CC BY
30СПОРТИВНАЯ МЕДИЦИНА И ЛЕЧЕБНАЯ ФИЗИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА
ВОЗДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА БИОПЛЕНКИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ
IMPACT OF VARIOUS CHEMICAL AND BIOLOGICAL FACTORS ON BIOFILMS OF OPPORTUNISTIC MICROORGANISMS
Чекулаев Михаил Владимирович
студент 4 курса химического факультета Самарский национальный исследовательский университет
имени академика С.П. Королева г. Самара, Россия Chekulaev Mikhail Vladimirovich student of the 4th course, faculty of chemistry, Samara national research university of a name of the academician S.P. Korolev
Samara, Russia
Аннотация. В настоящей работе установлено влияние различных химических и биологических факторов на рост и развитие биопленок патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Проведено экспериментальное сравнение наиболее распространенных в настоящее время антибактериальных и муколитических препаратов, таких как антисине-гнойный бактериофаг и «Дорназа альфа» на колонии Pseudomonas aeruginosa мукоидного и немукоидного штамма.
Abstract. Influence of various chemical and biological factors on growth and development of biofilms of pathogenic and opportunistic microorganisms is established. Experimental comparison of antibacterial and mucolytic drugs most widespread now, such as anti-pyocyanic bacteriophage and "Dornaza alpha" on colony of Pseudomonas aeruginosa of a mucoid and not mucoid strain is carried out.
Ключевые слова: патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, Pseudomonas aeruginosa, биопленки, бактериофаги, муколити-ческие препараты.
Keywords: pathogenic and opportunistic microorganisms, Pseudomonas aeruginosa, biofilms, bacteriophages, mucolytic drugs.
Введение
Вплоть до конца прошлого века микробиология развивалась главным образом на основе исследований чистых культур микроорганизмов. В конце ХХ века сформировалось представление об особой форме организации микрофлоры организма человека — хорошо организованном взаимодействующем сообществе микроорганизмов, покрывающих поверхности кишечной стенки, других слизистых оболочек, кожи и зубов человека. На сегодняшний день известно,
что большинство бактерий существуют в природе не в виде свободно плавающих клеток, а в виде специфически организованных биопленок (Biofilms). Причем сами бактерии составляют лишь 5-35% массы биопленки, остальная часть — это межбактериальный матрикс. Такая форма существования предоставляет бактериям массу преимуществ в условиях воздействия неблагоприятных факторов внешней среды и организма-хозяина. «Микрофлора биопленки более устойчива к воздействию неблагоприятных факторов физической, химической и биологической природы по сравнению со свободно плавающими бактериями — они оказались очень устойчивы к воздействию ультрафиолетового излучения, дегидратации и вирусам, антибиотикам и факторам иммунной защиты» [1, с. 217].
В природе биопленки распространены повсеместно. Формирование биопленок отмечено у большинства бактерий в природных, клинических и промышленных условиях. «Они образуются в условиях текучести на границе двух средовых фаз (жидкость — жидкость, жидкость — воздух и т. д.)» [2, с. 89]. Биопленки обнаруживаются на твердых субстратах, погруженных в водный раствор, а также могут создавать плавающие маты на жидких поверхностях. Классическим примером биопленки может служить тонкое наслоение на скалах, находящихся посреди течения. «При достаточных ресурсах для роста биопленки быстро растут до макроскопических размеров» [3, с. 96]. «В биопленках может содержаться множество различных видов микроорганизмов, например, бактерии, простейшие, грибы и водоросли, каждый из группы выполняет специализированные метаболические функции» [4 с. 91]. «Watnick P. и Kolter R. справедливо называют биопленки городами микробов» [1, с. 217].
«Биопленка — сообщество микробов, которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ, имеют измененный фенотип» [6, с. 246]. Это определение позволяет отличить микробные сообщества биопленок от похожих на них лишь внешне структур, например, колонии бактерий, растущих на поверхности агара, которые не проявляют ни одной из характеристик, свойственных истинной биопленке. Важно отметить, что бактерии, включенные в матрикс фрагментов, которые отрываются от биопленок на колонизированном медицинском устройстве и циркулируют в жидкостях тела, устойчиво проявляют все фенотипические характеристики исходной биопленки.
К настоящему времени достоверно доказана роль микробных биопленок в возникновении и развитии многих инфекционных заболеваний.
