CC BY
76
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 4 - P. 222-226
УДК: 618.177:616.697-08:611.013:575-07
НОВЫЕ МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ В КУЛЬТИВИРОВАНИИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ
ДИАГНОСТИКЕ ЭМБРИОНОВ ЧЕЛОВЕКА
О.В. ШУРЫГИНА, А.М. ЩЕЛОЧКОВ, Н.В. САРАЕВА, О.В. КУЛАКОВА, С.З. ЮЛДАШЕВА
ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России Клиника «Мать и дитя - ИДК, Самара», ул. Чапаевская, д. 89, г. Самара, 443099, Россия,
e-mail: oks-shurygina@yandex.ru
Аннотация. Культивирование эмбрионов in vitro является неотъемлемым этапом программ вспомогательных репродуктивных технологий. Применение современных высокотехнологичных методик отбора гамет и эмбрионов позволяет выбрать эмбрион, имеющий наиболее высокие шансы на имплантацию. Целью вспомогательных репродуктивных технологий является рождение одного здорового ребенка. В связи с этим задачами клинической эмбриологии является создание, внедрение и использование в практической медицине методик, позволяющих проведение скринигов, позволяющих определить наиболее компетентные для рождения здорового ребенка эмбриона. Применение новой уникальной технологии непрерывного видеонаблюдения TimeLapse позволяет оценить индивидуальные особенности морфодинамики и морфокинетики каждого развивающегося эмбриона. Благодаря непрерывной микроскопии in vitro удается зафиксировать основные события раннего клеточного дробления, формирование бластоцист. Другой вид скрининга, который в последние годы приобретает все более широкое применение в медицине - это генетический скрининг на анеуплои-дии эмбрионов. По данным разных авторов, уровень анеуплодий в развивающихся эмбрионах составляет до 70%. Перенос генетически «здорового» эмбриона в полость матки позволяет снизить время ожидания рождения здорового ребенка и направлен на предотвращение рождения детей с генетическими заболеваниями.
Ключевые слова: эмбрион, человек, культивирование, генетический скрининг.
Введение. Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) Assisted reproductive technology (ART) - давно и прочно вошедшие в медицинскую практику методы преодоления супружеского бесплодия. В большинстве случаев, желаемый результат - благополучно завершенную беременность и рождение здорового ребенка - удается достичь. Однако, даже самые современные методики не позволяют преодолеть порог эффективности 50-60% частоты наступления беременности в среднем после проведенной программы ВРТ. С учетом того, что к помощи ВРТ пациенты обращаются после длительных попыток самостоятельного преодоления бесплодия, либо неспециализированного лечения, реальные шансы получения беременности и рождения больного ребенка еще ниже. В такой ситуации возникает потребность в увеличении эффективности методов ВРТ. С учетом современного развития диагностических методов в области молекулярной генетики и новых технологий культивирования эмбрионов становится возможным их совместный вклад в повышение эффективности ВРТ и повышение уровня удовлетворенности пациентов.
Актуальность исследования обусловлена рядом фактов. Во-первых, отмечается устойчивая тенденция к ухудшению репродуктивного здоровья населения мира, в целом, и России, в частности, отражающаяся в увеличении доли бесплодных супружеских пар, снижении средних показателей оценки фертильности у мужчин и женщин. На сегодняшний день доля бесплодных пар (т.е. пар не достигших беременности в течение года) в России превышает 15%, и ситуация продолжает ухудшаться [2,5]. Данное обстоятельство увеличивает количество пациентов, обращающихся за лечением методами ВРТ и повышает требования к эффективности используемых диагностических и лечебных методик. Другими, не менее важными факторами, являются такие осложнения, как врожденные пороки развития плода и новорожденного, спонтанные прерывания беременности и привычное невынашивание. Согласно докладу ВОЗ, уровень врожденных пороков развития плода и патологии новорожденного составляет около 5% [3]. Значительную долю в этой группе составляют заболевания генетической природы: хромосомные, моногенные и
мультифакторные. При этом, наиболее инва-лидизирующими и неблагоприятно влияющими на прогноз жизни новорожденного преимущественно считаются хромосомные болезни. Наряду с применяемыми мерами профилактики врожденных пороков развития и патологии плода и новорожденного наследственной (генетической) природы на преконцепционном этапе, требуются дополнительные меры профилактики при выполнении методик ВРТ. Также следует учитывать, что специфика применения технологии ВРТ (оплодотворение и культивирование эмбрионов in vitro и дальнейшие профилактические мероприятия по предотвращению прерывания беременности) способствует повышению риска рождения ребенка с наследственной (генетической) патологией по сравнению с популяционной частотой, т.к. терапевтические мероприятия препятствуют естественным механизмам прерывания прогностически неблагоприятной беременности. Современные методики поддержки первых этапов беременности позволяют предотвратить в большинстве случаев реализацию такого «защитного природного механизма» [9,11].
