий в рамках программы ЭКО с преимплантаци-онным генетическим скринингом [41]. В исследовании приняли участие 55 пациенток. Учеными была проведена биопсия клеток трофобласта на 5 сут. развития эмбрионов. В общей сложности оценке подверглись 192 эмбриона. С помощью метода aCGH было установлено, что только 74 эмбриона являются диплоидными по всем 24 хромосомам. Аналогичные результаты были получены при использовании технологии NGS. Однако некоторые анеуплоидии хромосом, которые были выявлены методом NGS и потом были подтверждены методом QF-PCR (quantitative fluorescence polymerase chain reaction), не были обнаружены методом CGH. Более высокий уровень мозаицизма (на 24,6 %) показал повторный анализ методом NGS эуплоидных бластоцист после неэффективного переноса [42].
Ограничением данной технологии является не выявление моногенных заболеваний и реципрокных транслокаций больших по протяженности участков.
В последнее время метод NGS находит все большее применение в клиниках ВРТ за рубежом, вытесняя другие методы.
Протеомика
Протеомика — это научное направление, занимающееся изучением всех белков, синтезирующихся в клетке, органе или организме. Изучение протеома эмбриона человека позволит расширить наши знания о раннем эмбриогенезе, о процессе имплантации и, теоретически, может способствовать развитию методики неинвазив-ной оценки качества эмбриона.
В ранних работах по изучению протеома использовался двумерный (2D) гель-электрофорез в сочетании с компьютерным анализом изображений для создания и анализа баз данных белков из преимплантационных эмбрионов мыши [43]. Вестерн-блоттинг (иммуноблоттинг) также применялся для определения известных белков у кроликов [44] или для выявления их посттрансляционных модификаций
у мышей [45]. С помощью масс-спектрометрии можно определить группы белков в ограниченных объемах биологических жидкостей и тканей [46].
Исследование протеома направлено на достижение двух основных целей. Первая из них — изучение изменений в составе последовательных сред (многоступенчатые среды, требуют замены в зависимости от этапа доим-плантационного развития эмбриона) при культивировании одной бластоцисты. Вторая — с помощью анализа белков найти взаимосвязь изменений в протеоме эмбрионов в зависимости от их имплантационной способности.
Секретомом эмбриона называется группа органических или неорганических соединений, которые поглощаются или выделяются эмбрионом [47]. Р. □отлпдивЕ с соавт. (2008) изучали белковые профили бластоцист человека [48]. Для анализа секретома авторы использовали мембранный белковый чип, с помощью которого исследовали 120 белков, в том числе цитокины, хемокины, факторы роста и другие важные для имплантации белки. Для получения белкового профиля в различных анализируемых условиях образцы инкубировали вместе с этими чипами. В первой части эксперимента было обнаружено четыре белка, концентрация которых изменялась в присутствии бластоцисты (СХСИ3, БОР, М8Р-А!рИа — «потреблялись» бластоцистой, а эТЫР^ — секретировался в среду).
Во второй части эксперимента сравнивали белковые профили последовательных сред в соответствии с результатами имплантации. Было установлено, что из 120 изученных белков, концентрация двух, СХСИ3 и ЭМ-СЭР, ниже в кондиционированных средах от имплантировавшихся бластоцист по сравнению с концентрацией этих белков в средах от не импантировавшихся бластоцист [48].
Позднее Р. □отлпдивЕ с соавт. (2015) определили, что концентрация 11_-6 и БСР гораздо выше в кондиционированных средах, в которых культивировались имплантировавшиеся бластоцисты, чем в средах, где культивировались не имплантировавшиеся бластоцисты [49].
Также было показано, что тромбоцитактивирующий фактор [50] и лептин [51] продуцируются и секретируют-ся преимплантационными эмбрионами.
К настоящему времени не установлен спектр белковых молекул, по концентрации которых в культуральной среде можно было бы выбрать наиболее жизнеспособные эмбрионы. Работы по поиску биомаркеров «перспективных» эмбрионов находятся на стадии «пилотных» разработок. Основное препятствие для данных исследований — низкая концентрация белков в среде (ниже предела обнаружения в 1,2 пг/мл) [49].
Наряду с морфологией, неинвазивный количественный метод определения концентрации определенных белков в кондиционированной среде, которые могут стать предикторами жизнеспособности эмбриона, поможет увеличить долю имплантации при переносе одного эмбриона, снизить частоту прерывания беременностей на ранних сроках и увеличить процент живорождения.
Транскриптом
Транскриптом — совокупность всех транскриптов, синтезируемых клеткой, включая мРНК и некодирующие РНК [52].
