CC BY
5УДК 577.2
ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ АКТИВНЫХ ЭНХАНСЕРОВ В РАЗВИТИИ МОЗОЛИСТОГО ТЕЛА
DOI
Целис Суэскун Х. К.1, Тарабыкин В. С.1,2
1 Нижегородский нейронаучный центр, лаборатория генетики и развития мозга, Нижний Новгород, Россия;
2 Институт клеточной биологии и нейробиологии клиники Шарите, Берлин, Германия
e-mail: juancamilo1297@gmail.com
Аннотация. Путем сравнения уровня активности энхансеров некоторых генов, отвечающих за процессы клеточной миграции и организации новой коры головного мозга, у плацентарных и сумчатых млекопитающих, смогли выявить три гена-кандидата, чьи экспрессии может отвечать за развитие мозолистого тела. Планируется исследовать роль этих энхансеров путем их полной делеции с помощью CRISPR/Cas9 системы.
Ключевые слова: Мозолистое тело, энхансер, CRISPR/Cas9, in utero электропорация
Ключевым эволюционным нововведением в развитии мозга млекопитающих стало появление мозолистого тела. Мозолистое тело представляет собой структуру головного мозга, встречающуюся исключительно у плацентарных (Eutheria) млекопитающих, которая соединяет левое и правое полушария головного мозга. Содержащая многочисленные внутри- и межполушарные миелинизи-рованные отростки аксонов, она считается самой крупной структурой белого вещества в головном мозге. В отличие от организации мозга у плацентарных, пожалуй, наиболее заметной особенностью неокортекса у всех сумчатых (Marsupialia) и однопроходных (Monotremata) млекопитающих является отсутствие мозолистого тела. Вместо этого, главная форма межполушарного сообщения осуществляется через увеличенную переднюю спайку, которая, как было показано, функционально эквивалентна мозолистому телу у плацентарных млекопитающих. Такая эволюционная адаптация, вероятно, включала перенаправление аксонов неокортекса во время развития плацентарного мозга, событие, которое могло регу-
лироваться изменениями уровня экспрессии определенных генов, ответственных за контроль над процессами роста аксонов и миграцией клеток в неокортексе.
С помощью UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/) мы идентифицировали ряд энхансеров для некоторых белок-коди-рующих генов, паттерны экспрессии которых различаются в мозгах плацентарных и неплацентарных (сумчатых) млекопитающих, путем сравнения уровней ацетилирования гистона H3 на лизине 27 (H3K27ac), рассматриваемого как эпигенетическая метка для активных энхансеров генов, по всему геному домового опоссума (Monodelphis domestica) и домовой мыши (Mus musculus).
После выявления генов с разными уровнями энхансерной активности у обоих видов млекопитающих был проведен скрининг для исключения генов, кодирующих белки, функции которых не связаны с развитием головного мозга, клеточной адгезией, миграцией клеток и структурной организацией новой коры головного мозга. Кроме того, уровни экспрессии мРНК для этих генов были проанализированы с использованием GenePaint (https://gp3.mpg. de/) — цифровой атлас паттернов экспрессии генов на эмбрионах мышей, определенных с помощью нерадиоактивной гибридизации in situ на серийных срезах тканей. Гены с экспрессией, не специфичной для головного мозга, или с низким уровнем экспрессии в головном мозге, особенно в коре головного мозга, из которой происходит большинство волокон образующих мозолистое тело, также были отброшены.
Таким образом, мы определили список белков-кандидатов, которые могут быть ответственны за развитие мозолистого тела и, возможно, сыграли значительную роль в эволюции мозга плацентарных млекопитающих. Этими белками являются Tbr1, неправильная экспрессия которого может повлиять на изменения в морфологии мозолистого тела; Nrp1 и Efnb1, которые играют роль в клеточной адгезии и участвуют в развитии или поддержании нервной системы и росте аксонов мозолистого тела.
Следующим шагом является объединение системы CRISPR/ Cas9 с in utero электропорацией для полной делеции активных энхансеров для генов Tbr1, Nrp1 и Efnb1 в развивающихся клетках не-окортекса у эмбрионов мышей. Для этого будет выполнен двойной разрыв с использованием двух систем CRISPR/Cas9, управляемых РНК, клонированных в плазмиды pX330, каждая из которых соответствует 5'- и 3'-консенсусу энхансера каждого гена, доставленных
в эмбриональные клетки неокортекса путем электропорации эмбрионов мышей. Влияние делеции активных энхансеров генов Tbr1, Nrp1 и Efnb1 на развитие мозолистого тела у эмбрионов мышей будет проанализировано с использованием методов иммуногистохи-мии и конфокальной микроскопии. Если наша гипотеза верна, высокие уровни H3K27ac у энхансеров генов Tbr1, Nrp1 и Efnb1 приводят к повышенной экспрессии этих генов по сравнению с таковой у неплацентарных млекопитающих, что может играть важную роль в определении направления роста аксонов у клеток неокортекса и развитии мозолистого тела.