Бактерии в биопленках имеют повышенную толерантность к таким факторам, как агрессивные вещества, факторы иммунной защиты и антибиотики. «Бактерии и грибы в биопленках выживают
в присутствии антибиотиков, в частности, биопленки оказались способными выдерживать концентрации антибиотиков в 100-1000 раз больше терапевтических дозировок, подавляющих одиночные бактериальные клетки» [7, с. 138]. Поскольку свободные бактериальные клетки хуже защищены, чем биопленки, то антибиотик, высокоактивный in vitro при тестировании в чистой культуре, при испытаниях in vivo (когда преобладает фенотип биопленок) может оказаться неэффективным. В этой связи одной из основных проблем практической медицины становится проблема лечения заболеваний микробного происхождения, в тех случаях, когда чувствительность к антибиотикам микроорганизмов, ассоциированных в биопленку, не соответствует таковой, определенной в лабораторных тестах на клинических изолятах чистых культур бактерий. В связи с этим в последние годы идет активное изучение действия антибиотиков на биопленки бактерий, вызывающих патологические процессы различной локализации.
Считается доказанным, что биопленка повышает вирулентность и патогенность всех возбудителей. «Подсчитано, что частота инфек -ций, обусловленных биопленкой, особенно в развитых странах мира, составляет 65%-80%» [7, с. 138]. Многие патогены, такие как E. coli, Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Listeria spp., Campylobacter spp., существуют в форме биопленки на поверхности пищевых продуктов или на поверхности оборудования для их хранения. «Кроме того, патогенные бактерии, такие как Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., E. coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp., как правило, растут на катетерах, искусственных суставах, механических клапанах сердца и т.д.» [4, с. 91]. Активность биопленки была зарегистрирована при таких инфекциях, как кариес зубов, кистозный фиброз, инфекции мочевых путей, эндокардит, отит, глазные и раневые инфекции.
Таким образом, лечение хронических инфекций в настоящее время уже не может основываться на традиционной концепции микробиологии. Новые представления о биопленках требуют изменения подходов к диагностике и лечению инфекций в самых различных областях медицины.
Отсюда следует предположение, что возможны ингибирующие свойства синегнойного бактериофага и муколитика «Дорназа альфа» против биопленок Pseudomonas aeruginosa.
Экспериментальная часть
В экспериментах по влиянию различных химических и биологических факторов на биопленки Pseudomonas aeruginosa были использованы мукоидный и немукоидный штаммы ранее указанного вида микроорганизмов; муколитик «Дорназа альфа» и синегнойный бактериофаг.
Опыты заключались в воздействии на биопленки и на
планктонную форму Pseudomonas aeruginosa муколитиком «Дорназа альфа» и синегнойным бактериофагом; исследовании степени развития биопленки от используемого препарата и времени его действия.
Эксперимент №1
Первый эксперимент позволил определить действие синегной-ного бактериофага на мукоидный штамм Pseudomonas aeruginosa. Опыт проводился следующим образом:
1. Выделяется чистая культура Pseudomonas aeruginosa мукоид-ного штамма и культивируется на плотной питательной среде в чашке Петри.
2. Готовится суспензия бактерий в мясопептонном бульоне (МПБ).
3. В каждую лунку планшета для иммуноферментного анализа (ИФА) разливается по 150 мкл суспензии.
4. Два ряда (А, В) планшета для иммуноферментного анализа являются контрольными; так как никакие препараты не добавляются в лунки данных рядов на протяжении всего эксперимента.
5. В лунки одного ряда (G) сразу вместе с суспензией бактерий добавляется раствор, содержащий синегнойный бактериофаг, объемом 10 мкл в каждую лунку.
6. В лунки одного ряда (C) сразу вместе с суспензией бактерий добавляется раствор, содержащий синегнойный бактериофаг, объемом 20 мкл в каждую лунку.
7. Планшет помещается в термостат на 24 часа при t° = 37°С.
8. Через 24 часа культивирования в один ряд (D) добавляется раствор, содержащий синегнойный бактериофаг, объемом 10 мкл в каждую лунку.
9. Планшет помещается в термостат на 24 часа при t° = 37°С.
10. Жидкая фаза содержимого каждой лунки удаляется (все ряды).
11. Каждая лунка планшета (все ряды) заполняется красителем -раствором Люголя на 45 мин.
12. Через 45 мин. Краситель удаляется из каждой лунки (все ряды).
13. Каждая лунка троекратно промывается буферным раствором (все ряды).
14. Каждая лунка планшета (все ряды) заполняется этанолом (C2H5OH), выдерживается 45 мин.