Как известно, ооциты, эмбрионы приспосабливаются к условиям окружающей среды за счет «включения» или «выключения» определенных генов [53]. Реакция адаптации зависит от количества, целостности ДНК данной клетки, ее эпигенетического статуса. Клетки могут реагировать на свое окружение либо за счет активации определенных генов, либо с помощью механизмов, которые не требуют изменения экспрессии генов.
Увеличение экспрессии генов приводит к увеличению синтеза мРНК, уровень которой можно определить с помощью RT-qPCR (ПЦР в режиме реального времени с реакцией обратной транскрипции), микроматричного анализа (гибридизационный метод с применением чипов) или RNA-seq (NGS секвенирование кДНК, полученной с помощью реакции обратной транскрипции из РНК).
Транскриптомный анализ ооцитов — инвазивный метод. Была обнаружена связь между активностью некоторых генов в яйцеклетке (PTX3, HAS2, COX2, PTGS2, GREM1) и развитием эмбриона [54]. Экспрессия данных генов влияет на активацию эмбрионального генома и дает возможность дальнейшего развития до стадии бластоцисты.
Информацию, полученную в результате исследования транскриптома ооцитов, можно использовать для прогнозирования их компетентности.
Кроме инвазивного метода транскриптомного анализа ооцитов, используют неинвазивный подход, который основывается на микроматричном анализе соматических клеток (клетки кумулюса и гранулезы) [55-57].
Доказано, что транскриптомы зрелых яйцеклеток у женщин с синдромом поликистозных яичников и у пациенток без этого диагноза отличаются [58, 59]. X. Zhang с соавт. (2005) показали, что по уровню экспрессии определенных генов (PTX3, COX-2, uPA) в клетках кумулюса, можно спрогнозировать качество ооцита [60]. Большая часть этих генов участвуют в процессах энергетического метаболизма, митохондриальной активности, апоптоза, деления клеток кумулюса и гранулезы [61].
S. Assou с соавт. (2008) обнаружили, что клетки ку-мулюса, полученные от ооцитов, которые развились в эмбрионы высокого качества, имеют различные профили экспрессии генов (BCL2L11, PCK1, NFIB) в зависимости от наличия или отсутствия имплантации [62]. Недостатком данного метода является вероятность «загрязнения» исследуемого образца клетками крови (во время трансвагинальной пункции фолликулов), что повлияет на профиль экспрессии генов.
Метаболом
Метаболомический профиль или метаболом — это анализ различных метаболитов, являющихся продуктами обмена веществ в клетке, ткани, органе или организме. Метаболомика пытается определить метаболиты, образующиеся при физиологических и патологических состояниях [63, 64].
Цель анализа метаболома — выбор жизнеспособных гамет и эмбрионов с высоким имплантационным потенциалом для увеличения результативности программ ВРТ [65]. Имеющаяся информация о метаболомах ооци-тов ограничена [59, 66]. Это связано с инвазивностью методики забора ооплазмы. Гораздо больше исследований направлено на определение метаболомического профиля ооцитов и эмбрионов в фолликулярной жидкости и среде культивирования, а также в клетках кумулюса и гранулезы.
В метаболомике отсутствует какая-то одна ведущая технология оценки метаболомного профиля. Все используемые методы можно разделить на две группы [67].
Первая группа включает в себя методы масс-спектрометрии, как газовой, так и жидкостной. Эта группа имеет широкий диагностический спектр, требует сложного этапа предварительной подготовки образца и его количественный анализ. Время анализа колеблется от 5 до 140 мин.
Вторая группа объединяет такие методы, как спектроскопия, в том числе ядерно-магнитный резонанс (ЯМР), и инфракрасная технология (инфракрасная
спектроскопия с преобразованием Фурье). Эти методы анализа требуют минимальной подготовки образца (фолликулярная жидкость, клетки кумулюса, редко — полярное тельце), используются для классификации образцов, имеют ограниченные возможности для количественной оценки метаболитов и их идентификации, за исключением ЯМР [68].
В ранних исследованиях показана связь между уровнем потребления глюкозы и качеством эмбрионов коров [69]. Это наблюдение было подтверждено анализом кондиционированных сред после культивирования эмбрионов человека [70]. F. Houghton c соавт. (2002) измерили поглощение и выделение аминокислот эмбрионами человека в культуральной среде, и отметили, что по уровню поглощения/выделения определенных аминокислот (Asn, Gly, Leu) можно судить о жизнеспособности эмбрионов [71]. Этот вывод был подтвержден в более поздней работе той же группы [72], а также было отмечено, что снижение средних уровней глицина и лейцина в среде культивирования и повышение количества аспарагина коррелируют с таким показателем, как живорождение. Различия в уровне потребления аминокислот между генетически нормальными и аномальными эмбрионами наблюдаются также на различных стадиях их культивирования[73].