В последние годы многими исследованиями отмечается увеличение среднего возраста женщин, планирующих беременность и увеличение доли женщин, имеющих повышенный риск врожденных и наследственных заболеваний плода, обусловленный возрастным фактором. За последние 20 лет возраст рождения первого ребенка в семье увеличился с 20-25 до 25-30 лет, кроме того, доминирует социальная модель - один, или два ребенка в семье. Данное обстоятельство повышает вероятность неудач ВРТ вследствие снижения овариального резерва и увеличение риска патологии беременности, врожденной патологии плода и новорожденного, а также сокращение периода возможности лечения методами ВРТ до достижения возраста естественной менопаузы [4]. Большое значение придается результативности лечения методиками ВРТ. Поскольку в последнее время отмечается увеличение количества обращений женщин в клиники лечения бесплодия с пониженным овариальным резервом, снижается количество получаемых эмбрионов, вследствие чего повышается риск неэффективности программы ВРТ, снижается количество возможных попыток лечения, и, одновременно с этим, повышается значимость и ценность каждой попытки. В таких условиях становится
высокой «цена» неудачи, связанная с генетическими нарушениями эмбриона, препятствующими нормальному эмбриогенезу, имплантации эмбриона в полость матки, правильному развитию плода. Немаловажным можно считать и значительное увеличение стоимости лечения таких пациентов, например, связанное с напрасной криоконсервацией эмбрионов с генетической патологией и т.п. процедурами, сделанными без учета оценки «генетического здоровья» эмбриона и его шансов на ожидаемый пациентом результат [6].
В настоящее время все большее значение отдается и этическим аспектам лечения бесплодия методами ВРТ. Один из них - пересадка пациентке эмбриона с генетической патологией в высокой степени вероятности приведет к прерыванию беременности, спонтанному, или медикаментозному (если серьезная патология плода будет обнаружена пренатально), что вызывает психологические проблемы и сложности у пациентки и может значительно отсрочить или вовсе прекратить ее планы по репродуктивной реализации. Еще более сложным с этической точки зрения является рождение ребенка с генетической патологией - как для родителей, так и для самого ребенка.
Все эти факторы безусловно ставят развитие современных технологий эмбриологического этапа программ ВРТ на первое место. Правильно подобранные и используемые технологии получения, диагностики и культивирования эмбрионов обеспечивают в целом успех в работе центров вспомогательной репродукции.
Среди методов предимплантационной диагностики необходимо различать диагностический подход (PGD), где задачей диагностики является селекция эмбриона по вероятному заболеванию, носительство которого, или вероятность которого у потомства - очевидна, и скри-нинговое исследование (PGS), когда задача исследования - профилактика наиболее часто встречаемых врожденных хромосомных синдромов [7,8,10]. Соответственно, если в методике PGD исследования проводятся преимущественно технологией PCR, то PGS проводится в настоящее время либо a-CGH, либо NGS, причем в последнее время высокопроизводительное секвенирование все более востребовано [1,12,13].
Цель исследования - выяснить преимущества современных методик предимпланта-ционного генетического анализа (скрининга) и
культивирования с постоянным видеонаблюдением (TimeLapse).
Материалы и методы исследования. За
2013-2015 гг. было проведено 743 цикла с применением технологии TimeLapse. Система видеонаблюдения за развитием эмбрионов представлена 6 микроскопами PrimoVision (Vitrolife, Sweden). Микроскопы установлены в инкубатор Heracell-240 (Germany). Их настройка и использование осуществлялось в соответствии с требованиями завода-производителя. Культивирование эмбрионов проводилось в специальных чашках WOW (Vitrolife, Sweden) в универсальной среде Continius Single Culture (Irvine Scientific, USA) с 1 до 5-6 дня культивирования. Специальных критериев отбора пациентов для культивирования с использованием данной системы не применялось. Система имеет прямой on-line доступ.
Для оценки развития эмбрионов с 1 до 56 суток культивирования in vitro учитывалось время первых трех дроблений, временной диапазон между первым и вторым дроблением, а также характер дробления (морфокинетика). Все вышеперечисленные критерии служили предикторами отбора эмбриона/эмбрионов на перенос. Критериями элективного переноса одного эмбриона на 5-е сутки (5eSET) служили: наличие более 2-х эмбрионов отличного качества, возраст пациентки до 35 лет, отсутствие предыдущих попыток ЭКО в анамнезе. Критериями селективного переноса одного эмбриона (5SET) служили: наличие рубца на матке после предыдущих хирургических вмешательств и др. клинические ситуации.