15. С помощью фотоколориметра измеряется оптическая плотность содержимого каждой лунки.
16. Вычисляется среднее арифметическое значение оптической плотности по ряду.
Результаты исследования интерпретируются следующим образом:
В бактериальной суспензии бактерии пребывают в планктонной форме. При культивировании в мясопептонном бульоне в течение 24 часа образуются биопленки (если отсутствует или мало эффективен ингибирующий фактор). При дальнейшем культивировании биопленки либо развиваются (при отсутствии или малой эффективности ингибирующего фактора), либо разрушаются (под действием эффективных ингибирующих факторов).
После удаления жидкой фазы содержимого в каждой лунке остается только биопленка (если она образовалась).
При обработке красителем - раствором Люголя - биопленки поглощают красящее вещество и приобретают окраску. Непоглощенный краситель удаляется из лунок. Для большей чистоты лунки промываются буферным раствором, который не обесцвечивает биопленки.
При заполнении лунок этанолом (C2H5OH) краситель экстрагируется (т.е. в лунках образуется спиртовой раствор красителя).
Чем выше уровень развития биопленки, тем больше красителя она может поглотить, следовательно, и выделить при обработке этанолом. Чем больше выделяется красителя в одинаковый объем этанола, тем выше концентрация красителя, и тем выше его оптическая плотность.
Таким образом, степень развития биопленки прямо пропорциональна оптической плотности спиртового раствора данной лунки планшета.
Эффективность данного химического или биологического фак -тора обратно пропорциональна среднему значению оптической плотности по данному ряду.
Эксперимент №2
Второй эксперимент позволяет определить действие муколитика «Дорназа альфа» на мукоидный штамм Pseudomonas aeruginosa. Опыт проводился следующим образом:
1. Выделяется чистая культура Pseudomonas aeruginosa мукоид-ного штамма и культивируется на плотной питательной среде в чашке Петри.
2. Готовится суспензия бактерий в мясопептонном бульоне (МПБ).
3. В каждую лунку планшета для иммуноферментного анализа (ИФА) разливается по 150 мкл суспензии.
4. Два ряда (А, В) планшета для иммуноферментного анализа являются контрольными; так как никакие препараты не добавляются в лунки данных рядов на протяжении всего эксперимента.
5. В лунки одного ряда (E) сразу вместе с суспензией бактерий добавляется 0,1 мл препарата «Дорназа альфа».
6. В лунки одного ряда (H) сразу вместе с суспензией бактерий добавляется 0,2 мл препарата «Дорназа альфа».
7. Планшет помещается в термостат на 24 часа при ^ = 37°С.
8. Через 24 часа культивирования в один ряд добавляется 0,1 мл препарата «Дорназа альфа».
9. Планшет помещается в термостат на 24 часа при ^ = 37°С.
10. Жидкая фаза содержимого каждой лунки удаляется (все ряды).
11. Каждая лунка планшета (все ряды) заполняется красителем -раствором Люголя на 45 мин.
12. Через 45 мин. Краситель удаляется из каждой лунки (все ряды).
13.Каждая лунка троекратно промывается буферным раствором (все ряды).
14. Каждая лунка планшета (все ряды) заполняется этанолом (С2Н5ОН), выдерживается 45 мин.
15. С помощью фотоколориметра измеряется оптическая плотность содержимого каждой лунки.
16. Вычисляется среднее арифметическое значение оптической плотности по ряду.
Интерпретация результатов эксперимента №2 проводится аналогично интерпретации результатов эксперимента №1.
Результаты экспериментов №1 №2 представлены в таблице 1.
Таблица 1
Результаты экспериментов №1 №2 _
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 средн.
A 2,102 2,122 2,082 2,104 2,144 2,121 2,154 2,123 2,164 2,099 2,144 2,091 2,121
B 2,104 2,089 2,117 2,028 2,293 1,988 2,145 1,957 2,087 1,957 2,177 2,068 2,084
C 0,651 0,290 0,508 0,368 0,302 0,706 0,415 2,063 0,209 0,213 0,244 0,559 0,544
D 2,069 1,985 2,038 2,062 2,050 2,067 2,122 2,108 1,916 1,949 2,064 2,065 2,041
E 2,153 2,040 2,106 2,069 2,098 2,062 2,019 2,094 2,070 2,038 2,046 2,045 2,070
F 2,086 1,346 1,753 0,966 1,911 2,001 1,482 1,711 1,364 1,643 1,610 2,063 1,661
G 0,662 0,839 1,066 0,956 1,033 0,909 0,745 0,729 0,511 0,737 0,881 1,132 0,850
H 1,837 1,863 1,940 2,028 2,038 1,630 2,007 2,021 1,713 2,000 2,078 1,288 1,870
Эксперимент №3
Третий эксперимент позволяет определить действие синегной-ного бактериофага на немукоидный штамм Pseudomonas aeruginosa. Опыт проводился по методике, полностью аналогичной методике эксперимента №1. (Вместо мукоидного штамма Pseudomonas aeruginosa опыты проводятся с немукоидным штаммом Pseudomonas aeruginosa).