Таким образом, определение количественного содержания аминокислот в кондиционированной среде потенциально можно использовать для выбора жизнеспособного эмбриона на перенос в программе ЭКО.
E. Seli и соавт. (2007) проанализировали образцы сред культивирования от 69 преимплантационных эмбрионов с известным результатом имплантации с помощью спектроскопии в ближней инфракрасной области (NIR) и рамановской спектроскопии (спектроскопия КР) [74]. По спектру КР можно с достаточной точностью установить природу химических связей как органических, так и неорганических. Каждое вещество имеет собственный, индивидуальный КР спектр, который является для него своего рода аналогом «отпечатка пальцев» [75].
Если определить диапазоны значений спектров КР от эмбрионов, которые привели к наступлению беременности, то, используя эти диапазоны, можно оценить потенциал дальнейшего развития каждого конкретного эмбриона.
Однако в настоящее время исследования метабо-ломного профиля эмбриона с целью выявления наиболее жизнеспособного не используются в клинической практике в связи с трудоемкостью технологии и необходимостью дорогостоящего оборудования, но неин-вазивность и высокочувствительность данного метода делает его перспективным.
Эпигеномика
Эпигеномика является одной из омиксных дисциплин и занимается изучением изменений (в том числе наследственных) в экспрессии генов, которые происходят без какого-либо изменения в последовательности ДНК [76]. Существуют различные типы эпигенетических модификаций: метилирование ДНК, модификации гистонов, а также посттрансляционные модификации (фосфорили-рование, убиквитинирование, нитрозилирование, сумои-лирование) в половых клетках [77, 78]. Эти изменения оказывают влияние на процессы развития, дифференци-ровки и функционирования клеток. Эпигенетические модификации способны к наследованию в ряде клеточных поколений [79, 80].
Установлено, что уровень экспрессии генов позвоночных зависит от степени метилирования специфических
участков цитозина внутри регуляторных областей генов и вокруг них [81]. Как правило, метилирование происходит по цитозиновым основаниям в составе СрЭ-динуклеотидов [82]. Процесс гаметогенеза и раннего преимплантационного развития — это два периода эпигенетических модификаций.
Выявлено, что семейство DAZ генов-регуляторов, играет ключевую роль в процессах гаметогенеза. С помощью метода флуоресцентной гибридизации на 3 хромосоме был обнаружен аутосомный гомолог гена DAZ — DAZL. При делеции генов DAZ наблюдается нарушение созревания сперматид. Инактивация гена dazl у мышей приводит к полному отсутствию гамет у особей обоего пола. В ходе работ по изучению уровня метилирования генов DAZL было показано, что у мужчин с нарушением морфологии сперматозоидов количество дефектов метилирования гена DAZL повышается.
Связь метилирования с важнейшими процессами развития у человека иллюстрируют два феномена: инактивация одной из Х-хромосом у женщин и дифференциальный импринтинг аутосом, полученных от отца и матери [80]. В связи с исследованиями, проведенными на животных, возникает вопрос: существует ли связь между нарушениями в процессе импринтинга и использованием вспомогательных репродуктивных технологий [82].
В процессе оогенеза в ооцитах, полученных из первичных фолликулов почти 50 % импринтированных материнских аллелей генов MEST, KCNQ1OT1 и PLAGL1 метилированы [83]. В ооцитах, полученных из преантральных и антральных фолликулов, метилированы уже все материнские аллели вышеперечисленных генов (ооциты получены без стимуляции суперовуляции].
При стимуляции суперовуляции в 37,5 % исследуемых ооцитов (GV/MI) импринтированный материнский аллель гена MEST остался неметилированным. У 10 % ооцитов (MII) ген KCNQ1OT1 был полностью неметилирован [84].
Нельзя утверждать, что изменения в процессе метилирования вышеперечисленных генов однозначно связаны со стимуляцией суперовуляции, возможно эти изменения связаны с диагнозом «бесплодие», поставленным пациенткам, у которых данные ооциты были получены.
Феномен геномного импринтинга и его нарушения (эпимутации импринтированных генов] играют важную роль в процессе эмбриогенеза и развитии наследственных болезней (синдром Ангельмана, синдром Беквита-Видемана) [85].