За 2015-2017 гг. проведено 57 циклов с преимплантационной генетической диагностикой. Биопсия проводилась пациентам старшей возрастной группы, с многочисленными неудачными попытками ЭКО в анамнезе, патологией кариотипа. На 5-6 день оценивалась возможность выполнения исследования PGS в зависимости от качества эмбрионов. Методика предимплантационного генетического скрининга (PGS) была основана на применении высокопроизводительного секвенирования нового поколения (NGS) [13]. Анализ проводится на секвенаторе Illumina MySeq. Материал для исследования - клетки трофэктодермы, полученные на 5-6 день культивирования эмбрионов, доставлялись в лабораторию молекулярной генетики в оптимальных условиях, обеспечи-
вающих стабилизацию клеточного материала. В результате исследования оценивался геном эмбриона по всем 46 хромосомам. В отличие от a-CGH методика NGS обладает более высокой разрешающей способностью и возможностью выявления хромосомного мозаицизма, что позволяет выявить хромосомный дисбаланс с большей вероятностью [7,12].
Результаты и их обсуждение. В процессе развития эмбрионов весьма важными неблагоприятными морфодинамическими событиями являются, например, деление зиготы на 3 бла-стомера (такие эмбрионы при проведении генетической диагностики демонстрируют до 99,9% анеуплоидии), реверсивное дробление. Невозможность учитывать эти события при стандартной морфологической оценке существенно повышает качество селекции эмбрионов в условиях культивирования в системе непрерывного видеонаблюдения, а также общий выход эмбрионов отличного и хорошего качества. В результате проведенного исследования показатели частоты наступления клинической беременности в группе 5eSET и 5SET не показали статистически значимых различий; при сравнении показателей без учета вида переноса в I группе ЧНБ выше, чем во II группе (61,28% и 53,03%). Эмбрионы отличного качества составили 77% на 5-е сутки развития при культивировании с использованием непрерывного видеонаблюдения и 65,2% - при стандартных условиях культивирования.
Применение метода NGS позволяет перенести в полость матки генетически «здоровый эмбрион», но является инвазивной процедурой для эмбриона, которая может иметь риск остановки эмбриона в развитии. Кроме того, приблизительно 25% биопсий в результате последующего секвенирования не обнаруживают эмбрионов, пригодных к переносу. До 70% биопсированных эмбрионов носят анэуплоидный статус. В циклах, в которых был проведен перенос одного генетически «здорового» эмбриона, частота наступления беременности составила, по данным проведенного исследования - 53%.
Выводы. Таким образом, современные технологии эмбриологического этапа программ ВРТ позволяют выбрать наиболее компетентный к имплантации эмбрион, используя методики неинвазивного (time-lapse технологии) и инвазивного генетического скрининга (PGS).
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 4 - P. 222-226
NEW METHODOLOGICAL APPROACHES IN CULTIVATION AND MOLECULAR DIAGNOSTICS OF
HUMAN EMBRYONS
O.V. SHURYGINA, A.M. SCHELOCHKOV, N.V. SARAEVA, S.Z. YULDASHEVA, O.V. KULAKOVA
Samara State Medical University, Clinic «Mother and Child - IDK, Samara», Chapaevskaya Str., 89, Samara, 443099, Russia, e-mail: oks-shurygina@yandex.ru
Abstract. Cultivation of embryos in vitro is an integral part of assisted reproductive technologies (ART) programs. The use of modern high-tech techniques for selecting gametes and embryos allows one to choose an embryo that has the highest chances of implantation. The ART aimed to the birth of one healthy child. In this regard, the tasks of clinical embryology are the creation, implementation and use in practical medicine of techniques that allow the screening to determine the most competent embryo for the birth of a healthy child. The use of the new unique technology of continuous video surveillance allows TimeLapse to evaluate the individual features of the morphodynamics and morphokinetics of each developing embryo. The continuous in vitro microscopy records the main events of early cell crushing, the formation of blastocysts. Another type of screening, which in recent years has become more widely used in medicine - is genetic screening for aneuploidy of embryos. According to different authors, the level of aneuploidy in developing embryos is up to 70%. The transfer of a genetically "healthy" embryo to the uterine cavity can reduce the waiting time for the birth of a healthy child and is aimed at preventing the birth of children with genetic diseases.
Key words: embryos, human, cultivation, genetic screening.
Литература
References
1. Глинкина Ж.И., Курцер М.А., Будник И.В. Исследование хромосомной патологии в клетках неразвивающегося хориона методом высокопроизводительного секвенирования // Доктор.Ру.
2017. №7.
1. Glinkina ZHI, Kurcer MA, Budnik IV. Issledovanie hromosomnoj patologii v kletkah nerazvivayushche-gosya horiona metodom vysokoproizvoditel'nogo sekvenirovaniya [The study of chromosomal abnormalities in the developing cells of the chorion by the method of high-throughput sequencing]. Doktor.Ru. 2017;7. Russian.