Публикация поддержана грантом РНФ № 22-14-00232.
POSSIBLE ROLE OF ACTIVE ENHANCERS IN CORPUS CALLOSUM DEVELOPMENT
Celis Suescun J. C.1, Tarabykin V. S.12
1 Nizhny Novgorod Neuroscience Center, Laboratory of Genetics and Brain Development, Nizhny Novgorod, Russia;
2 Institute of Cell Biology and Neurobiology, Charite Hospital, Berlin, Germany e-mail: juancamilo1297@gmail.com
Abstract. By comparing the level of activity of enhancers of some genes responsible for the processes of cell migration and organization of the neocortex in placental and marsupial mammals, we were able to identify three candidate genes whose expression may be responsible for the development of the corpus callosum. It is planned to investigate the role of these enhancers by their complete deletion using the CRISPR/ Cas9 system.
Key words: corpus callosum, enhancer, CRISPR/Cas9, in utero electroporation
A key evolutionary innovation in mammal brain development was the origin of the corpus callosum. The corpus callosum is a brain structure found exclusively in eutherian (placental) mammals that connects the left and right cerebral hemispheres. Containing numerous intra-and interhemispheric myelinated axonal projections it is considered to be the largest white matter structure in the brain. Contrary to eutherian brain organization, perhaps the most notable feature of the neocortex in all
marsupial and monotreme mammals is the lack of a corpus callosum. Instead, the primary form of the interhemispheric communication is carried out through an enlarged anterior commissure, which has been shown to be functionally equivalent to the corpus callosum in placental mammals. Such evolutionary adaptation likely involved rerouting neocortical axons during eutherian brain development, an event that might have been regulated by changes in the level of expression of certain genes, responsible for mediating axon growth and cell migration processes in the neocortex.
With the help of UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc. edu/), we identified a series of enhancers for protein coding genes, whose expression patterns may differ in the brains of eutherians and non-eutherians (marsupial) mammals, by comparing the acetylation levels of histone H3 on lysine 27 (H3K27ac), considered as the epigenetic mark for active gene enhancers, throughout the genome of the gray short-tailed opossum (Monodelphis domestica) and the house mouse (Mus musculus).
After identifying genes with different levels of enhancer activity in both species of mammals, a screening was conducted to exclude genes that code for proteins, whose functions are not related to brain development, cell adhesion, cell migration and structural organization of the cerebral cortex. Also, the levels of mRNA expression for these genes were analyzed with the use of GenePaint (https://gp3.mpg.de/), a digital atlas of gene expression patterns on mouse embryos, determined by non-radioactive in situ hybridization on serial tissue sections. Genes with non-brain specific expression or low expression levels in the brain, specifically in the cerebral cortex were the majority of callosal fibers originate from, were also discarded.
Thus, we have identified a list of protein candidates that may be responsible for the development of the corpus callosum, and might have played a significant role in the evolution of eutherian mammals' brains. These proteins are Tbrl, whose misexpression may influence changes in the morphology of the corpus callosum; Nrpl and Efnbl, which play a role in cell adhesion and function in the development or maintenance of the nervous system and corpus callosum axon growth.
The next step is to combine a CRISPR/Cas9 system with in utero electroporation for the total deletion of the active enhancers of the Tbrl, Nrpl and Efnbl genes in developing neocortical cells in embryonic mice. For this, a double nicking will be performed using two RNA-guided CRISPR/Cas9 systems cloned into pX330 plasmids, each corresponding to
the 5' and 3' consensus of each gene's enhancer, delivered into embryonic neocortical cells by electroporation of mice embryos. The effects of the deletion of the active enhancers of the Tbr1, Nrp1 and Efnb1 genes in the development of the corpus callosum in embryonic mice, will be analyzed with the use of immunohistochemistry and confocal microscopy. If our hypothesis is true, the high H3K27ac levels of the Tbr1, Nrp1 and Efnb1 genes' enhancers result in an increased expression of these genes in comparison to that in non-eutherian mammals, which may play a major role in determining the direction for axon growth in neocortical cells and the development of the corpus callosum.
This publication was supported by the Russian Science Foundation
grant No 22-14-00232.