Одна из причин развития синдрома Беквита-Видемана — аномалии метилирования (уменьшение метилирования материнской аллели гена KCNQ1OT1 и усиление метилирования материнской аллели гена H19] или дефекты импринтинга гена SNRPN [86].
Синдром Ангельмана вызван аномалиями в 15 хромосоме (дефект импринтинга, а именно потеря метилирования материнской аллели гена SNRPN, делеции материнской аллели, точечные мутации, однородительская дисомия] [82].
Е.А. Саженова с соавт. (2010) исследовали уровень метилирования ряда импринтированных локусов генов (SNURF-SNRPN, KCNQ1OT1, CDKN1C, IGF2/ H19, PLAGL1, MEG3) у эмбрионов, погибших внутриутробно [87]. При анализе экстраэмбриональных тканей плода обнаружено гипометилирование регионов генов PLAGL1 и KCNQ1OT1 на материнских хромосомах. Также была установлена тканеспецифичность эпиму-таций: потеря импринтинга обнаруживалась либо в экстраэмбриональной мезодерме, либо в тканях цитотрофо-бласта хориона. Обособление данных тканей происходит в постимплантационный период, следовательно, эпимутации имеют соматическое происхождение [87].
Таким образом, нельзя однозначно определить природу аберрантных эпигенетических модификаций. Не исключено, что у супружеских пар с нарушением фертильности, имеется предрасположенность к эпигенетическим нарушениям, независимо от применения (или не применения] процедуры ЭКО [88]. Также возможно предположить, что нарушение метилирования может стать причиной бесплодия.
Модификация гистонов (ацетилирование, фосфори-лирование, метилирование, гликозилирование] также оказывает влияние на эпигенетическую регуляцию генов. В опытах на мышиных преимплантационных эмбрионах изучалось ацетилирование гистона H4, метилирование лизина 9 в гистоне H3 и фосфорилирование серина 10 в гистоне H3 в естественных условиях и в условиях in vitro [89]. В результате эксперимента не было обнаружено разницы в модификации гистонов между эмбрионами, развивающимися в условиях in vitro и in vivo.
Выводы
Изучение биомаркеров, влияющих на результативность программ ВРТ — одно из важных направлений современной репродуктивной медицины. С помощью омиксных дисциплин можно проанализировать все классы биологических соединений.
В настоящее время из всех омиксных технологий широкое применение в клинической практике получила только геномика. Материалом для преимплантационно-го генетического тестирования могут служить полярные тельца, единичные бластомеры, клетки трофобласта, бластоцисты. Исследование полярных телец применяется только в странах, где запрещен анализ эмбрионов (Австрия, Италия]. Однако анализ полярных телец дает представление лишь о нарушениях материнского происхождения. Часть этих нарушений может впоследствии подвергнуться самокоррекции. При биопсии бластомера высок риск мозаицизма, поэтому «золотым стандартом» в настоящее время является биопсия клеток трофобла-ста эмбриона на 5 сут. развития (риск мозаицизма снижается, но не сводится к нулю].
В июле 2017 г. появилась новость о том, что в США было произведено редактирование генома с помощью CRISPR/CAS9 [90]. Но это уже не первая попытка редактирования генома. Так в Китае в 2015 г. команда под руководством J. Huang работала над устранением мутации (в эмбрионах человека], вызывающей р-талассемию [91]. В Китае запрещены манипуляции с гаметами и эмбрионами с целью репродукции, но эти запреты не являются юридически обязательными [92]. В США же запрещено государственное финансирование таких программ, но прямого запрета на редактирование генома нет. Вполне вероятно, что первый «CRISPR» ребенок может родиться в одной из этих стран. Также это возможно в Японии или Индии, где нет законодательных ограничений на процедуры с гаметами.
В России исследования по применению омиксных технологий находятся на начальном этапе развития. Например, ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России (Москва] проводит изучение метаболомного и транскриптомного профилей клеток кумулюса с целью поиска молекулярно-генетических маркеров для оценки «качества» эмбрионов с высоким потенциалом к имплантации для повышения эффективности лечения бесплодия при помощи методов ВРТ. Но анализируя клетки кумулюса, мы получаем представление только о жизнеспособности ооцитов, не оценивая «отцовскую» составляющую будущего эмбриона и не учитывая возможные нарушения
в процессе индивидуального развития. На наш взгляд, перспективным является исследование протеома эмбриона в кондиционированной среде. Это неинвазивная методика, дающая представление непосредственно о перспективах развития самого эмбриона.
