CC BY
4УДК 577.218
ПОИСК МИШЕНЕЙ NEUROD И ИХ ВКЛАД В НАВИГАЦИЮ АКСОНОВ МОЗОЛИСТОГО ТЕЛА
DOI
Гавриш М. С.1, Тутукова С. А.12, Бабаев А. А.1, Тарабыкин В. С.1,2
1 Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет имени Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород, Россия;
2 Институт клеточной биологии и нейробиологии клиники Шарите, Берлин, Германия
e-mail: mary_gavrish@mail.com
Аннотация. Слово комиссура происходит от латинского «commissura», что означает «соединять» или «связывать вместе», в частности, определяется как место соединения двух анатомических частей. В головном мозге насчитывается 5 комиссур, среди которых мозолистое тело (лат. corpus callosum) является самой большой, соединяя полушария между собой. Именно она содержит около 80% комиссуральных волокон всего головного мозга, основная функция которых заключается в обеспечении координации широкого круга задач, требующих прямой обработки и обмена информации между разными регионами коры. Мозолистое тело в большой степени отвечает за эффективность разных аспектов высшей нервной деятельности, включая функцию исполнения решений, социальное взаимодействие, память и язык.
Ключевые слова: мозолистое тело, транскрипционные факторы, кора головного мозга.
Частичное (гипогенезия) или полное (агенезия) отсутствие мозолистого тела может быть вызвано множеством определяющих факторов и присутствовать либо в чистом виде, либо в сочетании с другими врожденными синдромами.
В последние десятилетия было открыто более 70 мутаций у мышей, ведущих к нарушению формирования мозолистого тела, однако выраженное проявление, у моделей, содержащей ту или иную мутацию, возникают на поздних этапах развития комиссуры. Эти изменения представляют собой пороки развития различных струк-
тур средней линии и агенезию мозолистого тела, что часто является вторичным дефектом.
Использованная в нашем исследовании модель затрагивает нарушения формирования комиссуральных аксонов еще до достижения средней линии. К молекулам, вносящим вклад в раннюю регуляцию аксональной навигации и фасцикуляции, относят нескольких представителей семейства Neurod — Neurod1, Neurod2 и Neurod6. Семейство Neurod известно, как важнейший регулятор дифферен-цировки и спецификации клеток во время развития нервной системы.
У мышей с двойным нокаутом Neurod2/6 и тройным Neurod1/2/6 наблюдается полное отсутствие оформленного мозолистого тела, а комиссуральные аксоны хаотично разрастаются в испилатераль-ную кору. Однако, у тройных мутантов отсутствую и все остальные комиссуры.
Для идентификации молекул, находящихся под прямым контролем транскрипционных факторов Neurod, был выполнен транскрипционный анализ посредством которого мы выявили гены, чья экспрессия в коре мутантных животных была значительно изменена. Так как Neurod являются активаторами транскрипции, мы обратились к тем, чья экспрессия снижена.
В связи с этим, наш интерес был обращен к гену Kcnq3, чья роль ранее не рассматривалась в аспекте формирования мозолистого тела, а экспрессия в мутантных мышах снижается ~ на 90%. Кроме того, по опубликованным данным глубокого мРНК- секвенирова-ния в комбинации с ChIP-Seq (иммунопреципитация хроматина), выявлено, Kcnq3 может быть одной из прямых мишеней Neurod2.
Kcnq3 относится к семейству потенциалзависимых калиевых каналов, в функциональном состоянии образующий тетрамеры идентичных (гомомер, только Kcnq3) или совместимых (гетеромер, совместно с Kcnq2) субъединиц.
Значительное снижение экспрессии Kcnq3 на е15.5 в мутантных Neurod2/6 и Neurod1/2/6 мышах было подтверждено гибридизацией in situ. А так же было выявлено анатомическое расположение экспрессии Kcnq3 в ткани мозга мутантов и контрольных эмбрионов. На этой стадии эмбрионального развития в мозге мышей дикого типа, начинается увеличение экспрессии Kcnq3 и достигает своего пика к е18.5.
Для установления роли Kcnq3 в формировании мозолистого тела был проведен нокаут с применением технологии CRISPR/
Cas9. Генетический конструкт был электропорирован in utero на е13.5 в неокортекс эмбрионов мышей линии C57bl/6. На е18.5 было продемонстрировано, что аксоны, в отсутствии упомянутого калиевого канала, дефасцикулируют и останавливаются в росте по направлению к средней линии. По-видимому, Kcnq3 необходим для правильной навигации аксонов мозолистого тела и его формирования.