2. Джамалудинова А.Ф., Гонян М.М. Репродуктивное здоровье населения России // Молодой ученый. 2017. №14.
2. Dzhamaludinova AF, Gonyan MM. Reproduktiv-noe zdorov'e naseleniya Rossii [Reproductive health of the Russian population]. Molodoj uchenyj. 2017;14. Russian.
3. Доклад Секретариата ВОЗ. Борьба с генетическими заболеваниями. Сессия 116, 2005.
3. Report of the who Secretariat. Fight against ge netic diseases. Session 116; 2005. Russian.
4. Кузнецов В.Н., Рыбаковский Л.Л. Стратегия демографического развития России. М.: ЦСП,
4. Kuznecov VN, Rybakovskij LL. Strategiya demo-graficheskogo razvitiya Rossii [Russia's demographic development strategy]. Moscow: CSP; 2005. Russian.
2005.
5. Леваков С.А., Павлова С.А., Бугрова Т.И., Кедрова А.Г. Современный взгляд на бесплодный брак // Клиническая практика. 2010. №3. С. 92-97.
5. Levakov SA, Pavlova SA, Bugrova TI, Kedrova AG. Sovremennyj vzglyad na besplodnyj brak [The modern view of infertile marriage]. Klinicheskaya praktika. 2010;3; 92-7. Russian.
6. Русанова Н.Е. Репродуктивные возможности демографического развития. М.: «Спутник плюс»,
2008.
6. Rusanova NE. Reproduktivnye vozmozhnosti demograficheskogo razvitiya [Reproductive opportunities of demographic development]. Moscow: «Sputnik plyus»; 2008. Russian.
7. Fiorentino F., Biricik A., Bono S., Spizzichino L., Cotroneo E., Cottone G., Kokocinski F., Michel C.E.
7. Fiorentino F, Biricik A, Bono S, Spizzichino L, Cotroneo E, Cottone G, Kokocinski F, Michel CE. De-
Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertil. Steril., 2014.
velopment and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertil. Steril; 2014.
8. Handyside A.H. Preimplantation genetic diagnosis after 20 years. Reprod Biomed Online, 2010.
8. Handyside AH. Preimplantation genetic diagnosis after 20 years. Reprod Biomed Online; 2010.
9. Hansen M., Kurinczuk J.J., Bower C., Webb S. The risk of major birth defects after intracytoplasmic sperm injection and in vitro fertilization // N.Engl.J.Med. 2002.
9. Hansen M, Kurinczuk JJ, Bower C, Webb S. The risk of major birth defects after intracytoplasmic sperm injection and in vitro fertilization. N.Engl.J.Med. 2002.
10. Harper J.C., SenGupta S.B. Preimplantation genetic diagnosis: State of the ART 2011. Hum Genet, 2012.
10. Harper JC, SenGupta SB. Preimplantation genetic diagnosis: State of the ART 2011. Hum Genet; 2012.
11. Liberman R.F., Getz K.D., Heinke D., Luke B., Stern J.E., Declerq E.R., Chen X., Lin A.E., Anderka M. Assisted Reproductive Technology and Birth Defects: Effects of Subfertility and Multiple Births. Birth Defects Res, 2017.
11. Liberman RF, Getz KD, Heinke D, Luke B, Stern JE, Declerq ER, Chen X, Lin AE, Anderka M. Assisted Reproductive Technology and Birth Defects: Effects of Subfertility and Multiple Births. Birth Defects Res; 2017.
12. PGDIS position statement on chromosome mo-saicism and preimplantation aneuploidy testing at the blastocyst stage. PGDIS Newsletter. July 19. 2016.
12. PGDIS position statement on chromosome mo-saicism and preimplantation aneuploidy testing at the blastocyst stage. PGDIS Newsletter. July 19. 2016.
13. Sahoo T., Dzidic N., Strecker M.N., Commander S., Travis M.K., Doherty C., Tyson R.W., Mendoza A.E., Stephenson M., Dise C.A., Benito C.W., Ziadie M.S., Hovanes K. Comprehensive genetic analysis of pregnancy loss by chromosomal microarrays: outcomes, benefits, and challenges. Genet Med, 2017.
13. Sahoo T, Dzidic N, Strecker MN, Commander S, Travis MK, Doherty C, Tyson RW, Mendoza AE, Ste-phenson M, Dise CA, Benito CW, Ziadie MS, Ho-vanes K. Comprehensive genetic analysis of pregnancy loss by chromosomal microarrays: outcomes, benefits, and challenges. Genet Med; 2017.
Библиографическая ссылка:
Шурыгина О.В., Щелочков А.М., Сараева Н.В., Кулакова О.В., Юлдашева С.З. Новые методологические подходы в культивировании и молекулярной диагностике эмбрионов человека // Вестник новых медицинских технологий. 2018. №4. С. 222-226.