В связи с потенциально возможным внедрением омиксных технологий в репродуктивную медицину (за исключением геномики, которая широко применяется в клинической практике), возникает вопрос об этических аспектах использования данных методик. Что делать с ооцитами или эмбрионами, имеющими низкий потенциал развития по результатам анализа? Выбраковывать? Ответ однозначен: «Нет». Ооциты с низким потенциалом развития необходимо оплодотворять и в дальнейшем наблюдать за развитием эмбрионов, полученных из данных ооцитов.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Zegers-Hochschild F., Adamson G.D., de Mouzon J. et al. The International Committee for Monitoring Assisted Reproductive Technology and the World Health Organization Revised Glossary on ART Terminology. Fertility and Sterility 2009; 92: 1520-4.
2. Nimmi R. Review literature on assisted reproductive technology. International Journal of Current Advanced Research 2017; 6(2): 2155-6.
3. Calhaz-Jorge C., de Geyter C., Kupka M.S. et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2012: results generated from European registers by ESHRE [editorial]. Human Reproduction 2016; 31(8): 1638-52.
4. Gardner D.K., Meseguer M., Rubio C. et al. Diagnosis of human preimplantation embryo viability. Hum. Reprod. Update 2015; 21(6): 727-47.
5. Dominguez F., Meseguer M., Aparicio-Ruiz B. et al. New strategy for diagnosing embryo implantation potential by combining proteomics and time-lapse technologies. Fertility and Sterility 2015; 104(4): 908-14.
6. Lai H.H., Chuang T.H., Wong L.K. et al. Identification of mosaic and segmental aneuploidies by next-generation sequencing in preimplantation genetic screening can improve clinical outcomes compared to array-comparative genomic hybridization. Mol. Cytogenet. 2017; 10: 14.
7. Корсак В.С., Смирнова A.A., Шурыгина О.В. Регистр центров ВРТ в России. Отчет за 2015 г. Проблемы репродукции 2017; 23(5): 8-22.
8. Bromer J., Seli E. Assessment of embryo viability in assisted reproductive technologies: shortcomings of current approaches and the emerging role of metabolomics. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology 2008; 20: 234-41.
9. Silvestri E., Lombardi A., De Lange P. et al. Studies of complex biological systems with applications to molecular medicine: The need to integrate transcriptomic and proteomic approaches. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2011; 2011: 810242.
10. Картель Н.А. Генетика. В кн.: Энциклопедический словарь. 2011; Белорусская наука: 263-4.
11. Munne S., Alikani M., Tomkin G. et al. Embryo morphology, developmental rates, and maternal age are correlated with chromosome abnormalities. Fertility and Sterility 1995; 64: 382-91.
12. Fragouli E., Alfarawati S., Spath K. et al. The origin and impact of embryonic aneuploidy. Hum. Genet. 2013; 132: 1001-13.
13. Munne S., Chen S., Colls P. et al. Maternal age, morphology, development and chromosome abnormalities in over 6000 cleavage-stage embryos. Reproductive Biomedicine Online 2007; 14: 628-34.
14. Grondahl M.L., Christiansen S.L., Kesmodel U.S. et al. Effect of women's age on embryo morphology, cleavage rate and competence — A multicenter cohort study. PLoS One 2017; 12(4): e0172456.
15. Thornhill A., Geraedts J., Harper J.C. et al. ESHRE PGD Consortium «Best practice guidelines for PGD and PGS». Human Reproduction 2005; 20: 35-48.
16. Lalioti M. Can preimplantation genetic diagnosis overcome recurrent pregnancy failure? Current Opinion in Obstetrics and Gynecology 2008; 20: 199-204.
17. Корсак В.С., Балахонов А.В., Бичевая Н.К. Руководство по клинической эмбриологии. Москва: Издательство «МК»; 2011.
18. Griffin D., Wilton L., Handyside A. et al. Dual fluorescent in situ hybridisation for simultaneous detection of X and Y chromosome-specific probes for the sexing of human preimplnatation embryonic nuclei. Human Genetics 1992; 89: 18-22.
19. Munne S., Lee A., Rosenwaks Z. et al. Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplnatation embryos. Human Reproduction 1993; 8: 2185-91.
20. Staessen C., Platteau P., Assche V. et al. Comparison of blastocyst transfer with or without preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening in couples with advanced maternal age: a prospective randomized controlled trial. Human Reproduction 2004; 19: 2849-58.
21. Staessen C., Verpoest W., Donoso P. et al. Preimplantation genetic screening does not improve delivery rate in women under the age of 36 following single-embryo transfer. Human Reproduction 2008; 23: 2818-25.