Потенциально, восстановление экспрессии идентифицированных генов-мишеней может частично или полностью восстановить рост аксонов мозолистого тела мутантных мышей. В следующем эксперименте, мы планируем восстановить экспрессию Kcnq3 в кортексе мутнатных эмбринов Neurod.
В заключение стоит отметить, что идентификация генов-мишеней Neurod и регулируемых ими каскадов, позволит понять процессы, лежащие в основе формирования мозолистого тела, что послужит фундаментом для создания новых методов пренатальной диагностики и терапии синдрома агенезии мозолистого тела.
Публикация поддержана грантом РНФ № 22-14-00232.
SEARCH FOR NEUROD TARGETS AND THEIR ROLE IN CORPUS CALLOSUM AXONAL NAVIGATION
Gavrish M. S.1, Tutukova S. A.12, Babaev A. A.1, TarabykinV.S.12
1 Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod, Nizhny Novgorod, Russia;
2 Institute of Cell Biology and Neurobiology, Charite Hospital, Berlin, Germany
Abstract. The word commissure comes from the latin «commissura», which means «to connect» or «to bind together», in particular, is defined as the junction of two anatomical parts. There are 5 commissures in the brain, among which the corpus callosum (lat. corpus callosum) is the largest, connecting the hemispheres with each other. It contains about 80% of the commissural filaments of the entire brain, whose main function is to ensure the coordination of a wide range of tasks that require direct processing and exchange of information between different regions of the cortex. The corpus callosum is largely responsible for the efficiency of various aspects of neural activity, including decision making, social interaction, memory, and language.
Key words: corpus callosum, transcription factors, cerebral cortex.
Partial (hypogenesis) or complete (agenesis) absence of the corpus callosum can be caused by a wide series of factors and may exist by themselves or along with other congenital syndromes.
In recent decades, more than 70 mutations have been identified in mice associated with disruptions in the formation of the corpus callosum, however, in models, having one or other mutations, they appear duringlate development of the commissure. These can be identified as malformations of various midline structures and corpus callosum agenesis, which is often a secondary defect.
The model used in our study can detect abnormalities in the formation of commissural axons even before them reaching the midline. Molecules that contribute to the early regulation of axonal navigation and fasciculations include several members of the Neurod family, Neurod1, Neurod2, and Neurod6. The Neurod family is known as an important cell differentiation regulator during nervous system development.
Mice with double Neurod2/6 and triple Neurod1/2/6 knockout show a complete absence of corpus callosum, and commissural axons proliferate chaotically into the ispilateral cortex. However, triple mutants also lack all of other commissures.
To identify molecules under the direct control of Neurod transcription factors, transcriptional analysis was performed to detect genes whose expression in the cortex of mutant animals was significantly altered. Since Neurods are transcription activators, we looked at those whose expression was reduced.
Because of this, we focused in the Kcnq3 gene, whose role had not previously been considered in terms of the formation of the corpus callosum, and whose expression in mutant mice was decreased by ~90%. In addition, according to the published data of deep mRNA sequencing with ChIP-Seq (chromatin immunoprecipitation), Kcnq3 may be one of the direct targets of Neurod2.
Kcnq3 belongs to the family of voltage-gated potassium channels, functionally forming tetramers of identical (homomer, only Kcnq3) or compatible (heteromer, combination with Kcnq2) subunits.
A significant decrease in Kcnq3 expression by e15.5 in Neurod2/6 and Neurod1/2/6 mutant mice was confirmed by in situ hybridization. The anatomical location of Kcnq3 expression was also revealed in brain tissues in both mutants, and control embryos. At this stage of embryonic development in the brain of wild-type mice, an increase in Kcnq3 expression begins and its peak is reached at e18.5.
To detect Kcnq3 function in corpus callosum formation, a knockout
was performed using CRISPR/Cas9 technology. A genetic construct was electroporated in utero at e13.5 into the neocortex of C57bl/6 mouse embryos. At e18.5, it was demonstrated that axons, in the absence of the previous mentioned potassium channel, defasciculate and stop growing along the spatial midline. Apparently, Kcnq3 is required for the correct navigation of axons of the corpus callosum and its formation.
Potentially, restoration of the expression of the identified target genes could partially or completely restore the growth of axons of the corpus callosum in mutant mice. In following experiments, we will attempt to restore Kcnq3 expression in the cortex of mutated Neurod embryos.
In conclusion, it should be noted that the identification of Neurod's target genes and the cascades regulated by it makes it possible to understand the processes underlying the formation of the corpus callosum, which will serve as the foundation for the creation of new methods for prenatal diagnosis and therapy of corpus callosum agenesis syndrome.
This publication was supported by the Russian Science Foundation
grant No 22-14-00232.