Интерпретация результатов эксперимента №3 аналогична таковой предыдущих опытов.
Эксперимент №4
Четвертый эксперимент позволяет определить действие препарата «Дорназа альфа» на немукоидный штамм Pseudomonas aeruginosa. Опыт проводился по методике, полностью аналогичной методике эксперимента №2. (Вместо мукоидного штамма Pseudomonas aeruginosa исследования проводятся с немукоидным штаммом Pseudomonas aeruginosa).
Интерпретация результатов эксперимента №4 аналогична таковой предыдущих опытов.
Результаты экспериментов №3 и №4 представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты экспериментов №3 и №4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 средн.
A 1,995 2,145 2,105 2,123 2,077 2,053 2,066 2,069 2,114 2,102 2,145 2,11 2 2,092167
B 2,074 0,775 2,086 2,109 2,097 2,142 2,108 2,111 2,131 2,085 2,119 2,08 7 1,993667
C 1,941 2,555 2,105 2,242 1,504 0,918 0,292 0,487 0,568 0,447 1,289 0,79 0 1,2615
D 2,147 2,137 2,054 2,105 2,176 1,604 2,124 2,152 2,124 2,104 2,073 2,11 4 2,076167
E 2,058 2,047 2,084 2,062 2,039 2,109 2,040 2,113 2,020 2,068 2,078 1,93 4 2,054333
F 2,188 1,946 2,065 2,03 1,906 2,006 2,021 1,982 2,077 2,031 2,095 2,05 2 2,03325
G 0,918 0,469 0,466 0,441 0,456 0,458 1,723 0,308 0,501 0,484 0,430 0,49 8 0,596
H 1,187 1,817 2,003 2,049 2,064 1,889 1,867 2,054 0,712 2,031 1,937 2,07 5 1,807083
Результаты всех проведенных экспериментов наглядно представлены в виде следующей сводной таблицы (таблица 3) и диаграммы (рис. 1).
Таблица 3
Ps. aeruginosa мук. штамма Ps. aeruginosa немук. штамма
1-контроль-Pseudomonas aeruginosa 2,1208 2,0922
2-контроль-Pseudomonas aeruginosa 2,0842 1,9937
3-Ps. aeruginosa+БФ 20мкл-0ч 0,5440 0,5960
4-Ps. aeruginosa+БФ 10мкл-24ч 2,0413 2,0762
5^. aeгuginosa+Пульм 0,1мл-0ч 2,0700 2,0543
6-Рб. aeгuginosa+Пульм 0,1мл-24ч 1,6613 2,0333
7^. aeгuginosa+БФ 10мкл-0ч 0,8500 1,2615
8^. aeгuginosa+Пульм 0,2мл-0ч 1,8703 1,8071
Рис. 1. Диаграмма влияния различных химических и биологических факторов на степень формирования биопленок
Выводы:
1. Бактериофаг, внесенный в лунки до образования биопленок (т. е. сразу) очень эффективен в отношении обоих штаммов. При этом внесение бактериофага в большем количестве (20 мкл) в 1,5-2,5 раза эффективнее, чем использование меньших количеств (10 мкл).
2. Бактериофаг, внесенный через 24 ч (т.е. после образования биопленки) практически не оказывает никакого действия.
3. Препарат «Дорназа альфа» в количестве 0,2мл в 1 лунку при внесении сразу в малой степени эффективен в отношении обоих штаммов.
4. Препарат «Дорназа альфа», внесенный сразу в количестве 0,1мл в лунку практически неэффективен.
5. Препарат «Дорназа альфа», внесенный в лунки в количестве 0,1 мл в лунку через 24 ч. (т.е. после образования биопленки), в достаточной степени эффективен только в отношении мукоидного штамма, но практически неэффективен в отношении немукоидного.