Что же касается эмбрионов, то очевидно, что в первую очередь нужно переносить наиболее жизнеспособные эмбрионы. Остальные можно и нужно криоконсервировать.
Применение омиксных технологий в репродукции дает возможность разработать новые диагностические тесты для определения «перспективных» ооцитов и эмбрионов, что позволит значительно увеличить результативность программ ВРТ в клинической практике.
Благодарности
Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета. ААР был поддержан госзаданием 20.5175.2017/6.7 Минобрнауки РФ.
22. Mastenbroek S., Twisk M., van Echten-Arends J. et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic screening. The New England Journal of Medicine 2007; 357: 9-17.
23. Checa M., Alonso-Coello P., Sola I. et al. IVF/ICSI with or without preimplantation genetic screening for aneuploidy in couples without genetic disorders: a systematic review and meta-analysis. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 2009; 26: 273-83.
24. Practice Committee of the Society for Assisted Reproductive technology and the Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Preimplantation genetic testing: a Practice Committee opinion. Fertility and Sterility 2008; 90: 136-43.
25. Harper J., Coonen E., De Rycke M. et al. What next for preimplantation genetic screening? A position statement from the ESHRE PGD Consortium steering committee. Human Reproduction 2010; 25: 821-23.
26. Barbash-Hazan S., Frumkin T., Malcov M. et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility 2009; 92: 890-6.
27. Baart E.B., Martini E., Berg I. et al. Preimplantation genetic screening reveals a high incidence of aneuploidy and mosaicism in embryos from young women undergoing IVF. Hum. Reprod. 2006; 21(1): 223-33.
28. Los F.J., Opstal D., Berg C. The development of cytogenetically normal, abnormal and mosaic embryos: a theoretical model. Hum. Reprod. Update 2004; 10(1): 79-94.
29. Wilton L., Thornhill A., Traeger-Synodinos J. et al. The causes of misdiagnosis and adverse outcomes in PGD. Hum. Reprod. 2009; 24(5): 1221-8.
30. Wilton L. Preimplantation genetic diagnosis and chromosome analysis of blastomeres using comparative genomic hybridization. Human Reproduction Update 2005; 11: 33-41.
31. Миньженкова М.Е., Шилова Н.В., Макарова Ж.Г. и соавт. Эффективность различных методов диагностики хромосомных аномалий при репродуктивных потерях. Медицинская генетика 2014; 13(2): 25-30.
32. Kallionemi A., Kallionemi P., Sudar D. et al. Comparative genetic hybridisation for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science 1992; 258: 818-21.
33. Wells D., Alfarawati S., Fragoui E. Use of comprehensive chromosomal screening for embryo assessment: microarrays and CGH. Molecular Human Reproduction 2008; 12: 703-10.
34. Wells D., Sherlock J., Handyside A. et al. Detailed chromosomal and molecular genetic analysis of single cells by whole genome amplification and comparative genomic hybridisation. Nucleic Acids Research 1999; 27: 1214-8.
35. Voullaire L., Wilton L., Sargeant P. et al. Preimplantation aneuploidy screening using comparative genomic hybridisation or fluorescence in situ hybridisation of embryos from patients recurrent implantation failure. Fertility and Sterility 2003; 80: 860-8.
36. Миньженкова М.Е. Метафазная сравнительная геномная гибридизация в диагностике хромосомного дисбаланса. Автореферат дисс. кандид. Медицинских наук. Москва; 2014.
37. Shaffer L. Targeted genomic microarray analysis for identification of chromosome abnormalities in 1500 consecutive clinical cases. The Journal of Pediatrics 2006; 149(1): 98-102.
38. Shaffer L.G., Bui T.H. Molecular cytogenetic and rapid aneuploidy detection methods in prenatal diagnosis. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 2007; 145: 87-98.
39. Handyside A.H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility 2013; 100(3): 595-602.
40. Treff N.R., Fedick A., Tao X. et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertil. Steril. 2013; 99: 1377-84.
41. Fiorentino F., Bono S., Biricik A. et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blasto-cysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction 2014; 29(12): 2802-13.
42. Zozola S., Schiewe M.C., Blazek J. et al. Reanalysis of failed vitrified euploid blastocyst transfer cycles using next-generation sequencing. Fertility and Sterility 2015; 104(3): 279.
43. Latham K., Garrels J., Chang C. et al. Analysis of embryonic mouse development: construction of a high-resolution, two-dimensional gel protein database. Applied and theoretical electrophoresis 1992; 2: 163-70.