Таким образом, на планктонную форму Pseudomonas aeruginosa бактериофаг оказывает ингибирующее действие, а на образовавшиеся биопленки наиболее эффективное действие оказывает препарат «Дорназа альфа».
Литература
1. Амелина Е. Л., Анаев Э. Х., Красовский С. А. и др. Мукоактивная терапия / Под ред. А. Г. Чучалина, А. С. Белевского. - М. : ИД «Атмосфера», 2006. - С. 217.
2. Капранов Н. И., Гембицкая Т. Е., Симонова О. И. и др. Опыт длительного применения нового муколитического препарата Пульмозим у больных муковисцидозом // Терапевтический архив. - 2001. - № 1. - С. 89.
3. Пухальский А. Л., Шмарина Г. В. Особенности воспаления при муковисцидозе - мифы и реальность. Сборник статей и тезисов национального конгресса по муковисцидозу. - Воронеж. 2005. - С. 96.
4. Волков И. К., Давыдова И. В., Куличихин В. Г., Симонова О. И. и др. Эффективность дорназы альфа (Пульмозима) у детей с хроническими заболеваниями легких // Пульмонология. - 2003. - № 3. - С. 91.
5. Воронкова А. Ю. Клиническая эффективность и безопасность дорназы альфа в лечении бронхолегочного процесса у детей, больных муковисцидозом. - Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 2004. - С. 34.
6. Орлов А. В. Эффективность применения препарата Пульмозим у больных муковисцидозом при кратности ингаляций 1 раз в неделю. Сборник статей и тезисов 61-го национального конгресса по муковисцидозу. - М., 2003. - С. 246.
7. Отец В. В. Бактериальные сообщества. В кн.: Клеточные сообщества / под ред. В. Терца. - Санкт-Петербург: Изд-во СПб ГМУ, 1998. - С. 138.
References
1. Amelina E. L., Anayev E. H., Krasovsky S. A., etc. Mukoaktivnaya terapiya [Mucoactive therapy]. Moscow, IDES "Atmosphere" Publ., 2006, 217 p.
2. Kapranov N. I., Gembitskaya T. E., Simonova O. I., etc. Opyt dlitel'nogo primeneniya novogo mukoliticheskogo preparata Pul'mozim u bol'nyh mukoviscidozom [Experience of prolonged use of the new mucolytic drug Pulmozim at patients with a mucoviscidosis]. Terapevticheskij arhiv -Therapeutic archive, 2001, no. 1, 89 p.
3. Pukhalsky A. L., Shmarina G. V. Osobennosti vospaleniya pri mukoviscidoze - mify i real'nost'. Sbornik statej i tezisov nacional'nogo kongressa po mukoviscidozu [Features of inflammation at a mucoviscidosis -
myths and reality. The collection of articles and theses of the national congress on a mucoviscidosis]. Voronezh, 2005, 96 p.
4. Volkov I. K., Davydova I. V., Kulichikhin V. G., Simonova O. I., etc. Effektivnost' dornazy al'fa (Pul'mozima) u detej s hronicheskimi zabolevaniyami legkih [Efficiency of a dornaza an alpha (Pulmozim) at children with chronic diseases of lungs]. Pul'monologiya - Pulmonology, 2003, no. 3, 91 p.
5. Voronkova A. Yu. Klinicheskaya effektivnost' i bezopasnost' dornazy al'fa v lechenii bronholegochnogo processa u detej, bol'nyh mukoviscidozom. Avtoref. dis. kand. med. nauk [Clinical performance and safety of a dornaza alpha in treatment of bronchopulmonary process at the children sick with a mucoviscidosis. Abctract diss. cand. med. sci.]. Moscow, 2004, 34 p.
6. Orlov A. V. Effektivnost' primeneniya preparata Pul'mozim u bol'nyh mukoviscidozom pri kratnosti ingalyacij 1 raz v nedelyu. Sbornik statej i tezisov 6-go nacional'nogo kongressa po mukoviscidozu [Efficiency of use of the drug Pulmozim for patients with a mucoviscidosis at frequency rate of inhalations once a week. The collection of articles and theses 6 - go the national congress on a mucoviscidosis]. Moscow, 2003, 246 p.
7. Otets V. V. Bakterial'nye soobshchestva. V kn.: Kletochnye soobshchestva [Bacterial communities. In prince: Cellular communities]. St. Petersburg, SPb of GMU Publ., 1998, 138 p.