44. Navarrete S., Tonack S., Kirstein M. et al. Two insulin-responsive glucose transporter isoforms and the insulin receptor are developmen-tally expressed in rabbit preimplantation embryos. Reproduction 2004; 128: 503-16.
45. Wang Y., Puscheck E., Lewis J. et al. Increases in phosphorylation of SAPK/JNK and p38MAPK correlate negatively with mouse embryo development after culture in different media. Fertility and Sterility 2005; 1: 1144-54.
46. Gutstein H., Morris J., Annangudi S. et al. Microproteomics: analysis of protein diversity in small samples. Mass Spectrometry Reviews 2008; 27: 316-30.
47. Katz-Jaffe M., Gardner D., Schoolcraft W. Proteomic analysis of individual human embryos to identify novel biomarkers of development and viability. Fertility and Sterility 2006; 85(1): 101-7.
48. Dominguez F., Gadea B., Esteban F. et al. Comparative protein-profile analysis of implanted versus non-implanted human blastocysts. Human Reproduction 2008; 23(9): 1993-2000.
49. Dominguez F., Meseguer M., Aparicio-Ruiz B. et al. New strategy for diagnosing embryo implantation potential by combining proteomics and time-lapse technologies. Fertility and Sterility 2015; 104(4): 908-14.
50. O'Neill C. The role of PAF in embryo physiology. Human Reproduction Update 2005; 11: 215-28.
51. Cervero A., Horcajadas J., Dominguez F. et al. Leptin system in embryo development and implantation: a protein in search of a function. Reproductive Biomedicine Online 2005; 10: 217-23.
52. Mutz K.O., Heilkenbrinker A., Lonne M. et al. Transcriptome analysis using next-generation sequencing. Current opinion in biotechnology 2013; 24(1): 22-30.
53. Куцын К.А. Эпигенетика эмбрионального развития человека. Ростов-на-Дону: Издательство Южного федерального университета; 2013.
54. Biase F., Everts R., Oliveira R. et al. Messenger RNAs in MII oocytes correlate with successful embryo development to the blastocyst stage. Zygote 2012; 10: 1-11.
55. Ouandaogo Z., Frydman N., Hesters L. et al. Differences in transcrip-tomic profiles of human cumulus cells isolated from oocytes at GV, MI and MII stages after in vivo and in vitro oocyte maturation. Human Reproduction 2012; 27: 2438-47.
56. McKenzie L., Pangas S., Carson S. et al. Human cumulus granulosa cell gene expression: a predictor of fertilization and embryo selection in women undergoing IVF. Human Reproduction 2004; 19: 2869-74.
57. Assou S., Haouzi D., De Vos J. et al. Human cumulus cells as biomarkers for embryo and pregnancy outcomes. Molecular Human Reproduction 2010; 16: 531-8.
58. Wood J., Dumesic D., Abbott D. et al. 3rd Molecular abnormalities in oocytes from women with polycystic ovary syndrome revealed by microar-ray analysis. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2007; 92: 705-13.
59. Egea R.R., Puchalt N.G., Escriva M.M. et al. OMICS: Current and future perspectives in reproductive medicine and technology. J. Hum. Reprod. Sci. 2014; 7(2): 73-92.
60. Zhang X., Jafari N., Barnes R. et al. Studies of gene expression in human cumulus cells indicate pentraxin 3 as a possible marker for oocyte quality. Fertility and Sterility 2005; 83 Suppl 1: 1169-79.
61. Inan M., Al-Hassan S., Ozand P. et al. Transcriptional profiling of granulosa cells from a patient with recurrent empty follicle syndrome. Reproductive Biomedicine Online 2006; 13: 481-91.
62. Assou S., Haouzi D., Mahmoud K. et al. A non-invasive test for assessing embryo potential by gene expression profiles of human cumulus cells: a proof of concept study. Molecular Human Reproduction 2008; 14: 711-9.
63. Brison D., Hollywood K., Arnesen R. et al. Predicting human embryo viability: The road to non-invasive analysis of the secretome using metabolic footprinting. Reproductive Biomedicine Online 2007; 15: 296-302.
64. Singh R., Sinclair K. Metabolomics: approaches to assessing oocyte and embryo quality. Theriogenology 2007; 68 Suppl 1: 56-62.
65. Nagy Z., Sakkas D., Behr B. Symposium: Innovative techniques in human embryo viability assessment. Non-invasive assessment of embryo viability by metabolomic profiling of culture media. Reproductive Biomedicine Online 2008; 17: 502-7.
66. Borges E., Braga D., Setti A.S. et al. Non-invasive prediction of blastocyst implantation, ongoing pregnancy and live birth, by mass spectrometry lipid fingerprinting. JBRA Assist. Reprod. 2016; 20(4): 227-31.
67. Rubakhin S.S., Elena V., Romanova E.V. et al. Profiling Metabolites and Peptides in Single Cells. Nat. Methods 2011; 8 Suppl 4: 20-9.
68. Botros L., Sakkas D., Seli E. Metabolomics and its application for non-invasive embryo assessment in IVF. Molecular Human Reproduction 2008; 14(12): 679-90.
69. Renard J., Philippon A., Menezo Y. In vitro uptake of glucose by bovine blastocysts. Journal of Reproduction and Fertility 1980; 58(1): 161-4.
70. Van den Bergh M., Devreker F., Emilian S. et al. Glycolytic activity: a possible tool for human blastocyst selection. Reproductive Biomedicine Online 2001; 3 Suppl 1: 8.
71. Houghton F., Hawkhead J., Humpherson P. et al. Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo developmental capacity. Human Reproduction 2002; 17(4): 999-1005.
72. Brison D., Houghton F., Falconer D. et al. Identification of viable embryos in IVF by non-invasive measurement of amino acid turnover. Human Reproduction 2004; 19(10): 2319-24.
73. Picton H., Elder K., Houghton F. et al. Association between amino acid turnover and chromosome aneuploidy during human preimplantation embryo development in vitro. Molecular Human Reproduction 2010; 16(8): 557-69.
74. Seli E., Sakkas D., Scott R. et al. Noninvasive metabolomic profiling of embryo culture media using Raman and near-infrared spectroscopy correlates with reproductive potential of embryos in women undergoing in vitro fertilization. Fertility and Sterility 2007; 88: 1350-7.
75. Li D., Zhai W., Li Y. et al. Recent progress in surface enhanced Raman spectroscopy for the detection of environmental pollutants. Microchi-mica Acta 2014; 181: 23-43.
76. Waddington C. The epigenotype. International Journal of Epidemiology 2012; 41: 10-3.
77. Singh K., Jaiswal D. Human male infertility: a complex multifactorial phenotype. Reproductive Sciences 2011; 18: 418-25.
78. Zama A., Uzumcu M. Epigenetic effects of endocrine-disrupting chemicals on female reproduction: an ovarian perspective. Front. Neuroen-docrinol. 2010; 31: 420-39.
79. Iliadou A., Janson P., Cnattingius S. Epigenetics and assisted reproductive technology. Journal of Internal Medicine 2011; 270: 414-20.
80. van Montfoort A., Hanssen L., Sutter P. et al. Assisted reproduction treatment and epigenetic inheritance. Human Reproduction Update 2012; 18: 171-97.
81. Berger S. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature 2007; 447: 407-12.
82. Odom L., Segars J. Imprinting disorders and assisted reproductive technology. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity 2010; 17: 517-22.
83. Sato A., Otsu E., Negishi H. et al. Aberrant DNA methylation of imprinted loci in superovulated oocytes. Human Reproduction 2007; 22(1): 26-35.
84. Montfoort A.P., Hanssen L.L., de Sutter P. et al. Assisted reproduction treatment and epigenetic inheritance. Hum. Reprod. Update 2012; 18(2): 171-97.
85. Пузырев В.П. Медицинская патогенетика. Вавиловский журнал генетики и селекции 2014; 18(1): 7-21.
86. Bunkar N., Pathak N., Lohiya N.K. et al. Epigenetics: A key paradigm in reproductive health. Clin. Exp. Reprod. Med. 2016; 43(2): 59-81.
87. Саженова Е.А., Лебедев И.Н. Эпигенетические модификации им-принтированных генов как фактор риска вспомогательных репродуктивных технологий. Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина 2010; 8(4): 46-51.
88. Лебедев И.Н. Эпигенетические аспекты нарушений эмбрионального развития человека. Экологическая генетика 2011; 9(3): 15-9.
89. Huang J.C., Lei Z.L., Shi L.H. et al. Comparison of histone modifications in in vivo and in vitro fertilization mouse embryos. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007; 354(1): 77-83.
90. Ma H., Marti-Gutierrez N., Park S.W. et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos. Nature 2017; 548: 413-9.
91. Liang P., Xu Y., Zhang X. et al. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell 2015; 6(5): 363-72.
92. Ledford H. Where in the world could the first CRISPR baby be born? Nature 2015; 526: 310-1.
Поступила: 04.072017
